基于宏基因组测序技术的新发病原体实验室识别专家共识总结2026

基于宏基因组测序技术的新发病原体实验室识别专家共识总结2026在全球化交流日益频繁，气候变化不断加剧，人类对自然界探索愈加深入的背景下，新发病原体溢出的风险持续增加。世界卫生组织指出，新发病原体引起的疾病（疾病X）随时可能出现，部分病原体具有较高传染性，可能导致严重公共卫生事件

［

1］

。面对这一威胁，提升临床实验室对不明原因感染或聚集性病例警惕性，加强临床信息识别能力，尽早明确感染病原至关重要。然而传统微生物培养、抗原检测和核酸检测等方法，需要依赖已知信息进行培养条件和检测靶标选择，在检测新发病原体上存在技术局限性

［

2］

。病原宏基因组测序技术（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）具有无需预设、无需培养、无偏好性的特点，为临床新发病原体的识别提供了有效的工具

［

3,4］

。目前国内已相继发布多部专家共识，mNGS检测适应证、标本类型选择、检测流程等内容可参考相关共识

［

5］

。鉴于mNGS技术在新发病原体识别中实验室能力及预警体系建设尚缺乏规范化指导文件，亟需制定针对临床微生物实验室基于mNGS技术快速识别新发病原体的专家共识，以规范该技术应用并提升检测质量（整体流程见

图1

），为临床实践提供指导。图1

新发病原体信息识别及mNGS实验室检测流程本共识拟实施主要目标人群为疑似新发病原体感染患者或聚集性发病疑似具有传染性但无法明确病原体的患者，使用者主要包括临床、检验、微生物、感控及公共卫生部门人员等。一、共识形成方法由欧洲临床微生物与感染病学会华人药敏试验委员会、中国医院协会临床微生物实验室专业委员会共同发起并组织临床检验、感染病、疾病预防与控制等多学科专家共同制定。本共识采用问答形式，通过专家会议讨论并筛选出11个临床问题。以“metagenomicnext-generationsequencing”“emergingpathogen”为关键词，检索PubMed、WebofScience、中国知网、万方数据等自2005年11月至2025年11月的中英文文献，去重并精读后纳入37篇文献，获取了国内外相关研究证据并结合临床经验以支持对相应临床问题的回答。依据2009版牛津大学证据分级系统进行证据分级。该分级系统共分为10个证据等级，分别为1a（同质随机对照试验的系统评价）、1b［单个随机对照试验（可信区间窄）］、1c（“全或无”的病例系列研究）、2a（同质队列研究的系统评价）、2b（单个队列研究，包括低质量随机对照试验，如随访率<80%）、2c（结果研究或生态学研究）、3a（同质病例-对照研究的系统评价）、3b（单个病例-对照研究）、4（病例系列研究，包括低质量队列或病例-对照研究），以及5（基于经验未经严格论证的专家意见或评论或基础实验）。对于超出其适用范围的新发病原体真实场景识别及鉴定等，未进行证据分级。本共识由执笔小组撰写初稿，由各领域专家审阅、修改和首轮评议，执笔小组整合反馈意见完成修改，形成修改稿并再次提交专家组进行多轮专题会讨论和第二轮审稿会评议，形成终稿。第一轮评议专家15位，其中临床专业2位（感染专家），微生物学专业7位，公共卫生学专业2位，生物信息专业4位。初稿推荐共识24条，删除争议较大的共识2条。第二轮评议专家78位，其中临床专业（包括感染、呼吸与危重症专业）5位，微生物学专业65位，公众卫生学专业3位，生物信息专业5位。第二稿推荐共识22条，删除与常规病原鉴定一致或冗余的共识8条，最终形成14条共识。每条推荐意见设置4个投票选项：“强推荐”“推荐”“不推荐”和“反对”。当“强推荐”和“推荐”票数之和≥总票数90%认为达成共识。对于达成共识的推荐意见，“强推荐”占总票数百分比≥85%时认为推荐强度为强推荐，否则为推荐。二、术语及定义本共识聚焦在新发病原体相关术语及定义，mNGS通用术语参见其他专家共识。1.新发病原体：是指新近被发现的、此前未被科学界记录或分类的病原微生物，或既往已知但发生显著基因变异导致感染特性改变的病原体

