3.2基因工程的基本操作程序1课件下学期生物人教版选择性必修3

第2节基因工程的基本操作程序

本节聚焦:基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？

第三章基因工程3.将目的基因导入受体细胞苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建4.目的基因的

检测与鉴定基因工程的基本操作程序1.概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。2.实例：与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。一、目的基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因那么，如何筛选目的基因呢？第一步：目的基因的筛选与获取1.通过构建基因文库来获取目的基因（目的基因的序列未知）2.人工合成目的基因获取目的基因的方法二、基因文库类型基因组文库cDNA文库构建基因组文库前提：目的基因的序列未知基因组文库（

genomiclibrary）

将某种生物细胞的整个基因DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，因此，称之为基因组文库（genomiclibrary）提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段该生物基因组文库与载体连接导入受体菌群cDNAlibrary利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。cDNA(complementaryDNA，互补DNA)是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。mRNA杂交双链单链DNA双链cDNA(cDNA)该生物cDNA文库与载体连接导入受体菌群逆转录酶核酸酶HDNA聚合酶某一发育时期cDNA没有内含子而只有外显子的序列文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因多少小大某种生物的部分基因某种生物的全部基因前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因2.人工合成目的基因【思考】若不明确基因碱基序列呢？蛋白质氨基酸序列mRNA序列基因序列

反转录法适用于获取序列已知，或部分已知的目的基因3.利用PCR获取目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因

先对目的基因进行扩增思考:获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？抗虫基因快速获得大量抗虫基因苏云金杆菌提取PCR可以把指定的基因片段数量放大染色体(polymerasechainreaction,PCR)三、利用PCR扩增目的基因1中文全称：聚合酶链式反应3含义：在体外大量复制特定DNA片段的技术2原理：DNA半保留复制1985年Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）1976年，华裔女科学家钱嘉韵（AliceChien）水生栖热菌（Thermusaquaticus）中，分离纯化了一种能够耐受极高温度的DNA聚合酶——TaqDNA聚合酶。1986年，穆利斯的同事兰道·赛奇（RandallSaiki）将TaqDNA聚合酶成功应用在了PCR技术中，PCRbath，三个独立水浴锅连在一起自动化的PCR仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖无PCR时代有PCR时代ATGCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端

规定：

DNA分子的3′

端与5′

端-OH端为3′;磷酸基团的末端为5′。DNA双链的方向PCR原理模板酶原料、能量引物环境体内DNA复制过程体内体外模板酶原料、能量引物环境DNA（两条链）DNA（两条链）解旋酶、DNA聚合酶ATP、4种脱氧核苷酸热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）需要引物（但会脱落）一般细胞核中，条件温和dNTP需要引物（不脱落）缓冲溶液，控制温度包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C等中的一种。dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物dATP与ATP在结构上有什么区别？ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖4条件：①②③④⑤DNA模板4种脱氧核苷酸（dNTP）耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）引物（2种）一定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶（2025·陕晋青宁卷·高考真题）(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、

、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。

4种脱氧核苷酸思考讨论什么是引物？引物的作用是什么？定义：引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单

链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）作用：为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。解旋酶

由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。作用：打开DNA双链（若是在体外可以用高温代替解旋酶打开DNA双链）引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。复制方向第1步5

′-3

′--3

′-5

′5

′-3

′--3

′-5

′双链DNA解旋为单链。95℃5过程：变性（90

0C以上）：DNA分子C-G含量高，需要设定的变性温度较高5过程：5

′-3

′--3

′-5

′5

′--3

′-5

′3

′-第2步：复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。50℃复性（50

0C）：引物与互补单链DNA结合5

′--3

′-5

′3

′-第3步：延伸5

′--3

′-5

′3

′-5

′--3

′-5

′3

′-当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。72℃5过程：延伸（

72℃

）：DNA聚合酶将四种脱氧核苷酸连接在引物之后第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5过程：

从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。第三次思考：继续循环N次，会得到多少个DNA分子呢？

每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。

DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。6优点：可在短时间内大量扩增目的基因（约为2n，n循环次数）5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’引物13’5’引物23’5’5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’引物13’5’引物23’5’引物25’3’引物1目的基因思考?1、引物在PCR中能重复利用吗？不能2、用PCR可以扩增mRNA吗？(P79旁栏思考题）不能，由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。琼脂糖凝胶电泳7产物鉴定：例：PCR一般要经过30多次循环,从第二次循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将(

