水泡性口炎诊断技术

1

水疱性口炎诊断技术

1范围

本文件规定了水疱性口炎的临床诊断、样品采集与处理，以及病毒分离与鉴定、RT-PCR方法、实时荧光RT-PCR方法、抗体阻断酶联免疫吸附试验等实验室诊断方法的相关技术要求，以及相应的综合判定原则。

本文件适用于水疱性口炎的诊断、检疫、监测和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GBl9489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BP：阻断百分比（Blockingpercentage）

COCV：可可尔型水疱性口炎病毒（CocalVesiculovirus）

CPE：细胞病变效应（CytopathicEffect）

Ct：循环阈值（CycleThreshold）

DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate）

EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiaminetetraaceticAcid）

ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay）

GP：糖蛋白（Glycoprotein）

HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）

McAb：单克隆抗体（MonoclonalAntibody）

NP：核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein）

2

OD：光密度值（OpticalDensity）

OP液：食道咽喉部分泌物（Oesophageal-pharyngealfluids）

PBS：磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferSaline）

RT-PCR：反转录聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）

SPF：无特定病原体（SpecificPathogenFree）

TCID50：半数组织培养物感染量（50%TissueCultureInfectiousdose）

TMB：四甲基联苯胺（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）

VSAV：阿拉戈斯型水疱性口炎病毒（AlagoasVesiculovirus）

VSIV：印第安纳型水疱性口炎病毒（IndianaVesiculovirus）

VSNJV：新泽西型水疱性口炎病毒（NewJerseyvesiculovirus）

VSV：水疱性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus）

5生物安全措施

进行水疱性口炎的实验室诊断、检测时，如动物剖检、样品采集与处理、病毒分离等，按照GBl9489的规定执行。

6临床诊断

6.l流行病学

6.l.l易感动物：牛、马和猪是感染后出现典型临床症状的主要易感动物；绵羊和山羊易感性较低，症状轻微。多种野生动物，如白尾鹿、浣熊和野猪等，可自然感染并作为病毒储存宿主。

6.l.2传染源：发病动物是主要传染源，其水疱液、水疱皮及唾液中含有大量病毒；潜伏期动物和感染的野生动物是重要的潜在传染源。

6.l.3传播途径：VSV可通过虫媒（白蛉、蚊虫和黑蝇等）叮咬传播；通过直接接触感染动物分泌物以及间接接触被病毒污染的饲料、饮水和环境等途径传播；病毒亦可经呼吸道和黏膜侵入机体。

6.2临床症状

6.2.l家畜发病最主要的症状是口腔黏膜、乳头皮肤及蹄冠部皮肤出现水疱及糜烂，大量流涎。水疱主要发生在口腔黏膜或乳头表面，猪多见蹄部损伤。如无继发感染，患病动物通常在2周后康复。常见的并发症包括水疱破溃处继发细菌或真菌感染，以及因乳头病变引发的乳房炎等。

6.2.2牛的临床症状为短期发烧，口腔粘膜、乳头上皮、趾间及蹄冠上出现丘疹和水疱。潜伏期一般为2d～8d，最长为2ld。

6.2.3猪的主要临床症状是鼻端、鼻镜、口腔及舌面出现水疱，蹄部病变可导致跛行，严重者行走困难。潜伏期通常为2d～8d。

3

6.2.4马的临床症状通常较温和。病变主要局限于舌背部，表现为水疱、糜烂或溃疡，偶见蹄部病变。

6.2.5绵羊和山羊自然感染病例罕见，可通过实验感染绵羊和山羊。

6.3临床判定

易感动物出现上述临床症状，且符合水疱性口炎流行病学特点，可临床判定为水疱性口炎疑似病例。进一步确诊应采集水疱皮、水疱液或发热期病畜血液等进行实验室诊断。

7样品采集、保存及运输

7.1主要器材

7.1.1解剖刀。

7.1.2剪刀。

7.1.3镊子。

7.1.4样品保存管。

7.1.5一次性无菌注射器。

7.1.6一次性采血管。

7.1.7食道探杯。

7.1.8样品保温箱。

7.2主要试剂和材料

7.2.10.04mol/LPBS（pH7.4），按照附录A中的A.1配制。

7.2.250%甘油-PBS保存液，按照附录A.2配制。

7.2.3OP液保存液，按照附录A.3配制。

7.3样品的采集

7.3.1水疱液

临床症状典型的发病动物水疱液用一次性无菌注射器吸出后置于样品保存管中；或用无菌棉签蘸取破裂水疱的水疱液，放入预先加有0.5mL采样缓冲液（0.04mol/LPBS，pH7.4）的样品保存管中，-20℃保存。