［

6］

。新发病原体可分为4类：人类历史上首次发现的病原微生物种类

［

7］

（如新型冠状病毒）；（2）已知病原体物种的新亚型或变异株；（3）已知病原体从原发地播散至其他国家/地区或动物病原溢出感染人类；（4）已知微生物首次报道感染人类

［

8］

。2.病原体X：由世界卫生组织提出，一种可能导致大规模流行但目前尚未被发现的未知病原体

［

9］

。3.平均核苷酸一致性：平均核苷酸一致性（averagenucleotideidentity，ANI）是两个基因组之间共享区域的核苷酸序列相似度的平均值，是细菌物种鉴定的重要指标。通常认为ANI值≥95%的两个基因组属于同一物种，ANI值<95%可考虑为不同物种。4.数字DNA-DNA杂交：数字DNA-DNA杂交（digitalDNA-DNAhybridization，dDDH）是一种基于全基因组序列的计算方法，模拟传统DNA-DNA杂交实验，用于细菌种级分类。dDDH值≥70%通常表示属于同一物种。5.内转录间隔区：内转录间隔区（internaltranscribedspacer，ITS）位于真菌rRNA基因簇中18S、5.8S和28SrRNA基因之间的转录间隔区，是真菌分类鉴定的主要分子标记，具有较高的变异性，适合用于种级鉴定。6.RNA依赖的RNA聚合酶：RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）是RNA病毒复制所必需的酶，在RNA病毒中高度保守，是病毒分类和系统发育分析的重要标记基因。7.从头组装：不依赖参考基因组的序列拼接方法，通过算法将短序列读段组装成更长的重叠群，适用于新发病原体基因组重建。8.重叠群：通过序列拼接算法产生的连续DNA序列片段，是从头组装的基本单元。长重叠群有助于获得更完整的病原体基因组信息。9.系统发育分析：基于核酸或蛋白质序列相似性构建进化关系树的方法，用于确定新发病原体在生物分类系统中的位置和与已知物种的进化关系。10.序列相似性：指两个或多个序列之间相同核苷酸/氨基酸位点所占的比例，通常用百分比表示，是判断新发病原体种属归属的重要指标。三、疑似新发病原体感染的识别及标本送检问题1：什么情况下临床应怀疑新发病原体感染？共识1：对存在暴露史、旅居史等流行病学信息，或有特殊接触史、特殊职业的高风险患者，或临床表现与病程进展与医师既往认知不符的患者，应高度警惕新发病原体感染的可能（证据级别4，强推荐）。新发病原体的早期识别对于感染性疾病精准防控至关重要，临床医生在面对特定临床情境时应保持高度警惕。以下关键信息提示可能存在新发病原体感染：1.流行病学信息：聚集性发病；与发病患者间存在时空交集，如共同暴露场所、特殊旅居史等；或已知地区特异病原体出现在其他国家/地区的非流行区域等；高风险患者信息：有特殊接触史，如接触野生动物、食用未熟肉类或海鲜、洞穴探险等；或特定职业人群，如动物养殖及宰杀人员、兽医等；临床表现与病程进展与医师既往认知不符信息：患者临床表现特殊、广谱抗感染药物治疗失败、病情持续进展，无法用已知病原体或疾病知识解释等。问题2：临床怀疑新发病原体感染时如何进行mNGS检测标本采集与送检？共识2：对于符合疑似新发病原体感染临床适应证患者，临床可考虑采集并留存多种类型的标本送检mNGS，应基于怀疑病原体的种类选择合适的测序流程，或联合进行DNA测序和RNA测序双流程；高度怀疑新发病原体感染时，除临床标本外，建议同时采集并留存部分环境标本或疑似相关动物样本（证据级别5，强推荐）。临床初步判别患者存在上述可疑信息时，建议及时送检mNGS并基于怀疑病原体的类型（如细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒等）选择合适的检测流程。条件允许下，优先推荐送检DNA与RNA双流程，以最大程度覆盖病原体类型；对于急危、重症患者，建议采集除感染部位外的多种标本类型，如血液、尿液等，以提升病原体检出率。高度怀疑新发病原体感染时，建议同时采集并留存相关环境标本或接触的动物标本，以便开展感染源追溯工作。四、识别新发病原体mNGS检测实验室基本要求问题3：使用mNGS鉴定新发病原体的临床实验室应具备哪些能力？共识3：应用mNGS技术进行新发病原体鉴定的临床实验室应具备以下能力：具备DNA及RNA双流程检测能力；满足测序数据量及质量控制要求；构建定期更新的参考数据库，建立新发病原体识别基线，并持续更新维护；具备mNGS异常信息识别及分析能力，具备特殊生物信息分析工具及流程（证据级别5，强推荐）。现阶段国内开展mNGS检测项目的实验室较多，但所采用技术差异较大。推荐新发病原体检测基本要求包含四个维度：实验室基础能力：主要标本类型具备DNA与RNA双流程检测能力：鉴于RNA病毒变异或重组频率较高，其为新发病原体概率也较高，因此针对主要标本类型，实验室应具备DNA与RNA双流程检测能力；测序数据量要求：对于采用随机测序的经典mNGS技术的实验室，每个标本的测序数据量可依据既往专家共识及文章推荐达到20M，也可依据具体预期用途、测序灵敏度等综合设置；对于采用基于超广谱探针捕获mNGS技术的实验室，建议每个标本的测序数据量不低于2M。不同标本类型的最低测序数据量设置可参考《病原宏基因组高通量测序性能确认方案》

