大片吸虫TPx-1克隆载体的构建

前言大片吸虫（Fasciolagigantica）是片形吸虫病（Fascioliasis）病原的一种，虫体外形扁平叶状，比肝片吸虫大，有头锥后端宽钝，两侧缘呈现平行，腹吸盘比口吸盘约大1.5倍，虫卵为长卵圆形呈现黄褐色，长为150～190μm，宽为75～95μmREF_Ref2054751504\w\h[1]。大片吸虫主要通过植物传播到草食性动物，感染率高达20%～80%，最终通过食物源感染人，是一种危害严重的人畜共患传染病，也严重危害畜牧业的发展。中间宿主是椎实螺科的淡水螺耳萝卜螺和小土窝螺，终末宿主主要是反刍动物，患畜不断向外界排出大量虫卵从而发生大面积感染REF_Ref1159156268\w\h[2]。大片吸虫常使宿主发生肝胆系统炎症，随后出现系统性中毒反应和营养障碍，甚至造成群体性致死现象REF_Ref76020854\w\h[3]。慢性病程中导致牛羊衰弱、贫血、消瘦、下颌水肿、发育障碍，生产力下降REF_Ref76205731\w\h[4]。据估计，对人类来说，全球有240万到1700万人被感染REF_Ref76323380\w\h[5]；对反刍动物来说，在发达国家和发展中国家中有10-80%的奶牛和肉牛群被感染。Charlier等人对欧洲每年因寄生虫感染造成的经济损失中提到，大片吸虫每年约有7.5亿美元的经济损失，对畜牧业尤其是乳品和肉牛行业影响重大REF_Ref2055238907\w\h[6]。大片吸虫经常性发生于低洼、潮湿和多沼泽的地区，多雨地区更是促进本病的流行与发展，常呈地方性流行，在中国常发生于华南、华北和中南地区，是分布最广泛且危害最严重的寄生虫病之一REF_Ref76625906\w\h[7]。综上所述，大片吸虫对畜牧业造成的经济损失是巨大的，也危害了人类的身体健康，做好监测和预防是应对吸虫病最有效的措施。临床常用三氯苯达唑来治疗吸虫病，但大片吸虫对该药物出现了耐药性，迫切需要寻找新的药物靶点。大片吸虫入侵宿主需要大量蛋白质分子参与，大片吸虫能分泌大量的蛋白分子直接作用于免疫系统，其中有研究发现硫氧还蛋白过氧化物酶（TPx或Prx）在寄生虫感染中起到重要作用REF_Ref2055810345\w\h[8]。硫氧还蛋白过氧化物酶是含硒酶，与硫氧还蛋白（TRx）、NADPH三者共同组成硫氧还蛋白系统，在调控肿瘤相关生物学过程中发挥关键作用，包括影响细胞增殖、凋亡及信号传导等途径REF_Ref1469136277\w\h[9]。寄生虫体内氧化应激防御机制有硫氧还蛋白过氧化酶参与，通过维持细胞内氧化还原稳态、抑制宿主免疫细胞产生的活性氧而免疫逃避以及保护寄生虫免受氧化损伤等使寄生虫顺利进入宿主体内REF_Ref1487702340\w\h[10REF_Ref1487870410\w\h-11]。ChenD等人通过将rFgTPx蛋白与山羊PBMC结合，最终得出rFgTPx能与大量靶细胞发生相互作用进而促进大片吸虫更好的寄生在宿主体内这一机制REF_Ref1490761214\w\h[12]。Prx蛋白在硫代霉素和谷胱甘肽存在下具有酶活性，能解毒过氧化氢保护质粒DNA免受氧化损伤。SangpairojK等人以抗rFgPrx-2的抗体为探针，在大片形吸虫的各个发育阶段均检测到分子量为25kDa的天然FgPrx，原生FgPrxs浓度在各时期均呈上升趋势，在成虫期达到最高，感染小鼠后在小鼠血清中发现rFgTPx的天然抗体，得出未来研究疫苗和药物的方向REF_Ref2056096064\w\h[13]。FonsecaC.T.等人发现TPx-1主要在寄生虫成幼虫的外胚膜中表达，能直接接触宿主免疫系统使该蛋白质成为血清学诊断的良好抗原REF_Ref2056230520\w\h[14]。