)A.仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸B.与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸D.无须与引物结合,在酶的作用下从头合成子链B引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’（2025·安徽·高考真题）PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的

。指数级扩增

（2025·全国卷·高考真题）(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是

，而PCR过程中解开双链的方法是

。(2)PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有

。解旋酶

高温变性引物、脱氧核苷三磷酸1、概念：是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，体内DNA复制，引物一小段

，PCR反应中，是

分子片段。聚焦“引物”RNA单链DNA2、作用：使耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。3、结合部位：引物结合在模板链的_________。3’端5’3’子链延伸方向：问题1：扩增AnB1基因（编码纳米抗体)应选择哪两条序列作为引物？AnB1基因ABCD5’3’5’3’(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是______________________________________________________________。能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸对点训练1.（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题；PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为____________________________________________________________________。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。对点训练AnB1基因ABCD5’3’5’3’问题2：引物B和引物C序列是？AnB1:5’CATGTCCA--------------------------------------------------CCACAACC3’3’GTACAGGT--------------------------------------------------GGTGTTGG5’5’

CATGTCCA3’3’GGTGTTGG5’PCR扩增时至少需要______种引物，原因是_________________________________________________________________________________2DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增5、种类：根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物4、PCR扩增的前提是：聚焦“引物”例.如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：扩增X蛋白基因所需的引物序列是________________；________________。对点训练5′­ATGCCGTAAGTCCTAC­35′­TGATCTACGGCTTACA­3′设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)是否合理(如下图)，请分别说明理由。①第1组：________________________________________________；②第2组：________________________________________________。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效6、设计引物的要求：【资料2】纳米抗体蛋白（AnB1）基因如下，需将其正确插入到如图质粒中。AnB1:5’CATGTCCA--------------------------------------------------CCACAACC3’复制原点启动子抗性基因终止子EcoRⅠBamHⅠ限制酶EcoRⅠBamHⅠ识别序列G↓AATTCG↓GATCC问题3:目的基因两端没有限制酶酶切位点，为便于目的基因插入载体，应如何改造目的基因？3’GTACAGGT--------------------------------------------------GGTGTTGG5’添加酶切位点的引物序列（5’-3’）=限制酶切序列（5’-3’）+该DNA非模板链序列（5’-3’）引物B’：5’GAATTCCATGTCCA3’引物C’：5’GGATCCGGTTGTGG3’例.为保证双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和引物2,其中引物1的序列为5'-

-3'。

GGTACCGTACCTTTGT对点训练(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________________(填“3′端”或“5′端”)。5′端对点训练引物的延伸是从____端开始的，不能进行任何修饰

3′引物的设计原则总结①引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合,长度通常为20-30bp，引物过短导致引物特异性较低，过长影响引物与模版的结合

;②避免引物内部、引物之间4个碱基以上的互补;③引物内GC含量不宜过高，导致复性温度过高，同一反应的一对引物（A+T）/（G+C）值接近（两引物复性温差不宜过大）;④需要在2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列;例.PCR作为一种体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异性结合，二是DNA聚合酶对引物的延伸。引物设计的总原则是提高扩增的效率和特异性。下列有关叙述错误的是（）A．引物长度过短，特异性降低B．两种引物之间可能发生碱基互补配对C．引物的G—C含量越高，越利于目标DNA的扩增D．可在引物的5′端添加特定限制酶的识别序列C（2021·湖北·高考真题）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（

）A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度D【思考】1.PCR过程中，复性的温度与引物中不同碱基的比例有何关系？2.退火过程中已经解旋的两种模板链是否会发生模板链之间的互补配对？1.引物中碱基GC含量较高时，复性温度可以适当提高，因为GC之间可以形成三个氢键，连接更稳固；2.实验中引物浓度远高于实验初始模板DNA的浓度，因此两种DNA模板链之间碱基互补配对的概率很低。(2017年江苏高考，33)PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏

