滇龙胆提取物对大鼠心肌细胞炎症过程抗炎细胞因子表达的影响

滇龙胆提取物对大鼠心肌细胞炎症过程抗炎细胞因子表达的影响摘要：本研究探究滇龙胆提取物在脂多糖（LPS）诱导的大鼠心肌细胞炎症过程中的作用机制，着重关注它对抗炎细胞因子表达的影响，利用体外培养的大鼠正常心肌细胞为模型，脂多糖诱导炎症后滇龙胆提取物加以干预，然后借助实时定量PCR测定细胞中细胞因子的mRNA表达情况。结果显示，滇龙胆提取物可明显推动抗炎因子（IL-10、TGF-β1）并抑制促炎因子（IL-1β、IL-6）的mRNA表达，特别是在LPS诱发的炎症模型中效果更明显，当它与LPS并用时，可以有效拮抗LPS引起的炎症，大概是通过调控NF-κB炎症通路发挥作用。滇龙胆“双向调节”特性可能优于传统单靶点抗炎药物，为开发低毒高效的心肌炎治疗药物形成了基础。关键词：滇龙胆提取物；心肌细胞；促炎细胞因子；抗炎细胞因子；抗炎活性EffectoftheExtractofGentianarigescensFranch.exHemsl.ontheExpressionofAnti-inflammatoryCytokinesintheInflammatoryProcessofRatCardiomyocytesAbstract:ThisstudyexploresthemechanismofactionoftheextractofGentianarigescensFranch.intheinflammatoryprocessofratmyocardialcellsinducedbylipopolysaccharide(LPS).Itfocusesonitsimpactontheexpressionofanti-inflammatorycytokines.Usingnormalratmyocardialcellsculturedinvitroasamodel,Keywords:ExtractsofGentianarigescensFranch;Cardiomyocytes;1引言1.1研究背景炎症指的是宿主受到致炎因子刺激后所表现出的以防御为主的免疫反应，体内多种细胞被募集到免疫微环境中，他们会生成细胞因子来抵御外来因素的入侵，恢复机体健康，从而使机体重回健康状态，不过，如果炎症一直存在，就会给机体器官乃至全身反应带来伤害，在许多复杂病症的形成与发展里起关键作用REF_Ref197373895\r\h[1]REF_Ref196248623\r\h。心肌炎症也是各类心血管病比如心肌梗死，心肌炎等的关键病理原因。炎症反应牵涉到的炎症介质分为两类，即促炎细胞因子和抗炎细胞因子，促炎细胞因子包含白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)等REF_Ref198140075\r\h[2]，而抗炎细胞因子则涵盖白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-4(IL-4)等，这两大类因子相互制衡，对于调节炎症反应以及心肌细胞损害十分关键，促炎细胞因子会开启炎症信号通道，造成心肌细胞凋亡，坏死及纤维化，就拿IL-1β来说，它能同特异性受体IL-1R相结合，激活诸多免疫细胞并促使它们增殖分化，提升免疫细胞的吞噬功能和杀伤力，进而产生免疫反应来消灭病原体，IL-1β还可以抑制心肌细胞的收缩功能，它通过干扰心肌细胞内钙离子的转运和调节，对心肌细胞兴奋-收缩偶联的过程造成破坏，最终引起心肌收缩力下降REF_Ref198140092\r\h[3]。对于抗炎细胞因子，则是通过抑制促炎细胞因子的产生和活性，减轻炎症反应，促进组织修复，就白细胞介素-10而言，它发挥作用是凭借与免疫细胞表面的IL-10受体结合，使细胞内的信号传导通路生效REF_Ref198140108\r\h[4]，阻止像核因子-κB（NF-κB）这样的转录因子起作用，NF-κB是调控多种促炎细胞因子基因转录的关键因子REF_Ref198140130\r\h[5]，IL-10通过对其抑制来下调IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的产生与释放，借此达到缓解炎症反应的功能。