本文主要通过PCR技术克隆FgTPx-1基因，并连接pMD19-T，构建克隆载体，为进一步研究FgTPx-1蛋白的表达奠定基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1质粒和菌种表1质粒和菌种项目购买公司大片吸虫cDNA模版河南科技学院动物科技学院实验室pMD19-T载体TaKaRa有限公司1.1.2试验试剂表2试验试剂主要试剂和酶购买公司PCR纯化试剂盒上海起福科技有限公司DNA小量纯化试剂盒上海起福科技有限公司质粒提取试剂盒上海起福科技有限公司DH5α感受态细胞TaKaRa有限公司限制性内切酶XhoI和EcoRITaKaRa有限公司DNAMarkerTaKaRa有限公司高保真PCRMastMixTaKaRa有限公司1.1.3试验仪器设备表3试验试剂试验仪器设备购买公司PCR仪德国BIOMETRA公司高速低温台式离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司凝胶成像分析仪北京君意东方电泳仪器有限公司超纯水器成都超纯科技有限公司恒温振荡器上海恒一科学仪器有限公司双人超净工作台苏州净化设备有限公司电子天秤上海光正医疗仪器有限公司琼脂糖凝胶电泳槽北京六一仪器厂DYY-12型电泳仪电源北京六一仪器厂1.1.4相关试剂配制（1）50×TAE缓冲液：表450×TAE缓冲液的配制组分用量Tris碱242g乙二胺四乙酸二钠37.2g冰醋酸57.1ml0.5MEDTA溶液（pH8.0）100mlddH2O定容至1L混匀后室温保存。1×TAE缓冲液：取上述缓冲液用ddH2O稀释50倍。（2）LB液体培养液表5LB液体培养液的配制组分用量酵母提取物5gNaCl10g胰蛋白胨10g去离子水定容至1L混匀，培养基高温高压灭菌后，室温保存。（3）LB固体培养基（含抗生素）在LB液体溶液中加1.5%琼脂粉，培养基高温高压灭菌后冷却至50-60℃，按1:1000比例加氨苄青霉素（A+）抗生素，充分混匀并铺制平皿中，冷却凝固后置于4℃条件下保存，一个月内使用。（4）1%琼脂糖凝胶的制备取100mL的1×TAE缓冲溶液中加入1g琼脂糖，微波炉中加热3min，使琼脂糖完全融化，稍稍冷却后加Goldview。1.2试验方法1.2.1引物设计以大片吸虫基因组cDNA为PCR模版，根据NCBI数据库中大片吸虫TPx-1基因序列用primer6.0软件进行PCR引物设计。如表6所示。分别选取EcoRI和XhoI作为上、下游引物中的酶切位点（下划线为酶切位点）。

表6引物碱基对信息引物A+T(%)C+G（%）EcoRI54.1745.83XhoI47.6252.38上游引物（P1）：GCGGAATTCATGTGTGATCGCGAACAGEcoRI下游引物（P2）：GCGCTCGAGCTAGTTGACTGAGGAGAXhoI1.2.2PCR扩增PCR扩增体系为：表7PCR扩增体系组分用量（μL）dNTPmixture210×TaqBuffer2.5Ex-Taq酶0.5Primers（P1＋P2）2cDNA2ddH2O16Total25PCR扩增程序为：表8PCR扩增程序温度时间955min30cycycles9530cycycles50s5530s722min7210min反应结束并放置于4℃保存。最后用琼脂糖凝胶电泳仪进行观察。1.2.3凝胶电泳（1）1%琼脂糖凝胶倒入插好梳子的胶槽，完全凝固后拔掉梳子；（2）将凝胶放入电泳槽，加电泳缓冲液；（3）加5μLDNA和1μLDNA上样缓冲液于PCR管，混匀。（4）加3μLDL2000maker于点样孔内，再将混合液加入另一点样孔，以确保等速度电泳；（5）保持恒定电压150V，注意正负极方向，等待30min。用凝胶成像仪观察并拍照记录。1.2.4PCR纯化回收（1）将PCR产物按照1:3的比例与BufferDB混合，反复加热融化后转移至离心柱，套入废液管，12000rpm离心2min，弃废液；（2）加500μL漂洗液于离心柱中，套入废液管，12000rpm离心30s，弃废液，重复一次；（3）12000rpm离心2min，将离心柱套入1.5mLEP管，向离心柱滤膜中加20μLddH2O，静置1min；（4）12000rpm离心2min，将1.5mLEP管的回收产物再次滴入离心柱中央滤膜上，静置1min；（5）12000rpm离心2min，收集产物至1.5mLEP管中；（6）最后用电泳凝胶法验证纯化的产物。