蛋白质N-糖基化与狼疮性肾炎的相关性研究

蛋白质N-糖基化与狼疮性肾炎的相关性研究目录TOC\o"1-1"\h\u30078摘要 II前言狼疮性肾炎（LupusNephritis，LN）是系统性红斑狼疮的一种常见严重并发症，影响着近四成的系统性红斑狼疮患者，其中约有10%的患者可能在诊断后10年内进展至终末期肾病，这一过程与高死亡风险相关，对患者的生活质量和预后产生重大影响REF_Ref28747\r\h[1]。尽管肾活检仍然是诊断和治疗LN的金标准REF_Ref28786\r\h[2]，但临床实施仍有局限性，故临床上常以补体C3、C4、抗dsDNA抗体等传统生物标志物作为诊断和监测LN活动度的重要手段。然而，这些标志物在特异性和敏感性方面存在不足。研究表明，现有生物标志物的分子机制关联尚不明确，例如传统标志物，抗dsDNA抗体、补体C3/C4等，虽与疾病活动相关，但它们在肾脏损伤中的直接作用机制仍不清晰。新型标志物，抗C1q、INF基因特征等在疾病进展中的功能性贡献尚未完全明确REF_Ref4859\r\h[3]。因此，寻找具有高特异性和高敏感性的生物标记物对于早期识别狼疮性肾炎（LN）及其预后评估至关重要。研究表明，异常的表观遗传修饰参与LN的发病机制。表观遗传过程，特别涉及DNA甲基化和组蛋白修饰过程，对LN的发展至关重要REF_Ref28841\r\h[4]。蛋白质是生命活动的重要执行者，据研究推测，人体正常生理功能的维持需要约10⁶种蛋白质分子的协同参与REF_Ref8830\r\h[5]。在众多蛋白质翻译后修饰类型中，糖基化修饰因其普遍性和结构复杂性而备受关注，其发生频率甚至超过磷酸化和乙酰化等常见修饰形式REF_Ref8866\r\h[6]。糖基化是一种高度特异的酶促反应，通过形成糖苷键将糖链与蛋白质、脂类等生物分子共价结合REF_Ref8889\r\h[7]。研究表明，超过50%的蛋白质存在糖基化修饰，这一过程依赖于多种糖基化相关酶的精确调控，如糖基转移酶和糖苷酶等REF_Ref8912\r\h[8]。这些酶通过调控聚糖结构的合成与分解，影响糖蛋白、糖脂及蛋白聚糖等糖缀合物的生物学功能，从而参与细胞及组织的多种生理和病理过程。糖基化可改变抗体对Fc受体的亲和力,有证据表明糖基化是免疫系统生物活性调节的中心机制REF_Ref8938\r\h[10]。狼疮性肾炎发生发展过程中的异常糖基化研究是目前分子机制研究的热点之一REF_Ref17121\r\h。蛋白质糖基化是生物体内常见的蛋白翻译后修饰方法之一，要在细胞内的内质网和高尔基体进行，它的作用过程是在糖基转移酶催化下使糖类转移到蛋白质上，与蛋白质中的某一氨基酸残基结合形成糖苷键的过程。该过程涉及三种主要的糖基化形式：N-连接型、O-连接型以及GPI锚固型。特别地，N-连接型和O-连接型糖基化在多种生物学功能中发挥着至关重要的作用。当前的科学文献指出，糖基化模式的变化不仅与特定疾病的发生和进展密切相关，而且对疾病的整体发展轨迹产生显著影响REF_Ref8977\r\h[11]。卢欣霞团队开展的病例对照研究显示，LN患者血浆中IgG的N-糖基化谱发生显著改变，如半乳糖基化缺失、唾液酸化减少等，这种异常修饰可能增强IgG的促炎活性，进而参与LN的发病过程REF_Ref11638\r\h[32]。AlvesI等人通过多组学技术（质谱成像、原位糖链定位）发现，LN患者的肾脏组织呈现独特的N-糖基化图谱，提示局部糖基化修饰异常可能直接参与肾脏损伤，如免疫复合物沉积、细胞间信号紊乱等REF_Ref11661\r\h[33]。近年来，随着基因芯片和测序技术的快速发展，生物信息学方法在通过综合分析大量组学数据，来寻找与自身免疫性疾病发生、发展、诊断和预后相关的分子标志物方面，不断取得突破。各种生物信息学数据库，如GEO数据库，为自身免疫性疾病基因表达谱的数据挖掘提供了机会。在本项研究中，我们首先从基因表达综合数据库（GEO）中获取了一个LN相关的数据集。随后，我们对LN患者组织样本与对照的的正常肾脏组织样本进行了基因表达水平的对比分析筛选出差异表达基因（DEGs）。进一步地，我们使用Cytoscape软件筛选出关键基因后运用了基因本体（GO）功能分类和京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路数据库，通过富集分析方法对这些DEGs进行了深入的功能注释和信号通路探索。重点探究N-糖基化相关基因及通路在LN发病机制中的调控作用。基于差异基因构建N-糖基化修饰的调控网络，深入解析糖基化修饰异常与LN发生发展的分子关联，这可能为LN的诊断、靶向药物研究提供有价值的见解。

