大豆GmFTSH基因的克隆及生物信息学分析

V第一章前言大豆是全球重要的经济作物和植物蛋白来源，产量受光合作用效率影响，抗逆性也受光合作用效率影响，叶绿体是光合作用主要场所，维持叶绿体内部平衡很重要，这对植物生长发育很关键。然而，由于其特殊的半自主性质，其中的蛋白质由核基因和叶绿体基因编码，这导致需要对大多数蛋白质进行再加工以及降解过量和受损的蛋白质[2]。作为平衡蛋白质合成和水解的关键因素，叶绿体蛋白酶对于叶绿体内的光合作用和其他生化过程是必不可少的[3][8]。在高等植物中，已经鉴定了三种主要的叶绿体蛋白酶：Clp（酪蛋白水解蛋白酶）、Deg（周质蛋白降解）及FtsH（成丝温度敏感性H）[4]。FtsH蛋白酶是ATP依赖性的，它是一种金属蛋白酶，它与内体结合，它具有蛋白水解活性，它还具有分子伴侣活性[5]，FtsH基因最初被发现，它通过化学诱变获得，它被命名为温度敏感性纤维状突变体ftsh1[6]，叶绿体是植物光合作用的场所，它是主要场所，维持内部动态平衡很重要，这对植物生长发育至关重要，光合系统II是核心复合体，它位于光合作用光反应阶段。但在强光、高温等逆境条件下，PSII核心蛋白D1易发生光氧化损伤，导致光抑制，进而降低光合效率并威胁作物产量。植物通过激活PSII修复机制清除受损D1蛋白并重新组装功能复合体，以维持光合机构的正常功能。在这一过程中，FTSH蛋白酶家族因其ATP和Zn²⁺依赖的蛋白水解活性及分子伴侣功能，被认为是PSII修复的关键执行者，尤其在D1蛋白的靶向降解中发挥核心作用。目前，FTSH基因的功能已在拟南芥、水稻等模式植物中广泛研究，但其在大豆中的同源基因GmFTSH的功能特性与调控机制仍缺乏系统解析。大豆作为对光抑制敏感的作物，解析GmFTSH基因在光胁迫响应中的分子机制，对提高其光合效率及抗逆性具有重要应用价值。此外，GmFTSH蛋白是否具有独特的结构特征或调控元件，以及其表达模式如何响应环境胁迫，仍需通过基因克隆与生物信息学分析进一步阐明。FtsH蛋白酶是ATP依赖性的，它是一种金属蛋白酶，它与内体结合，它具有蛋白水解活性，它还具有分子伴侣活性[5]，FtsH基因最初被发现，它通过化学诱变获得，它被命名为温度敏感性纤维状突变体ftsh1[6]，叶绿体是植物光合作用的场所，它是主要场所，维持内部动态平衡很重要，这对植物生长发育至关重要，光合系统II是核心复合体，它位于光合作用光反应阶段。FTSH基因家族广泛存在，存在于真核生物中，也存在于原核生物中，它们是膜结合蛋白酶，属于AAA+蛋白酶超家族，其成员通常具有蛋白酶活性，这种活性依赖ATP，它们参与细胞内蛋白质质量控制，例如降解错误折叠蛋白，还参与膜蛋白组装，也参与膜蛋白修复。在植物中，FTSH蛋白酶在叶绿体发育、光合作用调控、胁迫响应等方面发挥重要作用[13]。植物FtsH基因首先在菠菜叶中鉴定，随后在几个物种中发现，包括烟草，拟南芥和水稻。其编码的蛋白质通常定位于叶绿体和线粒体膜上。大多数成员已被证明影响叶绿体发育和体内平衡，包括参与生物过程，如囊泡形成，PSII光损伤修复[14]，PSI复合物的早期组装[15]，细胞色素b6f复合物亚基的降解[16]和热胁迫下的ATP合酶组装[17]，并对植物表型变化有直接影响。先前的研究发现，删除AtFtsH2（var2）和AtFtsH5（var1）会导致活性氧的增加。在拟南芥中形成白化病斑点叶[18]，而AtFtsH12和AtFtsHi1的敲低直接导致拟南芥胚胎死亡[19][20]，不仅如此，在其他物种中也发现了类似的表型：NtFtsH1的NtFtsH2和RNA干扰系表现为淡黄色异染色的烟草叶;osftsh2敲除突变体水稻不仅产生白化病叶，而且不能生长到三叶期。此外，FtsH蛋白酶对于增加作物产量、耐热性、耐盐性和耐旱性是重要的。大豆是一种重要的油籽经济作物，属于豆科一年生植物，主要生长在中国、印度、美国、巴西和阿根廷。有几个因素影响其生长，发育状态和产量，其中最重要的是光合作用和光照水平。先前的研究表明，增加光合作用相关基因的表达可以提高大豆的光合作用，同时增加种子产量。