7.3.2反刍动物OP液

无法获得水疱皮和水疱液时，可用食道探杯采集反刍动物OP液。将食道探杯经口腔送入食道前端咽部，来回刮取5~10次，将探杯收集的液体转入样品保存管，加入等体积的OP液保存液，-20℃保存。

7.3.3组织样品

7.3.3.1对临床出现症状动物，从动物口腔、蹄冠或其他有水疱的部位无菌采集未破裂水疱皮或新破裂水疱皮1g~2g（合计大小约1cm×1cm），装入样品保存管，加入50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，-20℃保存。若采集不到典型水疱皮，可采集病灶周围破溃组织。

4

7.3.3.2对临床表现健康动物，可在屠宰或解剖时采集淋巴结、扁桃体等组织样品；亦可采集脾脏、肾脏等内脏器官，装入样品保存管中，-20℃保存。

7.3.4血清样品

采集发病动物、同群动物全血各5mL。室温放置12h~24h，分离血清，装入离心管中，-20℃保存。

8病毒分离与鉴定

8.1主要仪器和器材

8.1.1生物安全柜。

8.1.2恒温培养箱。

8.1.3CO2培养箱。

8.1.4倒置显微镜。

8.1.5高速台式冷冻离心机。

8.1.6组织研磨器或组织匀浆机。

8.1.7微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）及配套带滤芯吸头。

8.1.8细胞培养瓶（25cm2）。

8.1.90.45µM无菌针式过滤器。

8.1.10一次性无菌移液管（5mL、10mL）、洗耳球或电动移液管助吸器。

8.1.11离心管（1.5mL、5mL、15mL等不同规格）。

8.2主要试剂和材料

8.2.1三氯三氟乙烷或氯仿，分析纯。

8.2.2青霉素，浓度为10000IU/mL。

8.2.3链霉素，浓度为10000μg/mL。

8.2.4仓鼠肾细胞（BHK-21细胞）、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）或仔猪肾传代细胞（IB-RS-2细胞）。

8.2.5SPF鸡胚，8~10日龄。

8.2.6细胞生长液和维持液，按照附录A.4、附录A.5配制。

8.3样品的处理

8.3.1水疱液，无菌采集的新鲜水疱液无需经过研磨处理，可直接用于病毒分离。含水疱液的棉签拭子，吸出样品保存管中的拭子浸泡液，3000r/min离心10min，取上清液备用。

8.3.2OP液，将OP液倒入灭菌塑料离心管内，再加入不少于样品1/3体积量的三氯三氟乙烷或氯仿。用高速组织匀浆机以10000r/min搅拌3min，然后以3000r/min离心10min。此时液体分成两相，取上层水相备用。

8.3.3水疱皮等组织样品，称重后加入0.04mol/LpH7.4的PBS（质量体积比为1:9），研磨后的悬液3000r/min离心10min，取上清液。

5

8.3.4取上述处理后样品加抗生素（含青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/mL）混匀，放置4℃冰箱中作用30min，用0.45µM无菌针式过滤器过滤备用。

8.4病毒分离

8.4.1细胞接种

取按8.3处理后的样品1mL接种长成单层的Vero细胞、BHK-21细胞或IB-RS-2细胞，37℃5%CO2培养箱吸附1h，弃去接种物，用细胞培养液洗涤3次，然后加入维持液，置于37℃5%CO2培养箱中培养，每日用倒置显微镜观察。接种后2d~3d出现CPE，则收获鉴定；如未出现CPE，则反复冻融2次，继续盲传三代，观察是否出现CPE。CPE主要表现为细胞圆缩、团聚、细胞浆颗粒变性、脱落、破裂等变化。

8.4.2鸡胚接种

在生物安全柜内，将8d~10dSPF鸡胚气室朝上置于蛋架上，以碘酊和酒精棉球依次消毒气室顶部，用剪刀去除气室部蛋壳，大小约5mm×5mm，用无菌注射器取处理后样品0.2mL滴注于绒毛尿囊膜上。用石蜡或胶带密封孔口，置37℃培养箱培养。如鸡胚2d内死亡，周身呈明显充血、出血，尿囊膜肥厚，则收获鉴定。如鸡胚未死亡则盲传三代，观察是否死亡或出现病变。