2实验结果2.1DEG的筛选表达谱数据来自基因表达综合（GEO）数据库，分析了来自GEO数据库的数据集GSE11294中14例狼疮肾炎样本和7例匹配的正常样本。使用GEO2R的数据集和分析的DEGs。DEGs是根据以下标准确定的：截断值p<0.05和倍数变化|logFC|>1，然后，通过DEGs与

糖原及糖基因数据库（GlycogenandGlycogenDiseasesDatabase

，GGDB）的交集筛选出90个EP-DEGs，采用综合生物信息学分析，我们确定了71个上调基因和24个下调基因是共有的。图2-1数据集GSE112943的DEGs的火山图。红色表示上调DEGs，蓝色代表下调DEGs，黑色表示表达没有显著差异的基因。标准：倍数变化|log2(FC)|≥1，截断值确定为p<0.05。

图2-2数据集GSE112943的UMAP降维可视化结果。横轴（UMAP1）和纵轴（UMAP2）代表降维后的二维空间，数值为标准化后的相对距离（无单位），反映样本间的相似性。两组样本在UMAP空间中呈现部分重叠但整体分离的分布模式，提示LN与对照组在基因表达上存在系统性差异。图2-3Venn图显示数据集GSE112943所有筛选有统计学意义的DEGs与GGDB数据库的交集（71个基因表达上调，24个基因表达下调）。

表2-1三个微阵列数据集中共同的DEGsDEGs总数基因IDuDEGs71SLC35B3ST8SIA1B4GALT5FUT4FKTNHS3ST1FUT3GCNT1ALG9POFUT1ST8SIA4POFUT2GALNT1ST6GAL1SLC35B1ALG14USTUGGT1GALNT14B3GALNT1ALG3GCNT2ST6GALNAC3ST6GALNAC4ALG13SLC35D1EXT1B4GALT4POMGNT1ST3GAL5GALNT4C1GALT1C1MGAT1ALG11DPM1A4GALTXYLT2B3GALT5CHST3HS6ST3FUT10SLC35B2B3GALT4MGAT4ACHST13LFNGDPAGT1XYLT1EXTL1B4GALT7POMT1ALG2HS6ST1CHST10MGAT5CHPFB3GNT7B4GALT1OGTC1GALT1ST6GALNAC6ST8SIA5GALNT9UGT8HAS3ST3GAL3HAS2RFNGCHST7B3GAT1B3GALNT2dDEGs24B3GNT3ST3GAL5GALNT10B4GALT3DPM2SLC35C1NDST1POMT1FKRPB3GAT3CHST2POFUT1MGAT3B3GAT1SLC35A2GAL3ST4FUT1HAS1EXTL2B3GNT6B4GALT2B4GALNT4B3GALNT1MGAT5B