然而，大豆叶片光合作用的调控机制仍不清楚，特别是FtsH家族介导的途径，本研究对大豆FtsH基因家族进行了系统分析，包括系统发育关系，包括启动子元件，包括染色体定位，进一步研究了进化关系，研究了大豆与其他物种的关系。本论文将克隆大豆GmFTSH家族的部分基因，对该基因家族进行系统发育关系分析，分析基因染色体定位，研究启动子顺式作用元件，为后续研究奠定基础，进一步探讨GmFtsH基因的作用机制，重点研究其在大豆叶片发育中的功能。 第二章材料与方法2.1材料与方法2.1.1大豆GmFTSH基因的克隆（1）大豆总RNA的提取冻存大豆根和叶片样本，在液氮低温下研磨，使用RNAisoPlus试剂提取总RNA，试剂由Takara生产，用Nanodrop2000分光光度计检测RNA，分光光度计由Thermo生产，检测RNA浓度和质量，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量[13]。（2）合成大豆cRNA取1μg总RNA，使用PrimeScriptTMRTreagentKit，该试剂来自Takara，合成第一链cDNA。（3）大豆GmFTSH基因PCR扩增其全长序列以大豆根或叶的cDNA为模板，用引物设计软件设计引物，引物位置在基因开放阅读框的起始密码子处，引物也设计在终止密码子处，通过PCR扩增获得GmFtsH基因，得到GmFtsH基因的全长序列。（4）大豆GmFTSH基因的克隆电泳验证产物大小，确认扩增正确，切胶回收目的条带，连接T克隆载体，用热激法转化，转入大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选，初步选择阳性克隆，挑取白斑菌落，进行PCR鉴定，质粒酶切鉴定，测序确认，比对同源序列，分析测序结果，确认测序正确，保存于-80℃冰箱。2.1.2大豆GmFTSH系统发育关系的分析系统发育树是一种方法，它用于生物信息学，用来描述不同生物的关系，系统学分类分析很有用，它能帮助人们了解生物进化历史过程。使用ClustalW进行大豆、拟南芥、水稻和烟草FtsH蛋白的多重序列比较，并使用MEGA11（10.2.6）进行邻居-联合聚类分析（Bootstrap=5000）[10]。（1）多序列对比本实验主要对大豆、拟南芥、水稻和烟草FTSH蛋白的多序列比较.（2）多邻域聚类分析MEGA11(10.2.6）利用MEGA11软件进行DNA、RNA序列的解析。（3）系统发育树修饰https://www.chiplot2.1.3大豆GmFTSH基因染色体定位分析为了找出GmFtsH在染色体上的位置，将大豆基因组注释文件从TBtools-II（v2.012）的GTF/GFF程序加载到GeneLocationVisualize上[9]。使用AdvancedCircos程序完成基因重复事件分析，使用TBtools-II（v2.012）的DualSyntenyPlot程序完成多物种协方差分析[10]。（1）基因重复事件分析AdvancedCircos主要用于展示基因组、染色体和其他环形数据的关联关系。（2）多物种协方差分析Btools-II(v2.012)的DualSyntenyPlot2.1.4大豆GmFTSH启动子顺式作用元件分析从Phytozome数据库获得GmFtsH的2000bp上游序列，并使用PlantCARE数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/，分析顺式作用元件。顺式作用元件通过MicrosoftExcel2019可视化[11]。（1）GmFtsH上游2000bp序列的获取Phytozome数据库，打开TBtools，使用gff3序列提取工具，并设置到，只提取CDS上游2000bp的参数。（2）启动子顺式作用元件的分析http://bioinformatics.psb.ugent提交到PlantCare网站进行顺势作用元件预测，设置邮箱，选择要上传的文件，点击上传，静等邮件。（3）顺式作用元件可视化第三章结果与分析3.1大豆GmFTSH基因的克隆冻存大豆根和叶片样本，在液氮低温下研磨，使用RNAisoPlus试剂提取总RNA，试剂由Takara生产，用Nanodrop2000分光光度计检测RNA，分光光度计由Thermo生产，检测RNA浓度和质量，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量[13]。