1.2.5连接pMD19-T载体表9连接体系组分用量（μL）pMD19-T载体0.5PCR纯化产物4.5SolutionI5总体积10取上述溶液，摇晃混匀后，在4℃条件下过夜。1.2.6转化取DH5α感受态细胞100μL，加入连接体系冰浴30min冰浴30min，42℃水浴锅中热激90s，冰浴2min加入400μLLB新鲜培养液均匀涂布于LB固体培养基中（含抗生素A+）a均匀涂布于LB固体培养基中（含抗生素A+）a取200μL上述转化液37℃37℃恒温摇床上，150rpm振荡培养1h倒置平板，恒温培养箱37℃培养12h倒置平板，恒温培养箱37℃培养12h1.2.7筛选阳性克隆（1）在超净台中，取15个含有5mLLB液体培养基的试管，按照1～15顺序依次标记序号，分别加入抗生素（1:1000的氨苄霉素）；（2）用高压灭菌枪头轻触单个菌落中心，蘸取少量菌体，直接插入EP管中，吹打混匀后封闭管口；（3）挑取15个单克隆，将EP管在37℃250rpm振荡培养4h；1.2.8菌液PCR鉴定菌液PCR反应体系如表9。表10菌液PCR反应体系组分用量（μL）2×TaqMasterMix12.5Primers（P1＋P2）2模版菌液2ddH2O8.5Total25PCR扩增程序与1.2.2相同。1.2.9质粒提取（1）取上述产物1mL于EP管中，12000rpm离心1min，弃上清收集菌体沉淀；（2）加SolutionⅠ250μL，吹打重悬；（3）加SolutionⅡ250μL，轻揉颠倒混匀4次，待溶液由浑浊变得透明粘稠，在冰上冰浴3min避免振荡；（4）加SolutionⅢ350μL，快速颠倒混匀6次，待溶液出现白色絮状沉淀，冰浴5min；（5）12000rpm离心10min，离心去杂质保留上层清液并倒入吸附柱中；（6）加500μL漂洗液，12000rpm离心2min，弃废液，重复一次；（7）将吸附柱转移至新离心管，加30μL65℃EB缓冲液，静置1min，12000rpm离心1min。1.2.10双酶切反应双酶切反应体系如表11。表11双酶切反应体系组分用量（μL）质粒DNA7限制性内切酶XhoI1限制性内切酶EcoRI110×Kbuffer1总计10将上述反应体系进行孵育反应，37℃，4h琼脂糖凝胶电泳鉴定。2结果与分析2.1PCR扩增FgTPx-1用琼脂糖凝胶电泳技术确认PCR产物是否扩增FgTPx-1基因片段，结果如图1所示，表明成功扩增。 图1PCR纯化产物电泳检测图谱M：DL2000Maker；1：FgTPx-1基因2.2转化纯化PCR产物连接pMD19-T载体，加入DH5α感受态细胞中，经转化涂板得到单菌落，结果如图2所示。图2TPx-1-pMD19-T载体基因的涂布板2.3菌液PCR鉴定单克隆后菌液PCR鉴定结果如图3所示，15个单克隆扩增出5个样品。图3菌液PCR鉴定电泳检测图谱M：DL2000Maker；1、2、3、4、5：TPx-1阳性克隆2.4双酶切鉴定对上述5个样品进行质粒提取，其双酶切鉴定结果如图4所示，表明成功构建TPx-1-pMD19-T克隆载体，对正确质粒送公司测序。图4双酶切PCRM：DL2000Maker；1：未酶切的FgTPx-1-pMD19-T；2：双酶切后FgTPx-1-pMD19-T载体基因3讨论对于大片吸虫的免疫预防，临床上常使用驱虫的方法，也是最有效的措施，常用药物有三氯苯达唑、硝氯酚、丙硫咪唑等，极大程度上降低了寄生虫病的发生REF_Ref876678810\w\h[15]。目前大片吸虫研究焦点主要在于疫苗研发方面，可考虑向多抗原联合疫苗（重组蛋白）、纳米载体递送DNA疫苗、CRISPR基因编辑（减毒活疫苗）等方向研究。根据研究显示，螺旋毛滴虫是引起滴虫病的致病因子，螺旋毛滴虫的TPx基因可以增加CD4+T细胞的数量，通过介导蠕虫从宿主中驱逐来防止螺旋杆菌感染，在防治滴虫病上具有重要意义REF_Ref116088742\w\h[16]。粒状棘球虫是引起囊性棘球虫病的主要病原体，EgTPx在宿主囊肿的生存中不仅能抵抗氧化损伤，而且还能调节巨噬细胞激活以克服炎症，为控制寄生虫疾病和一些炎症性疾病提供新治疗策略REF_Ref116273619\w\h[17]。