8.5病毒鉴定

8.5.1细胞培养物鉴定

8.5.1.1出现CPE的细胞培养物悬液，经第9章或第10章方法检测为阳性者，判定为病毒分离阳性。

8.5.1.2细胞盲传3代未出现CPE的细胞培养物悬液，经第9章或第10章方法检测为阴性者，判定为病毒分离阴性。

8.5.1.3盲传3代未出现CPE，但经第9章或第10章方法检测为阳性者，应继续盲传3代，仍未出现CPE则判为病毒分离阴性。

8.6.2鸡胚培养物鉴定

8.6.2.1鸡胚出现病变、死亡，收集的尿囊液经第9章或第10章方法检测结果为阳性，判定为病毒分离阳性。

8.6.2.2盲传3代未出现死亡或病变的鸡胚尿囊液，经第9章或第10章方法检测结果为阴性，判定为病毒分离阴性。

8.6.2.3盲传3代未出现死亡或病变，但经第9章或第10章方法检测为阳性者，应继续盲传3代，鸡胚仍未出现病变或死亡则判为病毒分离阴性。

9RT-PCR方法

9.1主要仪器和器材

9.1.1PCR扩增仪。

6

9.1.2稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。

9.1.3凝胶成像仪（或紫外透射仪）。

9.1.4高速台式冷冻离心机。

9.1.5组织研磨器或组织匀浆机。

9.1.6微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）及配套带滤芯吸头。

9.1.7无RNA酶EP管（1.5mL）。

9.1.8PCR扩增管或96孔板。

9.2引物序列及主要试剂

9.2.1RT-PCR引物序列（见附录B中的B.1）。

9.2.2阳性对照：灭活的VSNJV、VSIV、COCV和VSAV病毒培养物上清液；或分别含有VSNJV、VSIV、COCV和VSAV目标基因片段（见附录B.2）的重组质粒。

9.2.3阴性对照：未感染的细胞或已知VSNJV、VSIV、COCV和VSAV阴性样品。

9.2.4一步法RT-PCR扩增试剂盒。

9.2.5DEPC水：按照附录B.3配制。

9.2.6病毒裂解液TRIzol。

9.2.7异丙醇：分析纯，使用前放置于冰箱中预冷。

9.2.8氯仿：分析纯。

9.2.970%乙醇：用DEPC水和无水乙醇配制，使用前放置于冰箱中预冷。

9.2.1050×TAE缓冲液、1.5%琼脂糖凝胶：按照附录B.4、附录B.5配制。

9.2.11DNA分子量标准。

9.3RT-PCR操作方法

9.3.1待检样品准备

待检样品及阳性对照、阴性对照的处理同8.3.1~8.3.4。第8章分离病毒的收获细胞培养物悬液或鸡胚尿囊液可直接用于RNA提取。

9.3.2RNA提取

9.3.2.1于灭菌的1.5mLEP管中加入600μLTRIzol，然后分别加入待检样品、阴性对照、阳性对照各200μL，混匀，再加入200μL氯仿，上下颠倒混匀。于4℃12000r/min离心15min。

9.3.2.2取与9.3.2.1相同数量灭菌的1.5mLEP管，加入500μL异丙醇，并做好标记。将9.3.2.1各管中的上清液分别转移至含500μL异丙醇的相应管中，颠倒混匀。

9.3.2.3于4℃12000r/min离心15min，小心倒去上清液；加入1000μL70%乙醇，颠倒洗涤。

9.3.2.4于4℃12000r/min离心10min，弃上清液，风干。

9.3.2.5于各管中加入20μLDEPC水溶解沉淀，即为RNA模板。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增；若需长期保存应将其放置于﹣70℃保存。

7

9.3.2.6除本文件描述的方法外，可采用商品化核酸提取试剂盒提取各类样品中的病毒核酸，按说明书操作。

9.3.3RT-PCR检测

9.3.3.1反应体系配制

按照下列方法配制50µL反应体系：

——10µL的5×RT-PCR反应缓冲液；

——2µL的RT-PCR酶混合液；

——2µL的dNTPs混合液；

——2µL的上游引物（10μmol/L）；

——2µL的下游引物（10μmol/L）；

——27µL的DEPC水；

——5μL提取的核酸溶液。

瞬时离心后，置PCR扩增仪内进行扩增。每次试验应设立阳性和阴性对照。也可采用其它商品化一步法RT-PCR扩增试剂盒，按相应说明书使用。

9.3.3.2RT-PCR反应条件

第一阶段：反转录50℃30min，95℃15min。第二阶段：94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环。第三阶段：72℃延伸10min。PCR反应完成后，将反应产物置4℃保存。