图1大豆GmFTSH基因克隆的电泳图像3.2大豆GmFTSH系统发育关系的分析为了研究GmFtsH基因的系统发育关系，我们使用拟南芥（17）、水稻（9）、烟草（20）和大豆（Glycinemax）的FtsH蛋白序列构建系统发育树。通过比较4个种的80个FtsH基因的全长蛋白质序列，将这些基因分为5个组。其中NaFtsHi52-1,NaFtsHi10-1,GmFtsH12,GmFtsH17,GmFtsH23,GmFtsH10,AtFstH6,NaFstH6-1,OsFstH6这9条基因单独分支，说明其进化具有高度保守性，所以本研究将其分为一组。另外其他组别分别含有24，8，15和19个FtsH基因。这一结果，沿着多个序列比对结果，表明这四种植物的这些成员可能经历了相似的进化模式。在进化树中也存在分布不均的现象，AtFtsH和GmFtsH聚在一起的数量较多，同一亚科成员的基因结构相似，表明拟南芥和大豆FtsH基因的进化关系可能更近。图2大豆、水稻、拟南芥和烟草中FtsH基因家族的系统发生树。使用MEGAX11构建系统发育树（5000个bootstrap重复）。不同颜色的类别代表不同的群组。以“Gm”开头的基因代表大豆的基因，“At”代表拟南芥的基因，“Os”代表水稻的基因，“Nt”代表烟草的基因。图3GmFtsH基因的系统发育关系分析3.3大豆GmFTSH基因染色体定位分析在大豆基因组注释的基础上，我们定位了GmFtsH基因在大豆染色体上的物理定位。34个GmFtsH基因不均匀分布在17条染色体上，其中GmFtsH11分布在Scaffold_25上，这可能是由于大豆进化过程中FtsH基因的重复造成的。基因重复是基因数量增加和进化创新的主要因素，因此我们对GmFtsH基因中的基因重复事件进行了分析。位于12号染色体上的GmFtsH6和GmFtsH7（Gm12）以及位于14号染色体上的GmFtsH19、GmFtsH20和GmFtsH21（Gm14）为串联重复序列。图4GmFtsH基因分析，分析染色体定位，分析基因重复，灰色线显示共线区组，共线区组位于大豆基因组，其他彩线显示基因对，这些基因对属于GmFtsH，内圈有热图，热图显示基因密度，基因密度在染色体上，图4展示这些内容大豆基因组中所有共线区组，其他彩色线代表重复的GmFtsH基因对，内圈的热图表示染色体基因密度。3.4大豆GmFTSH启动子顺式作用元件分析MicrosoftExcel2019，首先需要准备一个序列长度文件，所有都是2000bp的启动子序列，随后是使用上一步得到的顺势作用元件位置信息，打开TBtools进行可视化。图5GmFtsH基因启动子的顺式作用元件分析的示意图。预测结果表明，所有GmFtsHs均含有大量的CAAT盒和TATA盒，证明它们通常可以转录。此外，它们还含有5类胁迫相关因子，包括厌氧诱导性因子（71）、低温响应性因子（20）、防御和胁迫响应性因子（17）、干旱诱导性因子（14）和缺氧特异性诱导性因子（5）;有8类发育相关元件，包括光响应元件（423），还有细胞周期调控元件（3），种子特异性调控元件（3），分生组织表达元件（25），胚乳表达元件（6），昼夜节律控制元件（7），玉米醇溶蛋白代谢调节元件（18）。栅栏细胞分化元件（1），还有5类激素相关元件，包括脱落酸响应性元件（76），MeJA12响应性元件（66），赤霉素响应性元件（28），生长素响应性元件（17），水杨酸响应性元件，MeJA响应性元件（66），赤霉素响应性元件（28）、生长素响应性元件（17）和水杨酸响应性元件（20）。在这些顺式元件中，光响应元件（135）占最大类别，其次是脱落酸响应元件（76），占第二大类别。GmFtsH基因的启动子含有许多MeJA应答元件，提示GmFtsH基因的功能可能与损伤应答有关。此外，绝大多数GmFtsH基因包含MYB结合位点（239）和MYC结合位点（139）（图5）。以上结果表明，GmFtsH基因可能影响大豆的生长发育、多种激素和胁迫反应。第四章结论与展望本研究对GmFtsH基因家族进行了全面的分析。