IL-10、TGF-β、IL-4等作为重要的抗炎细胞因子，可能在调节心肌细胞炎症反应中发挥着重要作用。在临床用药当中，抗炎药属于第二类常用药物，其重要性仅次于抗感染药，伴随人们对炎症发展机制认识的持续提升，新的治疗药物不断涌现，当前临床上多数药物都是单一靶点的药物，这些药物均存在一些不良反应，比如非甾体类抗炎药会给胃肠道带来刺激并影响肾脏功能、糖皮质激素类药也许会引发或加剧感染等REF_Ref197374702\r\h[6]。近些年来，天然药物凭借自身多靶点作用的特性受到众多研究者的关注，它们的活性成分也表现出不一样的抗炎效果。当下，具备抗炎效果的活性成分涵盖萜类、苷类、多糖类等多种物质REF_Ref197374775\r\h[7]，诸如，刘佳等人察觉，人参皂苷Rbi凭借降低TNF-α、MCP-1以及IL-6的产生，促进脂联素的表达，在脂肪细胞炎症过程中发挥功能REF_Ref197374819\r\h[8]。在诸多传统中药当中，“滇龙胆”的抗炎活性已经得到证实，但它的抗炎原理却并未彻底探明。滇龙胆（GentianarigescensFranch.exHemsl）又名坚龙胆，属龙胆科多年生草本植物，主产于云贵川等地，大多生长于海拔1100~3000米的山坡草地、灌丛中及山谷中REF_Ref197374830\r\h[9]，滇龙胆是云贵川地区特有的药用植物，当地人普遍知晓其保肝、健脾的药效REF_Ref197374844\r\h[10]。关于滇龙胆化学成分的研究开始于20世纪80年代，当时认为龙胆苦苷、獐牙菜苦苷等属于滇龙胆中的主要有效成分REF_Ref197374853\r\h[11]。龙胆苦苷(gentiopicroside，GPS)属于裂环烯醚萜苷类物质，具备诸多药理作用，其中包含抗炎效果REF_Ref197374871\r\h[12]，相关研究显示，它能够防止IL-1β所引发的软骨细胞炎症反应REF_Ref197374882\r\h[13]，在葡聚糖硫酸钠诱发的急性结肠炎模型起抗炎功效REF_Ref196248748\r\h[14]，而针对肝损伤小鼠实施治疗时，它能够阻止血清TNF-α的产生，提升肝转氨酶含量，以此减轻炎症REF_Ref197374916\r\h[15]。1.2研究目的与意义从理论角度来看，IL-10、TGF-β、IL-4等作为重要的抗炎细胞因子，其是否能够在心肌炎症过程中发挥抗炎作用尚未完全明确，从现实角度来看，心血管疾病已成为全世界发病率最高的慢性疾病，截至2019年，世界死于心血管疾病的人数已经达到1700万，居所有疾病死亡率的首位REF_Ref197375084\r\h[16]REF_Ref196761073\r\h。我国存在着3.3亿名心血管疾病患者，而且每年死亡病例当中由心血管疾病造成的死亡率高达40%REF_Ref196761122\r\h[17]。心肌炎是心血管疾病关键的病理前提，当人长时间处在心肌炎状况下，便会引发心肌细胞受损，心脏功能衰退，严重时还会致使机体死亡REF_Ref198140254\r\h[18]。当下，临床常用的抗炎药像非甾体抗炎药和糖皮质激素，这些药物针对炎症症状有一定程度的改善效果，但它们存在副作用大，疗效欠佳等情况REF_Ref198140315\r\h[19]，并不能很好地符合临床治疗中心肌炎安全有效治疗的实际需求，滇龙胆属于天然药物，具备副作用小，多靶点作用这样一些优点，也许会成为心肌炎症治疗的潜在选择对象，本项研究探讨滇龙胆提取物对IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子表达产生的影响，这有益于我们更好地认识其抗炎作用原理，还能为滇龙胆提取物在临床上用于心肌炎的医治给予一定的科学依据。2材料与方法2.1天然药物来源滇龙胆购买于玉溪市中药市场。2.2主要试剂DMEM/F12培养基、胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、磷酸盐缓冲盐水（