［

10］

，必要时可加大数据量。2.质量控制体系：鉴于已有较多共识详细阐述了mNGS针对已知病原体的全流程质量控制与规范化管理，本共识将聚焦于新发病原体mNGS检测在质量控制方面的重点措施。检出疑似新发病原体后，mNGS检测重点质量控制措施包括：阴性对照分析：每批次设置试剂阴性对照和环境阴性对照，建立背景噪声基线，用于排除试剂和环境微生物的影响

［

11］

；污染源数据库比对：建立实验室常见背景微生物数据库（包括试剂工程菌、环境微生物等），将检出序列与该数据库进行比对，排除已知污染源；较高序列检出时进行序列分布随机性验证：评估检出序列在物种基因组上的分布均匀性和覆盖度，排除测序偏好性和随机污染；低序列检出时，生物信息比对初步确认可靠性后，可酌情加大数据量复测；（4）重复性验证：①原始标本和（或）留存核酸的mNGS复测，必要时可加大数据量；②如临床可行，可再次采集多种标本类型进行检测，以确保结果可靠性；③条件允许下可由不同人员进行操作，包括实验人员、生物信息分析人员、报告解读人员等，确保结果的可靠性

［

12］

。3.多维数据库建设及更新能力：临床实验室开展新发病原体mNGS检测过程中，（1）应建立并逐步完善本实验室的背景微生物参考数据库，包括微生物名称和类别，以及试剂、环境和操作过程中可能引入的背景微生物核酸序列；（2）建立地区性流行病原体临床标本库，有条件可建立基因组数据库；（3）建立历史检出的特殊或稀有病原体临床标本库及序列库

［

13］

，为新发病原体的识别提供参考基线。通过整合上述数据，建立本实验室的“正常序列基线”，当检测到显著偏离基线的异常序列时，优先考虑新发病原体可能。临床实验室还应建立数据库更新机制，建议每半年至1年定期更新参考序列库；在感染高发、出现不明原因发热案例增多等特殊场景下，应启动应急更新流程，确保数据库的时效性和准确性

［

14］

。数据存储与管理时，需确保数据安全和隐私保护以及操作留痕。详细新发病原体检测参考数据库见

表1

推荐。4.异常信息分析识别能力：（1）临床实验室应搭建并完善mNGS新发病原体特殊生物信息分析流程，并进行系统性培训。在生物信息分析及报告解读环节，应纳入WHO推荐的《未来可能发生大流行新发病原体清单》

［

15］

、国家卫生健康委员会制定的《人间传染的病原微生物目录》中提及的病原体。此外，由于部分动物病原体存在溢出风险，建议纳入农业农村部发布的《动物病原微生物分类名录》中提及的病原体。当疑似检出与清单或名录病原体序列相似性高的新发病原体时，建议报告解读环节进行特殊标记并提示，并根据提示信息采取相应的深入分析策略。详细识别信息及应对策略见共识4~5；（2）具备进行序列组装、确认等方面的生物信息学分析工具：除具备基于短序列比对的常规生物信息分析流程及标准工具外，还应增加基于序列组装的生物信息分析流程及工具，包括但不限于分类鉴定、系统发育树分析、功能预测等。应选择性能稳定、准确性高的生物信息学工具，并根据病原体类型和分析需求进行合理组合