的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但

的引物需要设定更高的复性温度。如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有

（填序号：①升高复性温度②降低复性温度③重新设计引物）。引物与模板GC含量高②③【提示】1.理想状态下复性温度应既能保证引物有效结合，又能减少碱基对的非特异性结合。2.G-C之间的氢键比A-T之间多，为了确保G-C含量高的引物错配后能够有效从模板链上脱落下来从而减少非特异性扩增，选择的退火温度就要相应高一些，如果没有得到扩增产物，说明引物并未与模板互补配对，复性设置温度过高，此时可相应降低复性温度，或重新设计引物，使其Tm值升高。（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（）反应管加入的单链DNA①5'-GCCGATCTTTATA-3'3'-GACCGGCTAGAAA-5'②5'-AGAGCCAATTGGC-3'③5'-ATTTCCCGATCCG-3’3'-AGGGCTAGGCATA-5'④5'-TTCACTGGCCAGT-3'A．①② B．②③C．①④ D．③④为研究水稻D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中（图3），致使该基因失活，失活后的基因记为d。为验证F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如图4所示。随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR）。如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型为____。如果_____________________________________________，则相应植株的基因型为_____；如果_____________________________________________，则相应植株的基因型为_____。Dd仅引物"Ⅰ+Ⅲ"组进行PCR能完成扩增，而"Ⅱ+Ⅲ"组不能完成扩增dd仅引物"Ⅱ+Ⅲ"组进行PCR能完成扩增，而"I+Ⅲ"组不能完成扩增DD对点训练思考:PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’经过3次，可以产生两条单链等长的目的基因片段。聚焦“引物”复制次数123nDNA分子数

含引物的DNA分子数

DNA链数目共消耗引物的个数

含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数

22204460881422n2n2n+1-22n-2n48162n+1一PCR扩增DNA规律聚焦“引物”1.（2024·河北邢台模拟）PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是（）A．PCR第5个循环，消耗了16对引物B．脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到5′端C．PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2＋等D．用图中引物扩增至少四个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的产物对点训练A3′Mg2＋两个循环DNA片段基因1

基因2

基因3放大终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子知识拓展：原核细胞的基因结构编码区：编码蛋白质的合成非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达与RNA聚合酶结合位点

RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。基因通常是有遗传效应的DNA片段——原核细胞的基因结构拓展：终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子翻译转录mRNA蛋白质原核基因的表达基因通常是有遗传效应的DNA片段——真核细胞的基因结构间隔的、不连续的内含子外显子拓展：终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子真核基因的表达加工转录mRNA前体成熟mRNA外显子内含子翻译蛋白质1234512435不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列基因通常是有遗传效应的DNA片段原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都有能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成的连续不连续编码区非编码非编码序列=非编码区原核基因：非编码序列真核基因：=非编码区+内含子拓展：××√判断题1．原核细胞的基因结构中没有内含子，只有外显子。（）2．基因结构中的非编码序列通常是具有调控作用的。（）3.启动子就是起始密码，终止子就是终止密码。（）对比启动子起始密码子终止子终止密码子所在位置DNAmRNADNAmRNA作用RNA聚合酶的结合位点，转录的起始点。翻译的起始点AUG(甲硫氨酸）GUG（缬氨酸）转录的终点翻译的终点（UAA、UGA、UAG)阅读教材P80，回答下列问题：1.获取Bt基因后，如果直接把目的基因导入受体细胞，可能会出现什么样的结果？如何避免该结果的发生呢？2.将Bt基因送入受体细胞的载体需要具备什么条件？3.要使Bt基因在受体细胞表达，载体还需要具有哪些结构？游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。限制酶切割位点；自我复制或将DNA整合到受体细胞；具有标记基因；安全启动子、终止子什么是基因表达载体？2个切口1个切口重组质粒体外为什么要构建基因表达载体？1、目的---基因工程的核心①使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。2、组成位置：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，转录的起始信号基因的上游人们所需要的基因位置：功能：基因的下游转录的终止信号用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞DNA复制所需结构第二步：基因表达载体的构建（2023·全国·统考高考真题）(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为

；②为

，其作用是

；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是

。终止子

启动子

RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是

。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有

（答出2个结构即可）。RNA聚合酶

限制酶切割位点、标记基因、复制原点等标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点基因表达载体必须具备的条件基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点的序列。目的基因和质粒通常要用相同的限制酶进行切割，从而产生相同的黏性末端，进而DNA连接酶发挥作用