2.2PPI网络构建和核心基因测定为进一步探索交集基因之间的相互作用，将95个基因导入STRING在线数据库构建了PPI网络，如图所示。利用Cytoscape软件的CytoHubba插件基于MCC算法从该网络中筛选出排名前10位的节点作为Hub基因，结果显示，COL1A1在所有DEGs中排名最高，其次是B4GALT1、B4GALT4、C1GALT1、MGAT5、ST6GAL1、B4GALT2、FUT1、FUT3、GCNT1、ST3GAL3（表2-2）。这10个关键基因多为糖基转移酶相关基因，与糖链合成直接相关，对应着10个节点和45个交互关联。除B4GALT2、FUT1外，其余8个节点均为上调基因，提示uDEGs在LN中起着重要作用。baba图2-4PPI网络构建，每个圆形节点表示蛋白质，点之间的连线表示蛋白质之间的相互作用。图（a）uDEG产物的蛋白-蛋白相互作用网络，共鉴定出70个节点和301个交互关联；图（b）dDEGs产物的蛋白-蛋白相互作用网络，共鉴定出22个节点和35个交互关联。

图2-5基于Cytoscape的模块分析得出的10个关键基因，红色颜色越深表示得分越高，差异基因越有统计学意义。表2-2基于细胞景观软件的模块分析得出的前十个关键基因及其得分基因得分COL1A1COL5A1COL5A2THBS2COL6A3COL4A1BGNCOL12A1SERPINH1COL8A19240326922856891827829170472917019088692068408689839690680306298026656

2.3GO富集分析使用DAVID基因注释工具进行了基因本体论分析。根据三个亚生物学检查DEGs：BP，CC和MF。在生物过程(biologicalprocesses，BP)方面，这些基因主要参与蛋白糖基化、大分子糖基化反应等生物学过程;在细胞组分(cellularcomponent，CC)方面，基因产物主要富集在高尔基池、高尔基堆、高尔基池膜，提示可能参与细胞的蛋白质、脂质的翻译后修饰与成熟，如糖基化修饰等活动;而在分子功能(molecularfunction，MF)层面，这些基因主要涉及糖基转移酶活性、己糖基转移酶活性、半乳糖基转移酶活性等功能。图2-6关键DEGs的基因本体(GO)富集分析。对三个功能(分子功能、生物过程和细胞成分)组成的DEGs进行GO分析。

图2-7基因本体（GeneOntology,GO）富集分析的点图（dotplot）。Count表示与该分子功能相关的差异表达基因数量，p-value表示富集的统计学显著性，数值越小越显著，EnrichmentScore（富集得分），得分越高，富集越显著。使用微生信在线网站发现并可视化重叠DEGs的BP、CC、MF和KEGG通路的最重要项。p.value和调整后p.value<0.05的项被认为是显著的。

表2-3基因功能的通路富集分析项目描述数目P值GO:0006486GO:0043413GO:0070085GO:0009101GO:0009100GO:0016757GO:0016758GO:0008378GO:0008194GO:0031985GO:0005795GO:0032580GO:0098791proteinglycosylationmacromoleculeglycosylationglycosylationglycoproteinbiosyntheticprocessglycoproteinmetabolicprocessglycosyltransferaseactivityhexosyltransferaseactivitygalactosyltransferaseactivityUDP-glycosyltransferaseactivityGolgicisternaGolgistackGolgicisternamembraneGolgiapparatussubcompartment10101010101084588785.38×10⁻²⁰5.38×10⁻²⁰9.93×10⁻²⁰1.68×10⁻¹⁸1.27×10⁻¹⁷4.00×10⁻¹⁹6.71×10⁻¹⁵1.58×10⁻⁹6.51×10⁻⁹7.58×10⁻¹⁷5.78×10⁻¹⁶6.06×10⁻¹⁵8.96×10⁻¹³