［

16］

和（或）交叉验证，提高结果可靠性，必要时可及时引入专业生物信息学团队支持。详细新发病原体检测生物信息学工具选择和适用条件见共识5~8和

表2

推荐。五、新发病原体mNGS信息识别与初步分析问题4：如何通过mNGS结果解读及早识别新发病原体信息？共识4：在mNGS报告解读过程中，应特别警惕可能提示新发病原体的特征性信息，如序列比对相似性较低、多个近缘物种检出序列难以归类、或临床表现与已知病原体明确不符等。解读过程中需结合临床信息和流行病学背景进行综合评估（证据级别4，强推荐）。提示新发病原体的特征性信息主要包括两方面：一方面为共识1提及的临床信息，另一方面为mNGS下机数据中出现的提示信息，具体信息可分为2大类：已知基因组物种信息和未知基因组物种信息。已知基因组物种信息：涉及数据库或《未来可能发生大流行新发病原体清单》《人间传染的病原微生物目录》《动物病原微生物分类名录》中已收录的微生物，这类信号主要包括：（1）检出已知的动物病原体（如禽流感病毒H3N8）；（2）在非流行区域检出特定病原体（如基孔肯雅病毒）；（3）检出未有人类感染案例的微生物（如半干旱伯克霍尔德菌）等。这类异常信号处理应着重于检测结果质量控制和测序信息验证，通过严格的质控程序排除实验室污染和生物信息学分析比对的错误，并深入分析患者流行病学史和临床表现，必要时寻求病理学证据，评估与检出病原体的关联性。未知基因组物种信息：提示可能存在参考数据库未收录的新病原体，主要包括：（1）存在大量无法归类序列；（2）多个近缘物种同时检出且无明显优势物种，序列相似度较低；（3）检出已知物种但序列相似度低于特定阈值；（4）检出已知病原体但序列在基因组上分布过度集中。这些异常信号可能单个或多个同时出现。具体新发病原体mNGS信息识别案例示意如下：1.提示未知病原体可能：以检出新型冠状病毒

［

17］

为例，临床信息为疑似出现聚集性病例，mNGS信息为序列比对至严重急性呼吸窘迫综合征相关病毒，但鉴定置信度、序列比对相似度、病毒全基因组覆盖度均低，全基因组序列覆盖图不均匀。2.提示新亚型或株系可能：以检出新型腺病毒D116

［

18］

为例，临床信息为患者出现“不明原因脑炎”症状，mNGS信息为患者脑脊液标本检出高丰度腺病毒序列，且经BLAST后序列无法与已知腺病毒序列100%匹配。3.提示播散至新的地区或动物溢出：以检出首例人感染禽流感病毒H3N8

［

19］

为例，临床信息为患者存在家禽饲养史和接触史，mNGS信息为患者肺泡灌洗液和血液标本检出大量甲型流感病毒，但每种型别检出无显著区分度，经BLAST后无法与已知流感病毒序列100%匹配。经短序列与甲型流感病毒分型数据库比对及组装序列BLAST比对溯源分析，提示HA基因分型最优结果为H3，NA基因分型最优结果为N8，综合疑似为禽源H3N8病毒。4.已知微生物首次报道感染人类：以检出首例人感染植物病原体半干旱伯克霍尔德菌为例，临床信息为患者3年内反复咳嗽、有大量咳痰和胸痛病史，既往mNGS和培养提示洋葱伯克霍尔德菌复合群，临床针对性治疗后患者仍有复发，且病情进展

［

20］

。mNGS信息为伯克霍尔德菌属水平序列数显著高于种水平，即超一半序列比对上伯克霍尔德菌属特异性序列，但剩余序列无法明确归类至种水平。解读人员发现上述可疑信息后，应进一步分析以确认序列准确性，具体分析确认关键点见质量控制部分，并同步查询已有文献，寻找佐证信息

［

20］

。问题5：如何基于mNGS信息开展更深入的生物信息分析，以识别和提示新发病原体？共识5：若出现新发病原体的可疑信息，则应启动相应的生物信息学分析流程进行排查。建议首先扩展参考数据库范围进行全面比对，若可疑信息仍未得到合理解释，则进一步开展序列组装、核酸和蛋白质水平的相似性分析及系统发育树分析等综合性分析。对于复杂或难以判定的情况，建议寻求专业生物信息学团队的技术支持（证据级别5，强推荐）。在常规mNGS检测流程中，应首先判断检测结果是否存在明确的病原体。当检测结果显示存在明确病原体且无新发病原体相关信息时，可按常规流程进行报告。若出现可疑信息，包括已知基因组物种的可疑信息或疑似未知基因组物种的可疑信息，则需启动深入分析流程。对于提示新发病原体可疑信息的标本，首先应扩大参考数据库范围，排除自建数据库未收录但已知的物种。推荐优先使用南湖实验室“病原体快速识别与智能鉴定系统（GPAS）”（