PhosphateBufferedSaline，PBS）、二甲基亚砜（DimethylSulfoxide，DMSO）、TRIzol试剂、氯仿、异丙醇、TaKaRa逆转录试剂盒、ChamQUniversalSYBRq-PCR试剂盒、引物序列如REF_Ref196737923\h表1。表SEQ表\*ARABIC1实时定量PCR所用基因引物序列GenesForwardprimers(5'-3')Reverseprimers(5'-3')IL-1βCACCTCTCAAGCAGAGCACAGGGGTTCCATGGTGAAGTCAACIL-6TCCTACCCCAACTTCCAATGCTAGCACACTAGGTTTGCCGAIL-10TAAAAGCAAGGCAGTGGAGCTGCCGGGTGGTTCAATTTTTCTGF-βCCTGCACAGCTCCAGGCACCTGCTCCACCTTGGGCTTGCG2.3仪器设备电子天平、显微镜、水浴锅、移液枪、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、液氮罐、超净工作台、涡旋混合器、低速台式离心机、PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超微量紫外分光光度计。2.4细胞培养大鼠心肌细胞株（H9C2）采用含0.1%双抗和10%FBS的DMEM/F12完全培养液，置于5%CO2，37℃细胞培养箱培育，挑选生长良好的悬浮鼠心肌细胞做炎症诱发试验，把细胞传代接种到6孔板（细胞密度1x106个/mL，每孔2ml），添加DMEM/F12完全培养液促使细胞贴壁培育48小时，倒去上清液，用PBS缓冲液清洗3次，再添加上新的含1mg/mlLPS的DMEM/F12培养液，刺激鼠心肌细胞进入炎症状态，从而形成炎症模型，然后加入不同浓度的滇龙胆提取物实施药物干涉。对照组：PBS+DMSO。2.5RNA提取及逆转录2.5.1大鼠心肌细胞RNA的提取及检测构建鼠心肌细胞炎症模型并完成药物干预后，取出6孔板，吸除孔内培养基，每孔添加1mLTRIzol试剂，接着用移液枪反复吹打，让细胞彻底裂解开，在室温下放置5分钟，使得细胞内部的核酸和蛋白质有效地分离开来，然后往每个孔里加0.2mL氯仿，猛烈振荡之后，在室温下放置3分钟，经过离心（12000r、15min）后溶液出现分层现象，吸取上层无色水相，移到新的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置10min使RNA沉淀。再次离心（12000r、10min）后在离心管底部观察到的白色沉淀即为RNA。弃去上清液，加入1ml75%乙醇洗涤并离心（7500r、5min），弃去乙醇，把离心管倒扣在滤纸上，室温晾干5-10min。RNA沉淀干后，往管里加RNase-freeddH2O，用枪头吹打，让RNA充分溶解，得到RNA样品。用超微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，需保证A260/A280比值在1.8-2.0之间，这样才能表明RNA纯度较高，可以做后续实验，测定结束后于-80℃冰箱保存。2.5.2逆转录逆转录反应在PCR仪中完成，先准备好各组的RNA浓度，选取500ng总RNA逆转录得到cDNA，在RNase-free的离心管中，按REF_Ref196951109\h表2配置混合液。表SEQ表\*ARABIC2逆转录反应体系的配置5×PrimeScriptBuffer8μLPrimeScriptRTEnzymeMixI2μLRTPrimerMix4μLRNase-freeddH2OTO20.0μL充分混合反应体系之后短暂离心，让反应物沉降到管底，接着按REF_Ref196956650\h表3展开逆转录反应，反应完毕后把逆转录产物置于-20℃冰箱暂存。