3.2基因工程的基本操作程序课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节基因工程的基本操作程序普通棉花转基因抗虫棉

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的抗虫机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？

从社会中来基因工程培育抗虫棉的思路：苏云金杆菌提取Bt抗虫蛋白基因导入棉花细胞抗虫棉Bt基因表达

苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。基因工程基本操作的四个步骤1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定1.从苏云金杆菌提取Bt基因2.Bt基因与载体DNA连接3.Bt基因导入棉花细胞4.检测Bt基因能否在棉花细胞内稳定遗传和表达。问题1：要让棉花细胞具有Bt抗虫蛋白基因，表达出抗虫特性需哪些步骤？（需“分子手术刀”—限制酶）（需“分子缝合针”—DNA连接酶）（需“分子运输车”—载体）(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。(2)实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。目的基因一、目的基因的筛选和获取补充：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区RNA聚合酶结合位点内含子外显子

启动子终止子真核细胞的基因结构编码区非编码区：外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列与原核基因相同，首端有启动子，尾端有终止子。补充：真核细胞的基因结构转录后再加工修饰，去除内含子转录出来的序列胰岛素基因筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。实例：Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？一、目的基因的筛选和获取目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪

明确了目的基因后，该怎么获取它?序列数据库（如GenBank）核苷酸序列比对氨基酸序列比对序列比对工具（如BLAST）一、目的基因的筛选和获取方法1：人工合成法蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列推测推测目的基因（已知氨基酸序列合成DNA）①化学合成法（逆推法）若基因较小，核苷酸序列已知，就可用DNA合成仪（脱氧核苷酸为原料）用化学合成法直接人工合成②反转录法提取目的基因的mRNA单链DNA逆转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)用化学合成法获取的目的基因的序列唯一吗？不是。因为密码子具有简并性一、目的基因的筛选和获取苏云金杆菌Bt基因？快速获得大量Bt基因PCR——聚合酶链式反应原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。提取PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。方法2：利用PCR技术获取扩增目的基因一、目的基因的筛选和获取1.概念：聚合酶链式反应生物体外特定DNA片段PCR全称为

，是一项在

复制

的核酸合成技术。3.原理：DNA半保留复制2.目的：获取大量的目的基因（1）酶：（2）原料：（3）模板：（4）能量：（5）引物细胞内DNA复制需要的条件：DNA母链4种脱氧核苷酸（DNA）解旋酶、DNA聚合酶ATP方法2：利用PCR技术获取扩增目的基因一、目的基因的筛选和获取什么是引物？引物是能与DNA母（模板)链的一端互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。其作用是能定位目的基因的位置，与母链结合，并为子链的延伸提供起点。为什么DNA复制需要引物？5’3’GGAGTAGC3’5’ATCGCCTC5’3’引物2GGAG5’3’ATCG引物1DNA聚合酶DNA聚合酶DNA合成的方向：从子链的5’端→3’端延伸想想：一个DNA复制一次需要几个引物？两个引物两个引物的序列相同吗？一般不同DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能，引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端开始合成子链。ATGCATGC5，端含游离磷酸基团3，端（含游离羟基）3，端5，端（1）DNA单链两端的命名15324基本单位－脱氧核苷酸问题3：如果我们对Bt基因的核苷酸序列一概不知，能否利用PCR技术扩增Bt基因？

无法合成引物，故无法扩增目的基因。4.PCR技术前提条件：已知一段目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物

①DNA母链（需含有目的基因）②四种脱氧核苷酸(或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP)③耐高温的DNA聚合酶（不需要解旋酶，DNA在高温下解旋）⑥能严格控制温度的温控设备PCR扩增仪⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+激活DNA聚合酶）④引物（分别与DNA2母链相结合的2种引物）问题4：结合细胞内DNA复制所需要的条件，思考PCR技术需要哪些条件？补充：dNTP

腺嘌呤脱氧核糖PPP~~HOH

在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dCTP、dTTP），既可作原料，又能提供能量。——脱氧核糖核苷三磷酸——腺嘌呤脱氧核糖核苷三磷酸3’5’3’5’①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。3’5’DNA母链13’5’DNA母链2注意：不需要解旋酶基本过程变性复性延伸一、目的基因的筛选和获取5.PCR技术过程：3’5’3’5’3’5’引物13’5’引物2②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。3’5’DNA母链13’5’DNA母链2注意：引物结合在模板链

端，引导子链从

方向复制。3'5'端→3'端一、目的基因的筛选和获取5.PCR技术过程：③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。3’5’3’5’3’5’3’5’注意：复性和延伸都是从子链