9.3.3.3扩增产物电泳检测

制备1.5%琼脂糖凝胶。取5μLPCR产物与0.5μL10×电泳上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中，在另一加样孔加入DNA分子量标准。盖好凝胶电泳仪，插好电极，120V电压电泳，30min~40min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪（或紫外透射仪）观察结果，进行分析。

9.4结果判定

9.4.1试验成立条件

阳性对照出现相应扩增带，阴性对照无扩增带时，试验结果成立。

9.4.2结果描述及判定

9.4.2.1符合9.4.1的条件，用VSNJVP102/VSNJVP744引物扩增，出现预期大小约643bp的扩增片段时（见附录B.6.2.1），判定为VSNJV核酸检测阳性，否则判定为VSNJV核酸检测阴性。

9.4.2.2符合9.4.1的条件，用VSIVP179/VSIVP793引物扩增，出现预期大小约615bp的扩增片段（见附录B.6.2.2），判定为VSIV核酸检测阳性，否则判定为VSIV核酸检测阴性。

9.4.2.3符合9.4.1的条件，用COCVP169/COCVP686引物扩增，出现预期大小约544bp的扩增片段（见附录B.6.2.3），判定为COCV核酸检测阳性，否则判定为COCV核酸检测阴性。

9.4.2.4符合9.4.1的条件，用VSAVP163/VSAVP691引物扩增，出现预期大小约565bp的扩增片段（见附录B.6.2.4），判定为VSAV核酸检测阳性，否则判定为VSAV核酸检测阴性。

8

9.4.2.5必要时，可取RT-PCR阳性扩增产物进行序列测定。参考序列参见附录B.2。

10实时荧光RT-PCR方法

10.1主要仪器和器材

10.1.1荧光PCR检测仪。

10.1.2高速台式冷冻离心机。

10.1.3组织研磨器或组织匀浆机。

10.1.4微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）及配套带滤芯吸头。

10.1.5无RNA酶EP管（1.5mL）。

10.1.6PCR扩增管或96孔板。

10.2引物探针序列及主要试剂

10.2.1实时荧光RT-PCR引物和探针（序列信息见附录C中的C.1）。

10.2.2阳性对照：灭活的VSNJV、VSIV、COCV和VSAV病毒培养物上清液；或分别含有VSNJV、VSIV、COCV和VSAV目标基因片段（见附录C.2）的重组质粒。

10.2.3阴性对照和其他试剂：同9.2.3、9.2.5~9.2.9。

10.2.4一步法实时荧光RT-PCR扩增试剂盒。

10.3实时荧光RT-PCR操作方法

10.3.1待检样品准备

同9.3.1。

10.3.2RNA提取

同9.3.2。

10.3.3实时荧光RT-PCR检测

10.3.3.1反应体系配制

按照下列方法配制25µL反应体系：

——12.5µL的2×实时荧光RT-PCR反应缓冲液；

——1µL的酶混合液；

——1µL的上游引物（10μmol/L）；

——1µL的下游引物（10μmol/L）；

——0.5µL的探针（10μmol/L）；

——4µL的DEPC水；

——5μL提取的核酸溶液。

盖紧PCR管盖或封膜，瞬时离心后，置荧光PCR扩增仪内进行扩增。每次检测应设置阳性对照和阴性对照。也可采用其它商品化实时荧光RT-PCR扩增试剂盒，按相应说明书使用。

9

10.3.3.2RT-PCR反应条件

第一阶段：45℃反转录10min，95℃预变性10min；第二阶段：95℃变性15s，60℃退火45s，60℃采集荧光，45个循环。

10.4结果判定

10.4.1结果分析和条件设定

综合分析仪器读取的各项数据及扩增曲线，设定合理的基线（Baseline）和阈值（Threshold），使仪器显示正确的结果。

10.4.2试验成立条件

10.4.2.1阴性对照无S形扩增曲线，且无Ct值。

10.4.2.2阳性对照实时荧光RT-PCR扩增出现S形扩增曲线，且Ct值≤30（见附录C中的C.3）。

10.4.2.3如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次试验视为无效。

10.4.3结果描述及判定

10.4.3.1用VSNJV-F/VSNJV-R/VSNJV-P引物探针组合进行实时荧光RT-PCR检测，若待检样品Ct值≤35，判定为VSNJV血清型核酸检测阳性；若待检样品35＜Ct值≤40，有典型扩增曲线，判为可疑，需重新提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，若检测结果仍为可疑，则判定为VSNJV血清型核酸检测阳性；若待检样品无Ct值并且无扩增曲线，判定为VSNJV血清型核酸检测阴性。