例如，血吸虫、绦虫、疟原虫、弓形虫等寄生虫的TPx基因在其生物学过程、致病机制和免疫逃避中发挥着重要作用，相关研究有助于理解这些寄生虫在进入宿主时的氧化应激防御机制。近年来，随着人们对吸虫的研究，发现硫氧还蛋白过氧化物酶对寄生虫在宿主体内的逃避免疫方面发挥重大作用，为疫苗的研制奠定了基础。李永光等人通过对TPx基因克隆、构建pMD18-T-CcTPx质粒并表达、免疫原性分析发现该重组蛋白具有免疫原性，可作为疫苗的候选抗原REF_Ref1493736053\w\h[18]。NicholasMPlugis等人发现重组Trx可以减弱培养的TF-1红白血病细胞的IL-4依赖性增殖，并且在IL-4驱动的该疾病小鼠模型中也可以抑制慢性胰腺炎的进展；通过证实IL-4受Trx促进的二硫键还原的翻译后调节，发现了一种新的Ⅱ型免疫反应的调节机制，即IL-4特异性于IL-13REF_Ref1494038579\w\h[19]。叶井明等人通过研究ESATPx对仔猪树突状细胞（DC）活化的影响，诱导DC表面主要组织相容性复合体Ⅱ高表达、CD80和CD60低表达，抑制DC分泌白细胞介素6等方式逃避免疫攻击机制，这一研究为疫苗设计提供了新的靶点REF_Ref1494341105\w\h[20]。Calderón-MantillaG等人发现rFgTPx均能增加IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、转化生长因子-β（TGF-β）和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌，但抑制PBMC增殖、迁移和单核细胞吞噬功能REF_Ref78306606\w\h[21]。KimJH等人研究发现隐孢子虫在受到高剂量(10kGy)y-辐照后，硫代过氧化物酶（CpTPx）会显著上调；在CmTPx-COS7细胞中表达了鼠隐孢子虫的硫过氧化物酶（CmTPx）结果表明CpTPx-COS7细胞在8Gy照射后72小时的存活率（12-22%）明显高于CmTPx-COS7或未转染的COS-7细胞；此外，CpTPx还能减少50%的ROSREF_Ref78491483\w\h[22]。HarandiMF等人在研究中发现了多角棘球蚴的一个TPx基因并命名为emTPx-1，EmTPx-1能在生殖层中高度表达并存在于多角体圆线虫分泌的类似外泌体的囊泡中；EmTPx-1具有过氧化物酶活性，能在二硫苏糖醇存在下清除过氧化氢REF_Ref78642746\w\h[23]。本研究通过pMD19-T载体克隆FgTPx-1，把克隆后的基因能够稳定保存于载体中，为下一步重组蛋白的表达提供基础材料，为功能研究、药物开发、疫苗研发等提供重要工具，是研究大片吸虫免疫逃避的重要部分。大片吸虫TPx-1基因作为单一蛋白为吸虫病的疫苗研发提供了候选抗原。根据实验设计，选用pMD19-T载体的优点是具有T-overhang结构，线性化载体3’端带有单个T碱基突出，可与PCR产物的A尾高效互补配对，提高连接效率；具有多种常用限制性酶切位点；阳性克隆会形成明显白色菌落现象，直观筛选重组质粒，减少假阳性；具有高拷贝率和稳定性，便于提取质粒。注意PCR扩增时引物片段选择双酶切位点的引物EcoRI和XhoI，方便后续进行双酶切。凝胶电泳实验时，凝胶倒入胶槽时要缓慢，不能有气泡产生；加电泳缓冲液时液面要高于胶面1-2毫米；凝胶放入电泳槽时上样孔朝向负极才能有跑胶效果。菌液PCR扩增时使用预混2×PCRMasterMix可减少因操作误差带来的实验数据失误；还要设置阴性对照以监测污染。PCR纯化时为了提高回收率，可以通过加入1:1体积的异丙醇来促进结合，先用少量水洗脱再次过柱浓缩。涂板时一定要涂布均匀，避免菌落过密或融合。单克隆挑选时选择边缘清晰大小适中的菌落，避免挑取假阳性菌，提高阳性率。4结论本文主要通过PCR技术扩增TPx-1基因，并连接至pMD19-T载体，后进行质粒提取和酶切鉴定，结果成功克隆出FgTPx-1基因，为进一步研究FgTPx-1蛋白的表达奠定了基础。

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