方向进行。5'端→3'端一、目的基因的筛选和获取5.PCR技术过程：第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第一轮循环的产物第二轮循环的产物一、目的基因的筛选和获取5.PCR技术过程：第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。第二轮循环的产物第三轮的产物第二轮循环的产物第三轮的产物一、目的基因的筛选和获取5.PCR技术过程：PCR得到的DNA产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。

即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。一、目的基因的筛选和获取5.PCR技术过程：耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。5.PCR技术过程(1)高温变性（超过90℃）：双链DNA模板在高温加热作用下，

断裂，形成_____氢键单链DNA(2)低温复性（50℃左右）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。双链(3)中温延伸（72℃左右）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。DNA链5.PCR过程：目的基因受热形成单链→与引物结合→在DNA聚合酶的作用下延伸形成DNA3’3’3’3’

第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’PCR得到的DNA产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。

即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。PCR反应（补充）1.思考：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’目的基因目的基因第三次循环PCR反应（补充）①由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成

形式扩增。指数2n②经过n次扩增循环后，DNA分子数为

，需要引物数量为

。2n+1-2引物个数=新增单链=2n+1-2例题：若消耗了引物62个,则进行了几轮的扩增。5一、目的基因的筛选和获取5.PCR技术结果：1.引物在PCR中能重复利用吗？不能2.用PCR可以扩增mRNA吗？（P79旁栏思考）应先将RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增。PCR不能直接扩增RNAcDNA：以mRNA为模板，合成的与其互补的单链DNA。思考讨论一、目的基因的筛选和获取思考讨论mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交双链；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子一、目的基因的筛选和获取方法2：利用PCR技术获取和扩增目的基因——重点知识小结1.概念：聚合酶链式反应生物体外特定DNA片段PCR全称为

，是一项在

复制

的核酸合成技术。3.原理：DNA半保留复制2.目的：获取大量的目的基因5.条件：

（1）模板DNA：即目的基因的两条链

（2）耐高温的DNA聚合酶

（3）原料：（四种脱氧核苷酸）和能量

4.前提条件：有已知一段目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物（4）引物

6.过程：（高温）变性→（低温）复性→（中温）延伸

7.方式：以_____方式扩增，即___（n为扩增循环的次数）8.结果：指数2n在短时间内大量扩增目的基因一、目的基因的筛选和获取比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所酶温度结果联系解旋酶催化主要在细胞核内解旋酶、DNA聚合酶等细胞内温和条件合成整个DNA分子①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料：均为四种脱氧核苷酸③酶：均需DNA聚合酶④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成DNA在高温下变性解旋细胞外（主要在PCR扩增仪内）耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）控制温度，需在不同温度下进行扩增特定的DNA片段或基因(1)在PCR技术扩增目的基因时

（需要/不需要）解旋酶，原因是

。(2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计

种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至55∽60度，此操作的目的是

。例题：如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题不需要PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶两①90∽95度高温使DNA解聚为单链，②然后冷却至55∽60度使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合一、目的基因的筛选与获取例：如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题（3）利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是

，在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是

。DNA聚合酶只能特异地复制处于

之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了

轮的DNA复制。(4)目的基因能被准确扩增的原因是

。DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增两个引物从子链的5′端向3′端延伸5目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行

(2n+1-2)=62方法3：基因文库获取目的基因的获取方法①建立基因组文库某生物所有DNA特定的限制酶基因组所有基因每个基因和载体结合重组DNA分子导入受体菌基因组文库一、目的基因的筛选和获取②建立cDNA基因文库某种生物的成熟mRNA单链DNA双链DNA片段（cDNA）导入受体菌中储存cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶与载体连接方法3：基因文库获取目的基因的获取方法一、目的基因的筛选和获取基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以方法3：基因文库获取目的基因的获取方法一、目的基因的筛选和获取二、基因表达载体的构建问题1:获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解

那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;

②使目的基因能够表达和发挥作用思考：各个元件有什么功能？请准确描述出来。2.基因表达载体的组成构建基因表达载体是基因工程的核心。二、基因表达载体的构建目的基因：能控制表达出所需要的特殊性状(必须插到启动子和终止子之间)复制原点：DNA复制的起始位点终止子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的下游功能：终止转录四环素抗性基因、荧光蛋白基因等启动子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来二、基因表达载体的构建提问：目的基因该插入什么位置？目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入

，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。诱导型启动子：诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达诱导型启动子：二、基因表达载体的构建提问：辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)提问：请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。二、基因表达载体的构建3.基因表达载体构建的过程：质粒载体限制酶目的基因限制酶切割位点限制酶切割位点限制酶在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段DNA连接酶重组DNA分子基因表达载体（核心工作）二、基因表达载体的构建问题探讨：1、使用一种限制酶进行切割（单酶切），是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？单酶切：选择一种限制酶同时对目的基因和质粒切割。同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同末端的一类限制酶。单酶切的缺点（效率不高）:①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接正向连接反向连接122’1’22’1’1自连两两连接目的基因自身环化载体自身环化目的基因与目的基因连接载体与载体连接目的基因与载体连接同一种限制酶切割获得的目的基因和载体，混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：二、基因表达载体的构建问题探讨：2、如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？双酶切的优点:①