10.4.3.2用VSIV-F/VSIV-R/VSIV-P引物探针组合进行实时荧光RT-PCR检测，若待检样品Ct值≤35，判定为VSIV血清型核酸检测阳性；若待检样品35＜Ct值≤40，有典型扩增曲线，判为可疑，需重新提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，若检测结果仍为可疑，则判定为VSIV血清型核酸检测阳性；若待检样品无Ct值并且无扩增曲线，判定为VSIV血清型核酸检测阴性。

10.4.3.3用COCV-F/COCV-R/COCV-P引物探针组合进行实时荧光RT-PCR检测，若待检样品Ct值≤35，判定为COCV血清型核酸检测阳性；若待检样品35＜Ct值≤40，有典型扩增曲线，判为可疑，需重新提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，若检测结果仍为可疑，则判定为COCV血清型核酸检测阳性；若待检样品无Ct值并且无扩增曲线，判定为COCV血清型核酸检测阴性。

10.4.3.4用VSAV-F/VSAV-R/VSAV-P引物探针组合进行实时荧光RT-PCR检测，若待检样品Ct值≤35，判定为VSAV血清型核酸检测阳性；若待检样品35＜Ct值≤40，有典型扩增曲线，判为可疑，需重新提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，若检测结果仍为可疑，则判定为VSAV血清型核酸检测阳性；若待检样品无Ct值并且无扩增曲线，判定为VSAV血清型核酸检测阴性。

11通用型抗体阻断酶联免疫吸附试验（通用型B-ELISA）

11.1主要仪器和器材

11.1.1酶标仪。

11.1.2洗板机。

10

11.1.3恒温培养箱。

11.1.4微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）及配套吸头。

11.1.5ELISA反应板。

11.2主要试剂

11.2.1包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物液、终止液：分别按照附录D中的D.1~D.6配制。

11.2.2包被抗原：VSVNP重组抗原，参考附录E中的E.1制备。

11.2.3酶标单抗：HRP标记的抗VSVNP单克隆抗体，参考附录E.2制备。

11.2.4阳性对照血清：VSV标准阳性血清、标准阴性血清，56℃30min灭活。

11.2.5也可使用商品化通用型阻断ELISA试剂盒，并按其说明书操作。

11.3试验操作

11.3.1抗原包被：用包被液将NP重组抗原稀释至指定工作浓度（2µg/mL），加入酶标板中，每孔100µL，置4℃冰箱过夜。

11.3.2洗涤：取出酶标板甩去液体，并在洁净的吸水纸上轻拍干，每孔加入250μL洗涤液，甩去孔内洗涤液，在洁净的吸水纸上轻拍干，如此重复洗3次；也可用洗板机进行洗涤。

11.3.3封闭：用封闭液封闭酶标板，每孔200µL，37℃孵育2h；洗涤同11.3.2。

11.3.4加样：待检血清经56℃30min灭活，用稀释液按1:10稀释待检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。取稀释好的待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清分别加入酶标板，每份样品做两孔，每孔

100µL，轻轻混匀酶标板后置于37℃孵育1h；洗涤同11.3.2。

11.3.5加酶标单抗：用稀释液将HRP标记的抗VSVNP单克隆抗体稀释至指定工作浓度，加入到酶标板中，每孔100µL，轻轻混匀，37℃孵育30min；洗涤同11.3.2。

11.3.6显色：每孔加入底物液100µL，室温避光显色10min～15min。

11.3.7终止：每孔加入50μL反应终止液，振荡混匀，酶标板加终止液的顺序与加底物的顺序一致。

11.3.8结果读取：加终止液后在5min之内，采用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

11.3.9BP值的计算：

待检样品的阻断率（BlockingPercentage）按式（1）计算：

BP=(1-⃞)×100%..........................................................................（1）

式中：

BP——样品阻断率

OD450-S——待检血清样品在450nm波长处的平均OD值

OD450-NC——阴性对照血清在450nm波长处的平均OD值

11.4结果判定

11.4.1试验成立条件

11

当阳性对照血清BP值≥80%，阴性对照血清OD值≥1.0时，试验成立，可进行结果判定。

11.4.2结果描述及判定

待检血清BP值≥50%，则待检血清VSV抗体阳性；待检血清BP＜45%，则待检血清VSV抗体阴性；如果45%≤BP值＜50%，待检血清VSV抗体可疑，对于可疑样品需重复实验，结果仍为可疑则判为阳性。