https：//）进行快速全面筛选，该系统无需专业生物信息学背景，直接上传测序数据即可一键分析得出检测结果，但检测结果仍需生物信息人员进一步确认，以排除假阳性。有较强生信专业能力的检测机构可使用GenBank或RefSeq等综合型数据库或多数据库收集相关序列，自建全面的微生物参考数据库进行全面比对排查；或使用Kraken2配合相应数据库（如Standard用于细菌、病毒，PlusPF用于真菌、寄生虫）进行全面筛查。扩大数据库比对应采用合理的参数设置，在保证特异性的同时适当降低严格度，以捕获与已知物种相似度较低的序列。若扩大数据库比对后发现为已知物种，则按常规流程处理；若仍存在可疑信息，则可进行序列组装等更深入的分析。组装分析是识别新发病原体的关键步骤。建议采用SPAdes、MEGAHIT等工具对非宿主序列进行从头组装，获得更长的连续序列以提升比对和分类的准确性。组装序列可通过BLAST与NCBINucleotide（nt）数据库进行比对，必要时降低一致性阈值以发现远缘物种。若存在近缘物种，可进一步提取相关序列，利用mafft或MEGA等软件进行多序列比对，并用RAxML或IQ-TREE等工具构建系统发育树，综合评估其分类地位和进化关系。若无近缘物种，可尝试使用DIAMOND对NCBInon-redundantproteinsequences（nr）数据库进行蛋白质水平比对，以发现更远缘的相关性。经上述综合分析后（

图2

），对于高度怀疑的新发病原体可疑信息，应根据病毒、细菌、真菌等不同类型，采取针对性的进一步分析和确认措施。分析过程中如遇复杂或难以判定的情况，建议及时引入专业生物信息学团队提供技术支持。图2

疑似新发病原体信息分析流程图六、新发病原体的类型与初步鉴定标准问题6：如何基于mNGS结果初步鉴定不同种类的新发病原体？共识6：新发病毒的鉴定应遵循国际病毒分类委员会（ICTV）的分类标准，结合全基因组序列相似性分析、系统发育分析和病毒特异性基因组特征进行综合判断。对于不同病毒家族，应采用相应的分类标准进行评估（证据级别4，强推荐）。病毒是引起新发传染病的主要病原体类型。由于病毒基因组小、变异快，且不同病毒家族的分类标准各异，其鉴定需要综合考虑序列相似性、基因组结构和功能特征

［

21］

。国际病毒分类委员会（ICTV）为不同病毒家族制定了特定的分类标准，是病毒分类的权威依据

［

22］

。依据ICTV制定的分类标准，不同病毒家族的新种/亚型鉴定标准各异，例如：（1）冠状病毒：RdRp序列相似性<90%可考虑为新种；（2）甲型流感病毒：为单一物种，但有多种亚型，不同亚型主要依据其表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的组合（如H1N1、H3N2），并结合宿主来源进行综合判定；（3）腺病毒：DNA聚合酶氨基酸序列相似性<95%可考虑为新种

［

23］

。此外，还应关注病毒特异性基因结构（如开放阅读框、调控元件）、功能区段（如受体结合域）、基因组重组事件和病毒复制策略等特征。新发病毒鉴定技术方案包括：（1）完整基因组获取：由于病毒基因组相对较小，使用mNGS测序数据进行序列组装有获取病毒近乎完整的基因组序列的可能，若无法组装出有效序列，或组装序列不完整，可通过加大测序数据量等方式获取足够的数据。建议测序深度大于100×，若实在无法获得足够深度的也应至少大于10×，以确保组装序列的可靠性。（2）病毒专用数据库比对：获取基因组序列后可与ZOVER2.0

［

24］

、GISAID、RVDB等专业病毒数据库进行比对，搜索可能的物种或近缘物种。（3）病毒分类分析：通过核酸或蛋白序列与近缘物种分析，基于ICTV分类标准进行种属判定，系统发育分析是核心步骤，可基于全基因组或相关基因（如RdRp）构建系统发育树，建议Bootstrap>70%（基于1000次重复），推荐使用ModelFinder或IQ-TREE自动选择最优模型，以确保分类结果的可靠性。可根据分类结果所在科属已知的物种的特征进行初步的危害性评估。如有条件，还可进行更深入分析，例如：宿主预测、蛋白预测及功能分析、受体结合位点预测等分析，评估病毒潜在的宿主或中间宿主、传播途径、致病性、毒力及传播系数等。对于RNA病毒（如冠状病毒、流感病毒等），应特别关注基因组变异和重组事件，这些事件可能导致病毒的传播力、致病性和免疫逃逸能力发生显著变化。mNGS结果暂无法组装获取足够分析的基因组序列时，建议使用其他方法学实验验证，如病毒分离培养