防止质粒重新环化②防止目的基因自身环化③

防止质粒与目的基因反向连接双酶切：选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割二、基因表达载体的构建限制酶的选择原则(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中

；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择

和

两种限制酶。(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择

，而不选择

。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择

。PstⅠSmaⅠSmaⅠPstⅠPstⅠEcoRⅠ1.目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为

。

(2)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是

。

(3)构建基因表达载体时,可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA,但会导致

等问题,为避免以上问题出现,应使用

两种限制酶。

SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因目的基因自身环化、目的基因不能定向连接BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)限制酶和DNA连接酶(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上

,其是

识别和结合的部位。

RNA聚合酶启动子目录03三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞合作探究：请同学们自主阅读教材P81，小组合作思考讨论完成问题。

1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？各自适用于什么生物？2.农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。3.请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。三、将目的基因导入受体细胞1.转化将目的基因导入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。基因表达载体受体细胞导入动物植物微生物三、将目的基因导入受体细胞2.转化的受体细胞将目的基因导入受体细胞受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法（我国科学家独创）（常用）三、将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法）1.目的基因导入植物细胞含目的基因的DNA溶液方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液（含构建好的基因表达载体的溶液）直接注入子房中。三、将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）1.目的基因导入植物细胞方法二：在植物受粉后的一定时间内，花粉管还没有愈合前，剪去柱头，将DNA（含目的基因）溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。适用生物：开花植物三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞①农杆菌特点：是一种微生物，自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

实质是基因重组。②原理：农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的

可转移至被侵染的植物细胞，并整合到该植物细胞的

。T-DNA染色体DNA上Ti质粒思考：构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？T—DNA上（可转移的DNA）农杆菌转化法的过程Ti质粒目的基因构建基因表达载体导入植物细胞（注意：农杆菌进入后，将目的基因插入植物细胞的染色体DNA上）培养再生成具有新性状的植株转入农杆菌(注意：目的基因插入Ti质粒的T-DNA中）原理：技术：植物细胞的全能性植物的组织培养T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物组织培养三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞1.两次拼接第一次拼接：第二次拼接(非人工操作)：2.两次导入第一次导入：第二次导入(非人工操作)：导入的植物的受体细胞可以是什么细胞呢？目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

第1次拼接第2次拼接第1次导入第2次导入三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞④具体转化方法：导入的植物的受体细胞可以是什么细胞呢？a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；受体细胞为_______与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株体细胞b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；受体细胞为_______花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定受精卵三、将目的基因导入受体细胞2.目的基因导入动物细胞（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵思考：为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？①

体积大，易操作。②

全能性高，易培养成完整个体。（3）过程:构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物三、将目的基因导入受体细胞2.目的基因导入动物细胞了解：病毒介导法:科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。三、将目的基因导入受体细胞3.目的基因导入微生物细胞（1）常用方法：Ca2+处理法Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。Ca2+（CaCl2溶液）感受态细胞吸收（2）受体细胞:微生物（常用大肠杆菌）优点：①繁殖快②多为单细胞③遗传物质相对较少三、将目的基因导入受体细胞实例：利用转基因大肠杆菌生产药物Ca2+处理大肠杆菌细胞感受态细胞(细胞膜通透性增强)基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子（3）过程:注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。三、将目的基因导入受体细胞小结：目的基因导入受体细胞方法比较细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法