12VSNJV、VSIV血清分型抗体阻断酶联免疫吸附试验（VSNJV、VSIV血清分型B-ELISA）

12.1主要仪器和器材

同11.1.1。

12.2主要试剂

12.2.1包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物液、终止液：同11.2.1。

12.2.2包被抗原：VSNJV、VSIVGP重组抗原，参考附录E中的E.3制备。

12.2.3酶标单抗：HRP标记的抗VSNJV、VSIVGP单克隆抗体，参考附录E.4制备。

12.2.4血清：VSNJV、VSIV标准阳性血清、标准阴性血清，56℃30min灭活。

12.2.5也可使用商品化血清分型阻断ELISA试剂盒，并按其说明书操作。

12.3试验操作

12.3.1抗原包被：用包被液将特定型别（VSNJV或VSIV）的GP重组抗原稀释至指定工作浓度（1µg/mL），加入酶标板中，每孔100µL，置4℃冰箱过夜。

12.3.2洗涤：同11.3.2。

12.3.3封闭：同11.3.3。

12.3.4加样：待检血清经56℃30min灭活，用稀释液按1:5稀释待检血清、对应型别的标准阳性血清和标准阴性血清。取稀释好的待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清分别加入酶标板，每份样品做两孔，每孔100µL，轻轻混匀酶标板后置于37℃孵育1h；洗涤同11.3.2。

12.3.5加酶标单抗：用稀释液将对应型别的HRP标记的抗GP单克隆抗体稀释至指定工作浓度，加入到酶标板中，每孔100µL，轻轻混匀，37℃孵育30min；洗涤同11.3.2。

12.3.6显色、终止及结果读取：同11.3.6~11.3.8。

12.3.7BP值的计算：

待检样品的BP值计算公式同11.3.9式（1）。

12.4结果判定

12.4.1试验成立条件

当阳性对照血清BP值≥80%，阴性对照血清OD值≥1.0时，试验成立，可进行结果判定。

12.4.2结果描述及判定

待检血清对某一血清型的BP值≥50%，则判定为该血清型抗体阳性；待检血清某一血清型的BP

12

值＜50%，则判定为该血清型抗体阴性。

13综合判定

13.1临床判定为水疱性口炎疑似病例的动物，经第8章分离鉴定出VSV，或经第9章、第10章任一项检测出VSV核酸阳性的可判定为水疱性口炎病例。依据所用的引物/探针组合判定血清型：检测到VSNJV核酸，判定为新泽西型VS病例；检测到VSIV核酸，判定为印第安纳型VS病例；检测到COCV核酸，判定为可可尔型VS病例；检测到VSAV核酸，判定为阿拉戈斯型VS病例。

13.2动物源性组织或产品，经第8章分离鉴定出VSV，可判定为VS病原阳性；经第9章、第10章任一项检测出VSV核酸的，可判定为VSV核酸阳性，并依据所用的引物/探针组合判定血清型：检测到VSNJV核酸，判定为VSNJV血清型核酸检测阳性，反之判为VSNJV血清型核酸检测阴性；检测到VSIV核酸，判定为VSIV血清型核酸检测阳性，反之判为VSIV血清型核酸检测阴性；检测到COCV核酸，判定为COCV血清型核酸检测阳性，反之判为COCV血清型核酸检测阴性；检测到VSAV核酸，判定为VSAV血清型核酸检测阳性，反之判为VSAV血清型核酸检测阴性。

13.3临床无明显特异症状的非免疫动物，经第11章检测出VSV抗体阳性的，可判定动物感染过水疱性口炎病毒；经第12章检测出VSNJV抗体阳性的，可判定动物感染过VSNJV；检测出VSIV抗体阳性的，

可判定动物感染过VSIV。

13

附录A（规范性）试剂的配制

A.10.04mol/LPBS（pH7.4）

A.1.10.1mol/LPBS（pH7.4）

称取80.0g氯化钠（NaCl）、2.0g氯化钾（KCl）、14.4g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、2.4g磷酸二氢钾（KH2PO4），加去离子水至1000mL，调整pH至7.4，分装，103kPa高压蒸汽灭菌20min，室温或4℃保存。