2.4KEGG信号通路分析KEGG分析确定的DEGs最显著丰富的途径显示在表2-4。DEGs主要与糖鞘脂生物合成——乳糖系列和新乳糖系列、糖胺聚糖生物合成——硫酸角质素、其他类型O-聚糖生物合成、N-聚糖生物合成、甘露糖型O-聚糖生物合成、多种类型N-聚糖生物合成、半乳糖代谢、黏蛋白型O-聚糖生物合成、糖鞘脂生物合成——球系列和异球系列有关。表2-4DEG信号通路富集分析IDDescriptionCountPvaluehsa00601hsa00533hsa00514hsa00510hsa00515hsa00513hsa00052hsa00512Glycosphingolipidbiosynthesis-lactoandneolactoseriesGlycosaminoglycanbiosynthesis-keratansulfateOthertypesofO-glycanbiosynthesisN-GlycanbiosynthesisMannosetypeO-glycanbiosynthesisVarioustypesofN-glycanbiosynthesisGalactosemetabolismMucintypeO-glycanbiosynthesis645433221.46×10⁻¹³9.46×10⁻¹⁰1.00×10⁻⁹2.92×10⁻⁷2.03×10⁻⁶1.30×10⁻⁵6.01×10⁻⁴7.62×10⁻⁴图2-8DEGs的信号通路富集分析3讨论LN是SLE患者主要的死亡原因，约40%-60%的SLE患者会发展为LNREF_Ref10626\r\h[18]。及时的诊断与治疗对于提高狼疮性肾炎（LN）患者的生活质量极为关键。前临床诊断主要依赖肾活检和抗dsDNA抗体检测，但敏感性和特异性有限。蛋白质糖基化修饰异常在自身免疫性疾病发生发展中起关键作用，且往往早于典型临床症状出现。因此，了解潜在机制并确定生物标志物以制定LN筛查、早期诊断和新疗法策略至关重要。本研究利用生物信息学方法探索了LN的潜在靶基因和通路。从GEO数据库下载的GSE1113943数据集中筛选出了71个uDEGs和24个dDEGs与DDGB数据库有交集。为了深入探究这些差异表达基因（DEGs）在狼疮性肾炎（LN）发展中的功能与影响，本研究开展了一系列生物信息学分析。GO和KEGG通路富集分析确定“糖蛋白生物合成”“蛋白糖基化”、“高尔基体”、“调节糖基转移酶活性”和“赋予拉伸强度的细胞外基质结构成分”是DEGs富集的最重要的LN相关通路、BP、CC和MF项。STRING和Cytoscape用于构建PPI网络。CytoHubba的插件介绍了排名前10位的hub基因，多为糖基转移酶相关基因，与糖链合成直接相关。Hub基因得分排名，COL1A1（胶原蛋白）得分最高，可能与LN肾脏纤维化相关，COL1A1是人体最丰富的胶原蛋白类型，其过度积累是纤维化的关键特征（如CKD、心脏纤维化）REF_Ref10678\r\h[16]，但糖基化相关基因（如B4GALT1、MGAT5）亦为核心节点。糖基化与狼疮性肾炎（LN）之间的关联是本研究的核心焦点。糖基化作为一种关键的蛋白质翻译后修饰机制，其功能异常已被证实与多种病理过程密切相关。研究表明，聚糖结构通过调控免疫相关蛋白的活性，在多种炎症性疾病中发挥重要作用REF_Ref10701\r\h[19]。B4GALT1、MGAT5、ST6GAL1均与N-聚糖生物合成途径（hsa00510）有关。由MGAT5编码的N-乙酰葡糖胺基转移酶V,催化β1,6-连接的N-乙酰葡糖胺的加入形成复杂的N-糖，N-糖基化通过经典细胞死亡途径在调节细胞对T细胞杀伤的敏感性中发挥作用REF_Ref10724\r\h[20]。有研究表明，B4GALT1作为N-聚糖合成途径中的核心调控因子，在分子层面发挥着多重作用机制。研究表明，该基因能够通过介导PD-L1（程序性细胞死亡配体1）蛋白的N-连接糖基化修饰，有效抑制该蛋白在翻译后的降解过程。同时，B4GALT1还通过糖基化修饰稳定TAZ蛋白的表达水平，进而上调CD274基因的转录活性，B4GALT1是调控糖基化合成的关键分子，这些因素影响着机体的免疫调节功能REF_Ref10760\r\h[21]。此外，B4GALT1