［

25］

。共识7：mNGS结果提示疑似新发细菌（含支原体、衣原体、立克次体等）后，建议基于提示的细菌分类尝试分离培养。新发细菌的鉴定应基于全基因组序列分析（WGS），结合ANI、dDDH、分类标记基因分析（如16SrRNA、rpoB等）等指标，并参考表型特征进行综合判断（证据级别4，推荐）。细菌新种的鉴定传统上依赖于表型特征和16SrRNA基因序列分析，但随着全基因组测序技术的发展，基于基因组的分类方法已成为细菌分类的主流

［

26］

。细菌新种鉴定的主要标准包括：（1）ANI值<95%；（2）dDDH值<70%；（3）16SrRNA基因序列相似性<98.7%

［

27］

。此外，还应关注细菌的毒力因子、耐药基因和代谢特征等表型特征，特别是对于可能引起临床感染的病原菌

［

28］

。对于支原体、衣原体、立克次体等非典型病原体，由于其基因组较小且多为胞内寄生，分离培养困难，mNGS技术在其新种或新亚型识别中具有优势。其鉴定同样遵循原核生物分类原则。新发细菌鉴定技术方案：由于细菌基因组较大，使用mNGS结果获取完整细菌基因组可能性较低，因此建议基于mNGS结果提示的初步分类信息，尝试使用相应的培养基和培养条件进行分离培养，获取纯菌株后进行WGS检测以获取全基因组信息，具体包括：（1）分离培养；（2）全基因组测序：获取完整的基因组（建议测序深度不低于30×），并进行基因预测和注释；（3）初步分类：提取16SrRNA基因序列，与SILVA等数据进行比对，初步确定细菌的分类信息；（4）基因组相似性分析：根据初步分类信息，选择近缘物种计算ANI值和dDDH值，根据细菌新种判定标准确定是否为新物种；（5）系统发育分析：建议采用ANI或核心基因等构建系统发育树，Bootstrap>70%（1000次重复），以确保进化分支的稳定性；（6）功能基因组分析：与毒力、耐药等数据库进行比对，分析其毒力和耐药等特征，以评估危害性。对于难培养或不可培养的细菌（如上述非典型病原体），可通过湿实验环节加强去宿主或加大测序数据量，从宏基因组数据进行基因组重建和分类分析。共识8：mNGS结果提示疑似新发真菌后，测序覆盖度与深度足够时应基于ITS区、大亚基（LSU）、小亚基（SSU）、翻译延伸因子1α（TEF1-α）、RNA聚合酶Ⅱ第二大亚基（RPB2）、β-微管蛋白（β-tubulin）等标记基因分析；测序覆盖或深度不足时，建议结合全基因组比对结果和形态学特征进行综合评估（证据级别4，强推荐）。真菌新种的鉴定通常结合分子标记和形态学特征进行。ITS是几乎所有真菌通用的条形码序列，已被广泛接受为新种鉴定的首选标记，但对于某些真菌类群，需要结合其他标记基因进行分析

［

29］

。常用的标记基因或序列区域包括LSU/SSU、TEF1-α、RPB1/RPB2和β-tubulin。LSU和SSUrDNA常用于属或科等较高级分类层级的系统发育分析，起到辅助构建系统树的作用。TEF1-α（转录延伸因子）在子囊菌和链格孢属等真菌中具有较好的分辨能力，常用于区分形态相近的种。RPB1和RPB2（RNA聚合酶亚基）适用于多种真菌，可为系统发育树提供更高的稳定性和支持率。而β-tubulin基因在曲霉属、青霉属等真菌中表现出良好的区分近缘种的能力。因此，实际研究中常采用多个基因的联合分析，以提高新种鉴定的准确性与可靠性。真菌新种鉴定的主要标准包括：（1）ITS区序列相似性低于特定分类阈值（通常为97%~98.5%，但需结合具体类群的种内变异范围）；（2）多基因联合分析显示与已知种有明显的遗传距离；（3）具有独特的形态学或生理特征