表SEQ表\*ARABIC3逆转录体系的反应条件Stage137℃10minStage250℃15minStage385℃5sec2.6实时定量PCR法检测细胞炎症因子的表达从-20℃冰箱取出逆转录产物，离心混匀，按REF_Ref196746790\h表4配置qPCR管内混合液：表SEQ表\*ARABIC4qRT-PCR反应体系的配置2×ChamQUniversalSYBRqPCRMix10.0μLForwardprimer0.4μLReverseprimer0.4μLTemplateDNA/cDNA2μLddH2OTo20.0μL把已经配置好反应体系的qPCR管放在荧光定量仪中，按照REF_Ref196746826\h表5中条件执行qPCR反应，反应结束后，把甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase，GAPDH）基因当作内参基因，采用2-ΔΔCt法来计算出目的基因mRNA的相对表达量。表SEQ表\*ARABIC5qRT-PCR体系的反应条件Stage1预变性Rep:195℃30secStage2循环反应Reps:4095℃3~10sec60℃10~30sec95℃15secStage3熔解曲线Rep:160℃60sec95℃15sec2.7数据处理及统计分析实验数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示，采用SPSS26.0软件进行Mann-WhitneyU校验计算是否存在显著差异，P<0.05则视为有显著差异，具有统计学意义，并采用GraphPadPrism8.0软件进行作图。3实验结果3.1滇龙胆提取物对H9C2炎症心肌细胞IL-1β和IL-6mRNA表达水平的影响就IL-1β和IL-6而言，结果如REF_Ref198240330\h图1、REF_Ref196747468\h图2所示，滇龙胆单独作用时，其表达量随滇龙胆浓度（0至200μg/mL）升高呈递减趋势，表明滇龙胆单独使用可能抑制IL-1β和IL-6的mRNA表达，且表现出浓度依赖性的抗炎作用；滇龙胆+LPS联合作用与滇龙胆独自起效时相比，滇龙胆浓度梯度（0至200μg/mL）所对应的IL-1β、IL-6表达逐渐下降，这表明滇龙胆可能拮抗由LPS引发的IL-1β和IL-6的增多，从而起到压制促炎反应的作用。图SEQ图\*ARABIC1滇龙胆及LPS处理后H9C2心肌细胞促炎因子IL-1βmRNA表达(*表示统计存在显著差异，p<0.05)图SEQ图\*ARABIC2滇龙胆及LPS处理后H9C2心肌细胞促炎因子IL-6mRNA表达(*表示统计存在显著差异，p<0.05)3.2滇龙胆提取物对H9C2炎症心肌细胞IL-10和TGF-β1mRNA表达水平的影响关于IL-10，结果如REF_Ref196749325\h图2所示，滇龙胆单独发挥作用时，低浓度（0至25μg/mL）时效果较为平缓，到50μg/mL时达到峰值（8.86），可能表明中等浓度的滇龙胆对IL-10mRNA表达有显著促进作用，而高浓度（100至200μg/mL）时数值下滑，大概是由于高浓度产生的毒性或者抑制效果所致；滇龙胆+LPS联合作用与滇龙胆独自起作用时相比，低浓度（10至25μg/mL）情况下数值快速上升（如25μg/mL时它的表达量达63.36），这种情况表明在LPS刺激的炎症状况下，滇龙胆的效果可能被扩大，也可以理解为滇龙胆在炎症环境里加强了自身活性；50μg/mL时数值骤降至13.43，可能与高浓度滇龙胆会抑制LPS信号通路存在相关性。图SEQ图\*ARABIC3滇龙胆及LPS处理后H9C2心肌细胞抗炎因子IL-10mRNA表达(*表示统计存在显著差异，p<0.05)就TGF-β1而言，结果如REF_Ref196749336\h图3所示，滇龙胆单独处理时，其表达量大幅减小，滇龙胆+LPS共同作用与滇龙胆单独作用时相比，TGF-β1表达量显著增多，这显示滇龙胆也许通过恢复或者加强TGF-β表达来改善炎症损伤。图SEQ图\*ARABIC4滇龙胆及LPS处理后H9C2心肌细胞抗炎因子TGF-β1mRNA表达(*表示统计存在显著差异，p<0.05)4讨论本研究通过体外实验探究了滇龙胆提取物对LPS引发的大鼠心肌细胞H9C2炎症模型中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6）与抗炎细胞因子（IL-10、TGF-β）表达的调节效果。