DB63T 2538-2026 普氏原羚个体识别分子技术规程

ICS65.020.99DB63CCSB65青海省地方标准DB63/T2538—2026普氏原羚个体识别分子技术规程2026-05-07发布2026-07-01实施青海省市场监督管理局发布DB63/T2538—2026前言本文件按照GB/T1.1—《标准化工作导则部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由青海省林业和草原标准化技术委员会提出。本文件由青海省林业和草原局归口。本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省国家公园科研监测评估中心。姚占山、江峰、顾海峰、李斌、梁程博、张萌、郭凡、陈晓苑、王佳能。本文件由青海省林业和草原局监督实施。IIDB63/T2538—2026普氏原羚个体识别分子技术规程1范围操作程序等技术要求。本文件适用于普氏原羚个体识别。2规范性引用文件文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T43650野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程SF/T0134法医学生物检材核酸提取技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。DNADNA微卫星标记普氏原羚的多个特定的基本重复单元为碱基的微卫星序列，其多态性用于普氏原羚个体识别。微卫星基因分型对DNA样品进行微卫星位点PCR扩增后，利用毛细管电泳技术测定生物样本基因型。个体识别采用微卫星标记技术，对同一时间或不同时间，某一区域或多个区域的两个或多个DNA样品是否来源于同一个体进行判定。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosideTriphosphates）DTT：二硫苏糖醇（Dithiothreitol）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic）1DB63/T2538—2026OD：光密度（OpticalDensity）PBS：磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferedSaline）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）SDS：十二烷基磺酸钠（SodiumDodecylSulfonate）TaqDNA聚合酶（Taq-DNAPolymerase）TE：含乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-EDTABufferSolution）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）5主要仪器设备及试剂主要仪器设备及试剂见附录AGB/T6682要求。6溶液配方见附录。7操作程序取样与储存取样与储存样本按照GB/T43650执行。DNA样品提取与检测根据检测样本类型，基因组DNA提取按照执行或选择对应的商用试剂盒。使用微量分光光度计对每个DNA样品进行质量检测，OD260/OD280值在1.72.1ng/μLDNA样品判定为合格。DNA样品保存一个月内使用的DNA样品保存于4℃冰箱，长期保存的DNA样品保存于-80℃超低温冰箱。微卫星标记宜选取附录中PR-6PR-14PR-25PR-30PR-40PR-65和PR-71等79个微卫星标记进行普氏原羚个体识别。微卫星标记PCR7.5.1微卫星标记引物合成与荧光标记根据附录的微卫星标记的引物序列合成引物，并对正向引物的5’端进行荧光标记。操作过程应避光。7.5.2PCR选用Taq酶进行微卫星扩增，反应体系见附录，表D.1。2DB63/T2538—20267.5.3PCRDNA样品的微卫星位点扩增在PCRPCR℃预变性5min℃变性30s退火温度退火30s℃延伸30s94℃变性30s℃退火30s℃延伸30s置35个循环反应；℃修复延伸8min。7.5.4PCR最适退火温度12对微卫星引物最适退火温度见附录，表D.2。PCR产物检测PCR扩增完成后，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳方法见附录。电泳条带清晰、长度与附录PCR产物避光存放于4泳检测，进行基因分型。微卫星基因分型7.7.1毛细管电泳检测符合微卫星基因分型要求的PCR入取整得到微卫星扩增长度数值。7.7.2电泳结果人工校对获取的微卫星长度数值减去附录参考长度最小值的差除以4进行人工校正：a)余数为0，该微卫星长度为有效基因型；b)余数为1，该微卫星长度数值减1后为有效基因型；c)余数为2，重新进行微卫星标记PCR和微卫星基因分型；d)余数为3，该微卫星长度数值加1后为有效基因型。