mRNA水平与CD8+T细胞浸润呈负相关，B4GALT1过表达增加了免疫细胞活力，表明

B4GALT1

高表达在自身免疫性疾病促进过度炎症反应。发生中具有免疫抑制作用B4GALT1

敲低可显著降低细胞活力REF_Ref10786\r\h[22]。ST6GAL1（ST6β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1）属于唾液酸转移酶家族，其功能是通过CMP依赖的催化机制将α2,6-连接的唾液酸残基转移至糖缀合物的末端N-聚糖结构REF_Ref10809\r\h[23]。这种酶促修饰过程是调控免疫检查点分子PD-L1的重要途径之一REF_Ref10828\r\h[24]。另外，Huang等人REF_Ref10861\r\h[25]的研究也指出该酶可能直接参与PD-L1的糖基化修饰过程。在免疫系统调控方面，ST6GAL1表现出多效性功能。它不仅参与B淋巴细胞的分化成熟和免疫球蛋白G的合成调控，还能通过细胞表面受体介导的信号转导途径影响单核细胞的发育过程。现有证据表明，该酶作为细胞外聚糖修饰的关键调控因子，在造血免疫细胞的发育和功能协调中发挥核心作用REF_Ref10894\r\h[26]。这些研究表明，ST6GAL1的表达水平可能具有重要的临床价值，既可作为潜在的生物标志物，也为优化免疫治疗方案提供了新的分子靶点。有研究发现B4GALT2、B4GALT1、FUT1、B4GALT4、ST3GAL3、FUT3共同参与糖鞘脂的合成，糖鞘脂（Glycosphingolipids,GSLs）作为细胞膜的重要结构组分，在免疫调控过程中发挥着多重生物学效应。最新研究揭示，GSLs的生物合成水平可显著改变T细胞膜脂质微环境，进而调控免疫突触的组装效率。这种调控作用会直接影响T细胞受体的信号转导过程，最终导致T细胞功能状态的改变。值得注意的是，这种由GSLs介导的免疫调节机制可能参与多种自身免疫性疾病的病理进程，为相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点REF_Ref10969\r\h[27]。FUT1基因编码的岩藻糖基转移酶1（FT1）是一种关键的糖基化修饰酶，它通过催化α1,2-岩藻糖基聚糖的合成，参与调控多种重要糖缀合物的生物合成过程。这些糖缀合物包括ABO血型抗原、Lewis抗原、Globo-H以及SSEA-5等，广泛分布于细胞表面的糖脂（GSL）和糖蛋白结构中。α1,2-岩藻糖基糖缀合物的表达水平与细胞状态呈现显著的动态相关性REF_Ref11001\r\h[28]。B4GALT4是一种独特的β1,4-半乳糖基转移酶，在糖缀合物（尤其是硫酸化聚糖和O-聚糖）合成

中发挥关键作用。其N-糖基化修饰对酶活性、亚细胞定位及与UDP-Gal转运蛋白的相互作用至关重要。在疾病（如癌症）中，B4GALT4的表达变化可能影响肿瘤转移和治疗反应。尽管与其他B4GALT4存在功能重叠，B4GALT4在硫酸化糖胺聚糖和特定聚糖结构合成中具有不可替代的作用REF_Ref11031\r\h[29]。I型胶原alpha1（COL1A1）是胶原家族的一员，广泛分布于全身实质器官和结缔组织的间质中，参与上皮-间质转化，调节各种细胞过程，由于其在维持组织发育和体内平衡方面的重要性，ECM中胶原蛋白的过度积累会导致各种疾病REF_Ref11573\r\h[30]。临床上COL1A1主要在肿瘤发展中发挥作用，且事实上，COL1A1是许多疾病的关键，例如动脉粥样硬化、心肌纤维化、心力衰竭和成骨不全症，调节化疗、放疗和免疫治疗等，目前也有许多COL1A1特异性药物，表明COL1A1是一个值得研究的靶点REF_Ref11602\r\h[31]。此外，多项研究强调了糖基化异常表达在LN发病中的关键作用，与本次研究结果相互印证。卢欣霞团队开展了一项病例对照研究，纳入了188例系统性红斑狼疮患者，其中包括94例狼疮性肾炎患者和94例年龄匹配的非肾炎对照。研究者采用亲水作用