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DB32DetectionmethodforVibrioparahaemolyticusinaquaticbyreal-timefluorescrecombinase-aidamplificat江苏省市场监督管理局发布I市产品质量监督检验研究院、广东省科学院微生物研究所、杭州傲敏生物1水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导本文件规定了水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增（recombinase-aidAmplification，RAA）法的试剂材料、仪器设备、检测程序、操作步骤、结果判定和报告、检出限及防止污染措施。GB4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌GB/T27403实验室质量控制规范食品分重组酶介导链替换核酸扩增recombinase-aidAmplific37℃~42℃),进行核酸扩增的技术。RAA法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程。根据副溶血性弧除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA2根据副溶血性弧菌的特异性基因序列设计探TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACAGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCTTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTC[FAM-dT]A[BHQ-dT]ACAACCACACGAa)荧光检测仪：带有恒温（39℃±1℃)扩增功能的荧光检测仪。100μL～1000μL，并配备与移液器匹配的吸头。副溶血性弧菌实时荧光RAA检测程序见图1。38.2细菌模板DNA的制备使用商品化DNA提取试剂盒，吸取适量获得的增菌液，按其说明8.2.2.1吸取10.1获得的增菌液1mL菌液加入1.5mL离心管中，10000g离心1min,弃上清。8.2.2.2加入1mL无菌水，充分悬浮沉淀，10000g离心1min,弃上清；8.2.2.3加入100μL无菌水混匀后沸水浴(或95℃金属浴)10min,置冰上冷却；8.2.2.410000g离心1min,上清液即为模板DNA。4体积(µL）12.5µL2.1µL2.1µL0.6µL4.0µL26.2µL2.5µL50µL（2）将除MgAc2和模板DNA以外的所有成分涡旋混匀，分装混合液至含有冻干酶制剂的200µL反应管中，轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心，打开反应单元，向每个反应），将反应管置于荧光检测仪中，39℃恒温，30min。在反应过程中实时监测荧光信号。检测过程中分别设阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以无菌水替代模板DNA；阴性对照以非副溶血性弧菌标准菌株DNA作为模板DNA；阳性对照以副溶血性空白对照在30min内无扩增曲线；

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