首先，根据拟南芥、水稻和烟草中FtsH基因的进化关系，利用系统发育树分析将已发现的34个GmFtsH基因分为5个类群分析表明GmFtsH基因高度保守，分析包括外显子-内含子结构，分析了保守结构域，分析了保守基序，这些分析在同一类群中进行，协方差分析有助于研究进化过程，分析包括种内和种间比较，启动子顺式作用元件被分析，大豆不同组织的基因表达被分析，结果表明GmFtsH基因可能重要。它可能参与植物生长发育，特别是叶片和叶绿体发育，GmFtsH13蛋白定位于叶绿体，这被我们演示，上述结果提供初步信息，GmFtsH基因可能影响大豆发育，这为未来研究打下基础，研究可关注叶片发育，也提供了科学依据，可用于研究GmFtsH的功能，也可研究其作用机制。参考文献[1]齐玉军.大豆GmFtsH基因的遗传转化及功能分析[D].南京农业大学,2012.[2]Rochaix,J.D.;Ramundo,S.Chloroplastsignalingandqualitycontrol.EssaysBiochem.2018,62,13–20.[CrossRef].[3]Adam,Z.;Clarke,A.K.Cuttingedgeofchloroplastproteolysis.TrendsPlantSci.2002,7,451–456.[CrossRef][PubMed].[4]Nishimura,K.;Kato,Y.;Sakamoto,W.EssentialsofProteolyticMachineriesinChloroplasts.Mol.Plant2017,10,4–19.[CrossRef].[5]Nishimura,K.;Kato,Y.;Sakamoto,W.ChloroplastProteases:UpdatesonProteolysiswithinandacrossSuborganellarCompart-ments.PlantPhysiol.2016,171,2280–2293.[CrossRef].[6]Schumann,W.FtsH—Asingle-chaincharonin?FEMSMicrobiol.Rev.1999,23,1–11.[CrossRef].[7]Guo,Z.H.;Gao,X.;Cai,H.Q.;Yu,L.;Gu,C.;Zhang,S.L.Genome-wideidentification,evolutionandexpressionanalysisoftheFtsHgeneduringfruitdevelopmentinpear(Pyrusbretschneideri).PlantBiotechnol.Rep.2021,4,537–550.[CrossRef][8].Adam,Z.Chloroplastproteases:Possibleregulatorsofgeneexpression?Biochimie2000,82,647–654.[9].Chen,C.;Chen,H.;Zhang,Y.;Thomas,H.R.;Frank,M.H.;He,Y.;Xia,R.TBtools:AnIntegrativeToolkitDevelopedforInteractiveAnalysesofBigBiologicalData.Mol.Plant2020,13,1194–1202.[10].Kumar,S.;Stecher,G.;Li,M.;Knyaz,C.;Tamura,K.MEGAX:MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysisacrossComputingPlatforms.Mol.Biol.Evol.2018,35,1547–1549.[11].Lescot,M.;Déhais,P.;Thijs,G.;Marchal,K.;Moreau,Y.;VandePeer,Y.;Rouzé,P.;Rombauts,S.PlantCARE,adatabaseofplantcis-actingregulato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