。4【思考】①质粒有几个游离的磷酸基团？0②对质粒用不同限制酶切割两次会得到几个产物(片段)？2③3.构建过程载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个切口获得目的基因基因表达载体或能产生相同末端的限制酶处理（同尾酶）复习与提高(P98)

1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点,其结构和简单的操作步骤如下图所示。④将连接产物导入大肠杆菌请根据以上信息回答下列问题。（1）在第②步中,应怎样选择限制酶？（2）在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质？（1）：应选择用相同的限制酶或切割能产生相同末端的限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，并且注意限制酶的切割位点不能位于目的基因的内部，以防破坏目的基因，限制酶也不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复制原点等结构。（2）：加入DNA连接酶两位同学拼接出了两种“重组质粒”正向连接反向连接构建基因表达载体中遇到的问题？目的基因与质粒的连接载体目的基因自连片段间的连接质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1单酶切的缺点①目的基因和质粒自身环化②正、反两个方向都能拼接思考：如何防止质粒或目的基因自身环化和正反接问题呢？双酶切法防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，可采用双酶进行切割。（2024·全国·高考真题）(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在

（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是

。避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化

T4DNA连接酶（2024·重庆·高考真题）此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是

。酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接（反向连接）（2025·湖南·高考真题）为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物

对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为

bp。782P1和P3扩展：限制酶的选择问题：为了避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接，可用

和

两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。抗性基因PstⅠ和EcoRⅠ1．限制酶的选择原则:【重点难点·透析】(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，不可破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。1．限制酶的选择原则:【重点难点·透析】(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类③确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ(单酶切)；为避免目的基因、质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(双酶切)。(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。【重点难点·透析】(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类1．限制酶的选择原则:（2021·辽宁·统考高考真题）(2)图1为所用载体图谱示意图，为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入

和

两种不同限制酶的识别序列。PvitⅡEcoRI

限制酶的选择1.酶切不能破坏载体的复制原点、启动子、终止子、标记基因等特殊序列；也不能破坏目的基因。2.限制酶的识别序列只能位于启动子与终止子之间，以方便目的基因插入启动子与终止子之间；思考：标记基因一定不能被酶切吗？请根据以上信息回答下列问题。（3）选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有哪些优势？（4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什么颜色？为什么？（3）：该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmpR

基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ

基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。（4）：含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达形成B-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解。（2024·安徽·高考真题）(2)使用BamHI和SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是

。在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成限制酶的选择1.酶切不能破坏载体的复制原点、启动子、终止子、标记基因等特殊序列；也不能破坏目的基因；2.限制酶的识别序列只能位于启动子与终止子之间，以方便目的基因插入启动子与终止子之间；3.①若载体上只有1个标记基因，一般不能破坏其结构，否则无法在导入重组载体后对重组DNA分子进行筛选或发挥相应作用；②若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，便于进行双重筛选。（2022·湖北·统考高考真题）(3)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用

酶切割S基因的cDNA和载体。XbaⅠ、HindⅡ限制酶的选择1.酶切不能破坏载体的复制原点、启动子、终止子、标记基因等特殊序列；也不能破坏目的基因；2.限制酶的识别序列只能位于启动子与终止子之间，以方便目的基因插入启动子与终止子之间；3.①若载体上只有1个标记基因，一般不能破坏其结构，否则无法在导入重组载体后对重组DNA分子进行筛选或发挥相应作用；②若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，便于进行双重筛选。4.为保证目的基因与载体正确连接，同时避免目的基因与载体自身环化，需要选择两种切割位点不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切。（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（

）A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接C（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，重组质粒和质粒DNA片段大小不一样D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落正接和反接D（2025年6月河北高考题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：（1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是

和

。模板与引物在PCR反应的

阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为

。脱氧核苷酸

引物

复性PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤（90~95℃使双链DNA解旋为单链），普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行。（2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加

（填两种限制酶）的识别序列。SmaⅠ和EcoRⅠ（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：(2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有

酶切位点。

BamHI（2025·陕晋青宁卷·高考真题）(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的

（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5’-

-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是

，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。5'端

AGATCT

BamHⅠ、EcoRⅠ同尾酶是什么？有什么实际意义？目的基因所在的DNA片段上有BamHI和BclI的酶切位点，但BamHI的酶切位点位于目的基因