A.1.20.04mol/LPBS（pH7.4）的配制

取0.1mol/LPBS（pH7.4）400mL，加入去离子水600mL，调整pH至7.4，分装，103kPa高压蒸汽灭菌20min，室温或4℃保存。

A.250%甘油-PBS保存液（pH7.4）

将0.04mol/LPBS（pH7.4）与甘油（分析纯）等量混合，调整pH至7.4，103kPa高压蒸汽灭菌20min，室温或4℃保存。

A.3OP液保存液

取50mLE-MEM营养液，50mL5%水解乳白蛋白液，用5%碳酸氢钠（NaHCO3）调整pH至7.6~7.8。

A.4细胞生长液

按说明书要求配制E-MEM培养基，加10％无水疱性口炎抗体的灭活胎牛血清和抗生素（含青霉素200IU/mL、链霉素200µg/mL）。抽滤除菌，分装后4℃保存。

A.5细胞维持液

按说明书要求配制E-MEM培养基，加2％无水疱性口炎抗体的灭活胎牛血清和抗生素（含青霉素

200IU/mL、链霉素200µg/mL）。抽滤除菌，分装后4℃保存。

附录B

14

（资料性）

RT-PCR引物和阳性质粒参考序列、试剂及检测结果参照图

B.1RT-PCR引物序列

采用普通RT-PCR检测方法开展VSV检测，可根据检测需要选择表B.1中的引物组合。

表B.1VSVRT-PCR引物序列

引物名称

引物序列5′-3′

扩增片段长度（bp）

病毒名称

VSNJVP102

GAGAGGATAAATATCTCC

643

VSNJV

VSNJVP744

GGGCATACTGAAGAATA

VSIVP179

GCAGATGATTCTGACAC

615

VSIV

VSIVP793

GACTCTYGCCTGRTTGTA

COCVP169

TTACCAAAATCAGGAGGATGA

544

COCV

COCVP686

GCCTCCCACCGAGATG

VSAVP163

AGAGCAGCTCCYTCTTATTAT

565

VSAV

VSAVP691

TCATCATTCCATTTCCTC

注：Y=C或T；R=A或G。

B.2RT-PCR方法阳性质粒参考序列

B.2.1VSNJVP102/VSNJVP744引物扩增片段（643bp）

GAGAGGATAAATATCTCCAAGACCTCTTCATCGAAGATCAAGGAGATAAACCAACTCCGTCATATTATCAGGAAGAAGAATCGTCAGATTCAGATACTGACTATAATGCTGAACATCTTACGATGTTGTCGCCGGATGAAAGAATAGACAAATGGGAAGAGGATTTGCCCGAGTTGGAAAAGATTGATGATGATATACCAGTCACTTTTTCCGATTGGACACAACCTGTAATGAAGGAAAACGGAGGGGAGAAATCACTATCTCTGTTTCATCCGGTTGGATTAACAAAAATTCAGACGGACCAATGGAGGAAGACAATTGAGGCAGTCTGTGAGAGCTCAAAATATTGGAATTTGTCAGAATGCCAAATTATGAACTCAGATAATTGTCTTATCCTCAAAGGCCGAGTTATGACTACTGACTGCAGCTCATCAATCAAATCTCAGAACTCCATACAGAGTTCCGAATCTTTTTCCTCCTCGCATTCACCGAGTCCAGCACCAAAAGTCACGGAGTCGACTAGTCTATGGGACTTAAGATCAACAGAAGTACAACTAATCTCGAAGAGGGCCGGAGTGAAAGACATGATGGTGAAATTGACAGACTTTTTTGAAAGTGAAGATGAATATTCTTCAGTATGCCC

B.2.2VSIVP179/VSIVP793引物扩增片段（615bp）

GCAGATGATTCTGACACAGAATCTGAACCAGAAATTGAAGACAATCAAGGCTTGTATGTACCAGATCCGGAAGCTGAGCAAGTTGAAGGCTTTATACAAGGGCCTTTAGATGACTATGCAGATGAGGAAGTGGATGTTGTATTTACTTCAGACTGGAAACAGCCTGAGCTCAAATCTGACGAGCATGGAAAGACCTT

15

ACGGTTGACATTGCCAGAGGGTTTAAGTGGAGAGCAGAAATCCCAGTGGCTTTCGACGATTAAAGCAGTCGTTCAAAGTGCCAAATACTGGAATCTAGCAGAGTGCACATTTGAAGCATCGAGAGAAGGGGTCATTATGGAAGAGCGCCAGATGACTCCGGATGTATATAAGGTCACTCCAGTGATGAACACACATCCGTCCCAATCAGAAGCCGTATCAGATGTTTGGTCTCTCTCGAAGACATCCATGACTTTCCAACCCAAGAAAGCAAGTCTTCAGCCTCTTACCATATCCTTGGATGAATTGTTCTCATCTAGAGGAGAATTCATCTCTGTCGGAGGTAACGGACGAATGTCTCATAAAGAGGCCATCCTGCTTGGTCTGAGGTACAAAAAGTTGTACAATCAGGCGAGAGTC