8个体识别对微卫星位点的分型数据进行个体识别判定：a)当两个或两个以上的检测样品微卫星标记分型结果一致时，判定来自同一个体；b)当两个样品的微卫星标记分型结果中只有1个基因型差异时，判定来自同一个体；c)当两个样品的微卫星标记分型结果中有2个及以上基因型结果不同时，判定来自不同个体。3DB63/T2538—2026附录A（规范性）主要仪器设备及试剂A.1主要仪器设备冷冻研磨机、-20℃冰箱、PCR泳系统、凝胶成像系统、毛细管电泳系统。A.2主要试剂Chelex-100DTTSDSEDTATNE缓冲液、TESmol/L（pH10.075%TE缓冲液、3NaCl溶液、吸附液、硅珠悬液（富含二氧化硅微粒）、漂洗液、SE缓冲液、5mol/LNaClTAE100%6料、Taq酶、dNTP50～500bpDNAmarkerPBS缓冲液。4DB63/T2538—2026附录B（资料性）溶液配方B.1细胞裂解缓冲液0.64mol/L蔗糖，0.01mol/LMgCl2，0.02mol/LTris-HCl（pH7.6），2%TritonX-100。B.2TE缓冲液10mmol/LTris-HClpH7.5），1mmol/LEDTA（pH8.0）。B.3TNE缓冲液10mmol/LTris-HClpH7.5），5mmol/LEDTA（pH8.0），100mol/LNaCl。B.4TES裂解液10mmol/LTris-HClpH8.0），mmol/LNaCl，mmol/LEDTA（），0.1%SDS。B.5吸附液12gGuSCN，10mL0.1mol/LTris-HClpH6.4），0.80.5mol/LEDTA，0.5TritonX-100。B.6漂洗液12gGuSCN100.1mol/LTris-HCl（pH6.4B.7SE缓冲液25mmol/L，NaCl。B.8缓冲液Tris碱242g和冰醋酸57.1，用纯水定容到1L。B.96×电泳上样缓冲液EDTA8.7672gFF0.50.5gmlpH至7.0纯水定容至1。B.10PBS缓冲液8gNaCl0.2gKCl1.44gNaHPO0.24gKH溶于纯水中，1mol/LlpH7.4）2424定容至1。5DB63/T2538—2026附录C（规范性）普氏原羚个体识别微卫星标记信息表普氏原羚个体识别微卫星标记信息表见表C.1。表C.1普氏原羚个体识别微卫星标记信息表序号标记/引物名称引物序列5’-3’核心序列参考长度（bp）正向引物：AGCTAGACCCTAAATCCTTGTGT反向引物：ACTCCTCTCACGTCTTCAGC正向引物：ACTTGGGGAAATCTCAAAAGTCT反向引物：GGCAAAAGCCTTAGAGAAATGC正向引物：AGATGAACTGCTCTGGGAAG反向引物：AATGGGAAAGTATGAAAGGCA正向引物：CCAAGAGTGAAGTTGTGCCA反向引物：AACCAAGTGCTCTGTTTCAG正向引物：ATTCTCTCGGGCCATCTGTG反向引物：CACTGCTGGAATGGTCAAGG正向引物：CCGTTCTCCAGGGGAATCTT反向引物：TTCACAGGGCCTTCAGAAAC正向引物：CTCTGTCCTCCGCTGTCTC反向引物：CAAATTGCCTTGTCCCTGCC正向引物：TCCCTGATCTGTAACAAATGTG反向引物：CCTTAGCGTCACACACACAG正向引物：CAGAGTCGGTCATGATGGGA反向引物：TGCTTCCGACCAAGTGTTTG正向引物：GGCAAGTGAGGTGATGAAGC反向引物：TGGCCTTCTAGAGTTGTTTTGC正向引物：TTTGCTGCCTCGACAAACAG反向引物：TCCCGCATTACAAGCAGATTC正向引物：GTTCCAAGCTAAGCATTTAAGGC反向引物：GGGAACACATGTACACCCGT1PR-621224823PR-8PR-14PR-25PR-30PR-40PR-46PR-53PR-58PR-65PR-71PR-85(AAAG)n(TATG)n(AGGA)n(AGGA)n(AGGA)n(AAAG)n(TCCA)n1602121722321622101642481742261742581641881872311462261862542242564567891011126DB63/T2538—2026附录D（规范性）PCRD.1PCR12个微卫星标记PCR体系见表D.1。表D.112个微卫星标记PCR体系（20L）序号试剂DNA样品浓度用量（L）12345672ng/μL～ng/μL2正向引物10mol/L1.01.02.02.00.211.3反向引物10mol/LdNTPs10mmol/L（各2.5mmol/L）PCR缓冲液（含MgCl2）Taq酶105U/μL-超纯水D.212对微卫星引物PCR最适退火温度12对微卫星引物PCR最适退火温度见表D.2。表D.212对微卫星引物PCR最适退火温度序号1引物名称PR-6最适退火温度（℃）6060606360606057606060602PR-83PR-14PR-25PR-30PR-40PR-46PR-53PR-58PR-65PR-71PR-854567891011127DB63/T2538—2026附录E（资料性）琼脂糖凝胶电泳检测方法E.1配制