［

30］

。对于致病性真菌，还应关注与致病性相关的特征，如二型性转换、产毒能力等。在mNGS数据分析中，应注意真菌序列的覆盖度和均一性，以排除污染可能。新发真菌鉴定技术方案：由于真菌基因组较大，且已公开发表的真菌基因组较少，通过mNGS数据提示信息和鉴定新发真菌较为困难。若临床高度怀疑真菌或mNGS有提示信息，可优先尝试分离培养或直接基于原始标本进行补充分析，包括：（1）ITS测序：获取ITS序列，与UNITE数据库进行比对获取初步分类结果；（2）多基因联合分析：根据初步分类结果，选择合适的标记基因进行测序，构建系统发育树分析遗传距离；（3）全基因组测序：如能获取分离培养物，可进行全基因组测序，获取高质量基因组序列；（4）比较基因组分析：根据初步分类结果选择近缘种进行基因组比较分析等，初步确定与已知物种的遗传距离，确定是否为新种，并评估潜在致病性。有条件的实验室可开展功能基因分析、形态学分析等进一步验证（整体鉴定推荐标准见

表3

）。问题7：初步鉴定为疑似新发病原体后，如何保证结果的准确性？共识9：相较于常规已知病原体，新发病原体mNGS检测在满足各常规质量控制指标基础上，应特别强化生物信息分析阶段的质量控制，建立更严格的数据质量评估与结果复核体系，以确保检测结果的可靠性（强推荐）。整体而言，新发病原体鉴定需要遵循科赫法则，上报结果后需配合相关单位开展后续综合验证工作，可采取多种方法学，包括分子生物学验证、病原体分离培养和血清学验证等。对于在常规已知病原体质控基础上检出的高度疑似新发病原体结果，应制定并执行特殊的分析质控流程：（1）设置更严格的阳性判断标准（如基于序列数、覆盖度、序列比对相似度等综合设定的阳性阈判断标准）；（2）要求多种工具交叉验证；（3）进行不同参数设置下的稳健性测试；（4）由感染病学专家、临床微生物专家、流行病学专家、生物信息学专家等共同复核结果；（5）保存完整的原始数据和分析记录、专家复核意见等，便于追溯和复核。七、结果报告问题8：mNGS结果提示疑似新发病原体后应该如何进行结果报告？共识10：mNGS检出疑似新发病原体后需要审慎评估，建议首先从技术层面评估结果可信度（如测序深度、特异性、污染排查等），并通过多维度方法进行复核。若结果可信度较高则可及时与临床沟通，当检测结果与临床信息高度符合时可出具mNGS临时报告。对传播风险高的病原体需及时上报当地卫生主管部门和疾病预防控制中心。临时报告需提供患者基本信息、分析结果及证据等级、推荐验证方法等（推荐）。依据我国《生物安全法》第十七条关于生物安全信息发布制度的相关规定，新发突发病原体相关生物安全信息应由国家生物安全工作协调机制成员单位或国务院有关部门和县级以上地方人民政府及其有关部门根据职责权限发布。考虑新发病原体具有不确定性，潜在致病力强和传播风险高的特点，因此当临床实验室mNGS结果提示疑似新发病原体时需谨慎对待。一方面mNGS结果需要严格按照质量控制部分提及的方法进行复核，另一方面鉴于新发病原体需要更多的参考信息辅助诊断，在与临床沟通患者临床信息并评估符合度后，建议出具临时报告用于上报工作的开展（此报告模板可延用至部分罕见重大病原体报告，如狂犬病毒、炭疽芽孢杆菌等）。必要时采用专家组讨论的方式确定最终结论，以确保结果的科学性和临床相关性。另外，mNGS临时报告仅用于院内MDT讨论及CDC通报，不作为法定诊断依据，须后续培养或PCR确证。新发病原体mNGS特殊报告需包含以下核心内容（

图3

）。（1）基本信息：姓名、性别、年龄、所在医院及科室；（2）检测信息：检测编号、标本类型、检测流程、采样及检测日期；（3）检测结果：疑似新发病原体名称（可写“未命名”）、特异性序列数、鉴定置信度、比对信息（如参考基因组NCBI登录号、与其比对的ANI等）；（4）质控指标：数据量、Q30比率；（5）其他：如有条件可同时提供基因组覆盖度图等；（6）mNGS结果证据等级；（7）检测局限性等。图3