受体细胞

转化过程花粉管通道法农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法体细胞或受精卵受精卵原核细胞将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞DNA上提纯含目的基因的表达载体↓显微注射↓受精卵发育↓获得具有新性状的个体Ca2＋处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子目录04四、目的基因的检测与鉴定1.目的:检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；（检查转基因抗虫棉是否培育成功）2.检测内容及方法:类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNADNA分子杂交技术或PCR目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状病原体接种实验等第四步、目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR扩增碱基互补配对原则原理：（1）分子生物学水平鉴定提取DNA根据目的基因的序列设计一对PCR引物PCR操作是否扩增出目的基因电泳DNA测序技术M：marker（标准参照物，指示分子大小，碱基对）；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转基因生物转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果第四步、目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法2：DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：（1）分子生物学水平鉴定提取DNA样本基因DNA酶切DNA片段电泳目标片段（事先不知道）转膜硝酸纤维素膜第四步、目的基因的检测与鉴定（1）分子生物学水平鉴定检测工具：基因探针：带有标记（放射性同位素标记或荧光分子标记等）的单链核酸片段(DNA或RNA)，能与目的基因的一条链发生碱基互补配对。基本思路：①制作基因探针,并用PCR扩增;②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。④如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。基因探针第四步、目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法2：DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：方法1：PCR扩增转基因生物提取RNARNA作为模板PCR操作电泳是否扩增出目的基因逆转录cDNA②检测目的基因是否转录出了mRNA（1）个体生物学水平鉴定第四步、目的基因的检测与鉴定方法2：分子杂交技术②检测目的基因是否转录出了mRNA（1）个体生物学水平鉴定基本思路：1、制作基因探针，并用PCR扩增2、提取受体细胞全部mRNA，使基因探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明转录出了mRNA。基因探针转基因生物的mRNA杂交分子（可检测）变性第四步、目的基因的检测与鉴定③检测目的基因是否翻译成蛋白质（1）个体生物学水平鉴定方法：抗原—抗体杂交技术

抗原与抗体的特异性结合原理：过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物放射性检测

（出现杂交带）第四步、目的基因的检测与鉴定转Bt基因非转基因2.个体生物学水平的鉴定（1）通过抗虫、抗病的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。第四步、目的基因的检测与鉴定转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常2.个体生物学水平的鉴定第四步、目的基因的检测与鉴定类型检测内容方法分子水平的检测目的基因是否插入到转基因生物

上目的基因是否转录出

.目的基因是否翻译出

.个体生物学水平的鉴定转基因生物是否表现出相应的特性如抗虫、抗病的接种实验DNA分子杂交技术或PCR等技术抗原-抗体杂交技术染色体DNAmRNA蛋白质第四步、目的基因的检测与鉴定习题检测1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（）√××一、概念检测习题检测2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸D习题检测二、拓展应用1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（）A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D．只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2．在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（）A．大肠杆菌的质粒B．切割DNA分子的酶C．DNA片段的黏性末端D．用来识别特定基因的DNA探针CA练习与应用练习与应用二、拓展应用有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么?XbaⅠ因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。二、拓展应用练习与应用目录05五、DNA片段的扩增及电泳鉴定五、DNA片段的扩增及电泳鉴定一.实验原理:（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。变性90˚C延伸72˚C退火50˚C五、DNA片段的扩增及电泳鉴定一.实验原理:2.

DNA片段电泳鉴定的原理：（1）DNA分子具有________________，在一定的________下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着_______________________的电极移动，这个过程就是__________；可解离的基团pH电泳与它所带电荷相反（2）PCR的产物一般通过__________________来鉴定；（3）在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关（4）凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度DNA分子的大小构象染色300nm紫外灯（1）电泳：DNA分子具有_______________，在一定的________下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。可解离的基团pH相反一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带

，在电场中DNA便向

泳动。负电荷正极磷酸基团能解离出氢离子，剩下的部分带负电荷。样品点样孔应靠近

极。负五、DNA片段的扩增及电泳鉴定一.实验原理:（2）鉴定方法：PCR的产物一般通过

来鉴定。琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越

，能够通过的核酸分子越

。琼脂糖凝胶电泳在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和______等有关凝胶的浓度DNA分子的大小构象小小五、DNA片段的扩增及电泳鉴定核酸染色剂常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。五、DNA片段的扩增及电泳鉴定标准参照物（Marker）DNAMarker是

的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计

。样本DNA的大小已知的DNA分子大小五、DNA片段的扩增及电泳鉴定五、DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA分子中的磷酸基团能解离出氢离子，剩下的部分（DNA的磷酸残基）带负电荷，因此DNA分子可从负极向正极迁移，DNA分子量越大，迁移的越慢。分子量大（长片段）分子量小（短片段）Marker:DNA分子量标准一.实验原理:五、DNA片段的扩增及电泳鉴定二.材料用具:①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）PCR仪微量离心管微量移液器电泳装置五、DNA片段的扩增及电泳鉴定二.材料用具:推动杆调节旋钮卸枪头按钮体积刻度吸液杆枪头（注意：加不同样品时，需要更换枪头）五、DNA片段的扩增及电泳鉴定三.实验步骤——DNA片段的扩增:10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μL⑦PCR反应体系的配方⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。五、DNA片段的扩增及电泳鉴定三.实验步骤——DNA片段的扩增:1、移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活。五、DNA片段的扩增及电泳鉴定2、离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。离心机三.实验步骤——DNA片段的扩增:五、DNA片段的扩增及电泳鉴定3、反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。可根据目的片段长度适当调整延伸时间三.实验步骤——DNA片段的扩增:制备凝胶观察鉴定进行电泳电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