B.2.3COCVP169/COCVP686引物扩增片段（544bp）

TTACCAAAATCAGGAGGATGATGAGGAAGACAACTTCACAGATGAGGAATCTGGAGAAGGCTCAGAAGAAAGACCCCAAAGCACCGTGGAGGGCTATGAAGATGAGGGAGCAGACGATTATGTGGATGATGAGGTACAAGTGGTTTTCACAACAAATTGGAAACAGCCTGAATTAGAGTCAGATGGGGACGGGAAGACTCTGCTACTGACTGCGCCCGATGGGCTTACTCCTGAGCAGCGAACTCAGTGGAATGCTACAATCAAAGCTTTGGTTCAAAGTGCGAAGTACTGGAACATCGCCGAATGTTCTGTAGAAGACAATGAACGGGGAATTGTCATAAAGGAAAGGCAAATGACACCAGATGTGTACAAGGGAACACCTGTCAAGGCGGCTCCTCAGTCACCTCCAGAGGCTCCTGGTGATGTATGGGCTCTGTGCGGAAAAGCCAGTACCTTTCCTGCACGTAAAACAGGAGTCACTCCCTTGGTAGTCACCCTGGAGGAGCTTTTCAGTTCAAGAGGAGAATTCATCTCGGTGGGAGGC

B.2.4VSAVP163/VSAVP691引物扩增片段（565bp）

AGAGCAGCTCCTTCTTATTATGACACTCTTGAGGATGATGAGTTGTCTGATCCAGACGATGAAGACACAGTGGCACCACAATGCATCCAGTTCGTAGAAGGTTATGATAACACTTCTAAAGAACAGTATGAGGATGAAGATGTAGAAGTGGCTTTCACCTCAGAGTTGAAGCTCCCAGAATTAAAGTCGGATTCTACTGGCAAATCCTTAACCCTAACCATTCCAGGAGGGCTGACGACTGAGCAAAGATCTCAATGGACATCTACAATTGAAGCACTTGTGCAGAGTGCCAAATATTGGAATATTGCTGAATGCAGTGTCGAGAAAATGGATCATATGATCATCATCAGAGAAAGGCGAATGTTACCCGACATCTATAAAGTCAATCCTCGCCCAGATGCTCCTCAATCAACGGAGCCTTTCGAGCAAGATGTTTGGATACTTAGTAGCAAAGTTCACGCATTCCCTGCTAAGAAACCAGGGATCTCCCCTCTGTCCATCTCTCTAGATGAACTTTTCAGTTCAAGAGAAGAATTCCTCTCAGTGGGAGGAAATGGAATGATGA

B.3DEPC水

去离子水100mL，加入DEPC50μL，室温过夜，103kPa高压蒸汽灭菌20min，分装到无RNA酶的

离心管中。

B.450×TAE

B.4.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)

称取18.61g二水乙二铵四乙酸二钠(EDTA)，加入80mL去离子水，用氢氧化钠调pH值至8.0，去离

16

子水定容至100mL。

B.4.250×TAE电泳缓冲液

称取24.2g三羟甲基氨基甲烷(Trisbase)、10mL冰乙酸、10mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加去离子水至100mL，室温保存备用。使用时用去离子水稀释为1×TAE。

B.51.5%琼脂糖凝胶

称取1.5g琼脂糖于100mL1×TAE缓冲液中，加热融化后充分摇匀，待冷至50℃~60℃时，加入5μL10mg/mL的溴化乙锭（EB）贮存液或其它商品化可用于琼脂糖凝胶电泳的DNA染料。摇匀，倒入插好梳子的电泳板上，凝固后取下梳子，备用。

B.6水泡性口炎RT-PCR检测结果参照图

B.6.1VSNJVRT-PCR扩增产物电泳检测结果见图B.6.1。

标引序号说明:

M——DNA分子质量标准（DL2000Marker）；

1——VSNJV阳性对照；

2——阴性对照。

图B.6.1VSNJVRT-PCR检测结果参照图

B.6.2VSIVRT-PCR扩增产物电泳检测结果见图B.6.2。

17

标引序号说明:

M——DNA分子质量标准（DL2000Marker）；

1——VSNJV阳性对照；

2——阴性对照。

图B.6.2VSIVRT-PCR检测结果参照图

B.6.3COCVRT-PCR扩增产物电泳检测结果见图B.6.3。

标引序号说明:

M——DNA分子质量标准（DL2000Marker）；

1——COCV阳性对照；

2——阴性对照。

图B.6.3COCVRT-PCR检测结果参照图

B.6.4VSAVRT-PCR扩增产物电泳检测结果见图B.6.4。

标引序号说明:

M——DNA分子质量标