可疑新发病原体mNGS特殊报告模板参考问题9：在mNGS结果提示新发病原体后，实验室该如何保障生物安全？共识11：mNGS结果提示新发病原体后，需综合多方信息判断危害等级，若为高致病性或高传染性病原体，实验室应通过立即封存标本/核酸、彻底消杀环境、监控暴露人员、升级实验室操作防护、加密存储测序数据等措施，阻断病原体扩散链，实现生物安全闭环管理（强推荐）。在mNGS结果提示新发病原体后，实验室应根据病原体致病性或传染性启动相应实验室应急响应程序，按以下操作保障生物安全：（1）标本紧急封存：立即将原始标本及核酸提取物双重密封于防漏容器（贴生物危险标识），未灭活标本保存于-80℃或液氮，已灭活标本经高压灭菌后移交参比实验室

［

31］

；（2）实验室全面消杀：污染区域用含氯消毒剂（有效氯浓度5000~10000mg/L）作用30min，空气采用过氧化氢雾化消毒，仪器表面以75%乙醇擦拭，消杀后需环境核酸采样验证

［

32］

；（3）实验人员隔离管理：暴露人员立即禁止离开疫区，实施单间隔离医学观察≥14d，每日监测症状并行血清学/病原学筛查；（4）实验操作人员个人防护升级：如有后续操作，对于一般致病性或一般传染性新发病原体，需确保在Ⅱ级生物安全柜内进行，操作人员需佩戴N95口罩及双层手套，必要时升级为穿戴正压防护头罩或正压防护服，匹配相应生物安全防护水平。对于高致病性或高传染性新发病原体，应将标本封存，按照高等级病原体运输要求，将标本送至高等级生物安全实验室进行后续操作；（5）数据与信息安全：按照各单位伦理委员会的要求，保护患者隐私安全，测序数据本地加密存储，数据存储与共享严格遵守伦理审查流程，结果由生物安全委员会审核后上报CDC，严禁未经授权披露

［

33］

。八、规范化管理问题10：mNGS检出新发病原体后，如何开展后续工作及规范化管理？共识12：对于高度怀疑的新发病原体感染，需考虑公共卫生防控需求，根据所在医院及疾控中心相关管理规定，建立“验证-防控-上报-协同”全流程管理机制，进行上报并协助后续验证工作。完整记录实验过程，规范保存标本及数据，促进新发病原体早期识别和联合应对。临床处置需采用积极谨慎的策略，结合病原体特性和患者状况制定个体化治疗方案（证据级别5，强推荐）。根据我国原卫生部《医院感染管理办法》、《医院感染暴发报告及处置管理规范》、医院处理预案等相关规定的要求，mNGS检出新发病原体后，临床实验室的规范化管理至关重要，直接关系到结果准确性、临床决策有效性、生物安全防控、公共卫生响应和政策合规性。规范化管理关键环节包括：（1）mNGS结果验证与确认；（2）风险评估和相应生物安全措施及临床处置；（3）信息报告与共享机制；（4）详尽记录、妥善保存标本，配合各部门工作同时注意数据安全管理。其中，新发病原体信息报告与共享机制应包括：（1）内部报告流程，确保实验室检出的疑似新发病原体及时得到验证、并报告给相关部门；（2）专家评估流程，组织专家对报告结果进行评估和确认；（3）外部报告渠道，按照相关规定向上级卫生行政部门报告；（4）数据共享平台，在确保患者隐私的前提下共享相关信息和数据；（5）标本保存制度，妥善保存相关标本用于进一步研究和验证

［

34］

。当mNGS结果提示可能存在新发病原体时，应基于患者临床表现、是否出现聚集性感染，以及疑似新发病原体特点（如基因组与已知近缘物种相似，不排除其与已知病原存在同等生物风险）、致病性、传播性等，初判其危害等级，并采取相应的临床处置策略，包括：（1）根据最相近已知病原体的特性，选择可能有效的抗感染药物或支持性治疗；（2）密切监测患者病情变化和治疗反应；（3）采取适当的感染控制措施，防止院内传播；（4）组织多学科专家会诊，制定个体化治疗方案；（5）临床处置过程中，应保持与实验室的密切沟通，根据后续检测结果及时调整治疗方案

［

35］

。另外，对于潜在的高致病性新发病原体，应建立快速响应、限时上报机制，包括应急专家组、优先分析流程、快速报告通道和应急处置预案等，确保信息及时传递和应对措施及时启动，最大限度减少公共卫生风