（正式版）DB22∕T 2012-2014 《福氏阿米巴原虫检测方法》

DB22DB22/T2012—2014福氏阿米巴原虫检测方法DetectionofNaegleriafowleri吉林省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009和GB1GB/T6682分析实验室用水规格和试验耐格里属阿米巴原虫NaegleriaSpp.耐格里属阿米巴属于双鞭毛阿米巴科原虫，多孳生于淡水中，有滋养体和包体呈长阿米巴型，大小为7×20µm，在不良环境中可形成有2根鞭毛的滋养体；包囊圆形，直径9µm，原发性阿米巴脑膜脑炎，因此又被称作“食脑虫”。），聚合酶链反应polymerasechainreaction[PCR]2聚合酶链反应（PCR）是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的热变性，寡核苷酸引物复性到单链靶序列上以及由热稳定DNA聚合酶催化的复性引物引导的新生DNA上游引物：5’-GTGAAAACCTTTTTTCCATTTACA-3’下游引物：5’-AAATAAAAGATTGACCATTTGAAA-3’4.2.1阿米巴生理盐水(AmebicSaline,简称AS)（见附录A.4.2.2阿米巴无营养琼脂平板(NonnutrientAgar,简称N4.2.4阿米巴培养缓冲溶液（见附录A4.2.101.0%琼脂糖凝胶（见附录4.2.11电泳上样缓冲液（见附录）；3用无菌试剂瓶直接取指定位置待检水样10006.2.1待检水样经单层纱布初步过滤，在20倍或40倍倒置显微镜下,检查NNA平板上的虫体集落并标记,然后在涂有经灭活大肠杆菌的NNA平板反复转接培养直至无菌。刮取虫体,放入盛有0.2mL蒸馏水的1.5mL的离心管中，室温放置1h4PCR为50μL体系：取8μLPCR产物，与2μL上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。同法加入阴、阳性对照PCR产物及标准分子量DL2000Mar5在NNA平板上呈放射性生长并在倒置显微镜下可见噬菌空斑的，可初步判定为样品中存在阿米巴原显微镜下可见一对或多根鞭毛的虫体，可初步6A.1阿米巴生理盐水(AS)——NaCl：120mg；A.2无营养琼脂平板（NNA）——阿米巴生理盐水：100mL；——琼脂粉：1.5g；——胰蛋白胨：10g；——酵母提取物：5g；取5mLLB培养基，接种单菌落大肠杆菌，37℃震荡过夜培养。大肠杆菌溶液121℃高压10min,冷——蒸馏水：1000mL；A.5溴化乙锭（EB）溶液——溴化乙锭：0.2g；——加灭菌蒸馏水至20mL。7A.6TAE电泳缓冲液制备——二水乙二铵四乙酸二钠：18.6g；——灭菌蒸馏水：80mL；——氢氧化钠（1mol/LNaOH）调pH值至8.0；——灭菌蒸馏水加至100mL。A.6.250倍TAE电泳缓冲液配制）：——冰乙酸：57.1mL；）：——灭菌蒸馏水加至1000mL。A.71.0%琼脂糖凝胶板制备——琼脂糖：1g；——灭菌蒸馏水：98mL。微波炉中完全融化，待冷却至50-60℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5μL，摇匀，倒入电A.8上样缓冲液溴酚蓝0.2g，加10mL灭菌蒸馏水过夜溶解。50g蔗糖加入50mL灭菌蒸馏水溶解后，移入已8(资料性附录)结果图示和目的片段序列B.1耐格里阿米巴形态示意图B.2培养阳性结果(滋养体以及包囊×400)B.3耐格里阿米巴鞭毛体(×1000)(注：n为细胞核；f为鞭毛)B.4福氏阿米巴原虫标准株PCR鉴定阳性结果图(注：1为DL2000;2为福氏阿米巴原虫阳性PCR扩增结果)B.5目标片段序列Gtgaaaaccttttttccatttacaaaaaataactctgtgcaatggagcacacggctcgtgtatcgcgatatgtaatgagattcgttagcctcgagattcatcaaattggtgaacacagtctggacctcgcaagaggtaagttttatat