研究显示，滇龙胆提取物可明显减弱IL-1β和IL-6的表达，此结果同李鑫波等人的研究成果相契合REF_Ref198140266\r\h[20]，这体现出滇龙胆具有跨模型的抗炎普适性，研究又猜测滇龙胆也许依靠NF-κB通路来发挥抗炎功效，该猜想同GPS抑制NF-κB活化的论述相一致REF_Ref198140345\r\h[21]，暗示滇龙胆的抗炎原理大概与主要成分对经典炎症通路实施干预存在相关性。不过以往的研究大多着眼于滇龙胆对促炎因子的抑制效果REF_Ref198140353\r\h[22]，本项研究关注于它显示出的显著上调抗炎因子（IL-10、TGF-β）的表达，说明滇龙胆可通过“双向调节”（即抑制促炎因子并激发抗炎因子）来发挥抗炎作用。先前的文献重点放在肝、软骨等组织上REF_Ref198140369\r\h\#"[0"[23-REF_Ref198140374\r\h\#"0]"25]，而本项研究则把重心放在心肌细胞炎症方面，这给滇龙胆在心血管疾病里的应用提供了一定的依据。而且，本项研究还察觉高浓度滇龙胆（100-200μg/mL）对IL-10和TGF-β的推动作用有所减小，甚至变为抑制，表明滇龙胆的药效大概存在浓度窗口效应，有必要进一步考察其安全性以及合适的剂量范畴。在整个研究过程中还存在许多不足，其一，只使用了H9C2这一种细胞系，缺少动物或者临床的数据来证实体内效果；其二，所使用的滇龙胆粗提物含有诸多化合物，不能确切辨别出是GPS亦或是别的成分起到抗炎作用；其三，关于对NF-κB通路存在抑制效果只是凭借一些间接证据（比如细胞因子表达方面出现的改变），并没有通过蛋白磷酸化检测或者通路抑制剂之类的实验加以直接证明。综上而言，滇龙胆提取物可明显推动抗炎因子（IL-10、TGF-β1）的mRNA表达，而且能抑制促炎因子（IL-1β、IL-6）的mRNA水平，特别是在LPS诱发的炎症模型里效果更为明显，当它与LPS并用时，可以有效地拮抗LPS引起的炎症作用，它大概是通过调控NF-κB炎症通路发挥药效。滇龙胆属于天然药物，其“双向调节”特性可能优于传统单靶点抗炎药物（比如糖皮质激素），从而为开发低毒高效的心肌炎治疗药物形成基础。本项研究还表明要深入探寻滇龙胆里的有效成分(比如GPS)在心肌保护方面所做的具体贡献，也要通过具体的实验证实滇龙胆提取物在心肌细胞炎症过程中所调控的炎症通道。5结论本研究通过对滇龙胆提取物展开抗炎活性研究，证明滇龙胆提取物可抑制促炎因子（IL-1β、IL-6）并激活抗炎因子（IL-10、TGF-β）的表达，在心肌细胞炎症模型中表现出明显的保护效果，表明其具有良好的抗炎活性，其机制大概与NF-κB通路调控有关。此项研究虽存有局限之处，但结果给滇龙胆的临床转化提供了一定的理论支撑，也为进一步探究其多靶点抗炎机制指引了方向。6未来展望未来可以研究滇龙胆在心肌梗死、动脉粥样硬化或者心力衰竭时的保护作用，证实它的抗炎机制是否具有普遍性，考察它对于其他炎症性疾病比如类风湿性关节炎，肠炎等的干涉成果，探寻它的多器官保护潜力。滇龙胆属于天然药物资源，它具备“双向调节”这种特性，这给心肌炎症的医治带来新想法，以后的研究必要把多学科技术融合起来，从机理阐释，成分改良一直到临床应用逐步开展，从而达成从实验室到病床的超越，给心血管疾病的防治给予更为安全，有效的中药解决办法。参考文献BUCKLEYCD,BARONEF,NAYARS,etal.Stromalcellsinchronicinflammationandtertiarylymphoidorganformation[J].AnnualReviewofImmunology,2015,33(1):715-745.惠岗.环氧合酶2(COX-2)及相关microRNA在心力衰竭患者血浆中表达水平的研究[D].长春:吉林大学,2018.Al-KofahiM,OmuraS,TsunodaI,etal.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