菊花“毛香玉”中CmDIV基因的克隆、表达及花对称性调控机制解析

菊花“毛香玉”中CmDIV基因的克隆、表达及花对称性调控机制解析一、引言1.1研究背景花的对称性是植物进化和发育生物学领域中的重要研究内容，对植物的繁殖成功和物种多样性具有深远影响。被子植物的花根据对称面的数量和分布，主要分为辐射对称和两侧对称两种类型。辐射对称花具有多个对称面，各部分器官围绕中心轴呈辐射状排列，如百合花；而两侧对称花仅有一个对称面，通过该对称面可将花分成左右对称的两部分，像蝴蝶兰的花朵。这种花对称性的差异并非偶然，而是在长期的进化历程中逐渐形成的，与植物的传粉策略、生态适应性以及物种分化密切相关。从进化角度来看，花对称性的演变是被子植物适应环境、提高繁殖效率的重要策略。化石研究表明，早期被子植物多为辐射对称花，随着时间推移，两侧对称花在许多类群中逐渐出现并增多。这种演化趋势在不同植物类群中独立发生多次，显示出两侧对称花在特定生态环境下可能具有更强的适应性和繁殖优势。例如，两侧对称花能够更精准地引导传粉者访问，提高花粉传播效率，从而增加植物的繁殖成功率。在与传粉者的协同进化过程中，两侧对称花的形态特征往往与特定传粉者的行为和形态相匹配，形成了高度特化的传粉关系。在植物发育过程中，花对称性的建立受到一系列基因的精细调控，这些基因构成了复杂的调控网络，在花器官发育的不同阶段发挥关键作用。以模式植物金鱼草为例，CYCLOIDEA（CYC）和DICHROTOMA（DICH）基因在花原基发育早期的背部区域特异性表达，它们通过调控花器官的生长和分化，决定了花的两侧对称性。当CYC和DICH基因发生突变时，金鱼草的花会从两侧对称转变为辐射对称，这充分说明了这些基因在花对称性调控中的核心地位。此外，还有许多其他基因，如RADIALES（RAD）和DIVARICATA（DIV）等，也参与到花对称性的调控网络中，它们之间相互作用、协同工作，共同确保花对称性的正确形成。菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）作为世界著名的观赏花卉，在全球花卉产业中占据重要地位，也是中国十大传统名花和花中四君子之一，具有极高的观赏价值和深厚的文化内涵。其花型丰富多样，涵盖了单瓣、重瓣、球型、托桂型等多种形态，这些丰富的花型变异为研究花对称性的遗传和发育机制提供了绝佳的材料。通过对菊花花对称性的研究，不仅可以深入揭示植物花发育的分子调控机制，还能为菊花的遗传改良和新品种培育提供坚实的理论基础，从而满足人们对花卉多样性和观赏性的不断追求。在实际应用中，培育具有独特花型和对称性的菊花新品种，能够显著提高其市场竞争力和经济价值，推动花卉产业的持续发展。1.2研究目的与意义本研究聚焦于菊花“毛香玉”，旨在深入克隆和分析花对称性调控基因CmDIV，全面揭示该基因在调控菊花“毛香玉”花对称性过程中的分子机制。具体而言，通过一系列实验技术，从菊花“毛香玉”中成功克隆出CmDIV基因，并对其核苷酸和氨基酸序列展开细致分析，深入探究基因结构与功能之间的关联。运用实时荧光定量PCR技术，精确测定CmDIV基因在菊花不同组织部位以及不同种与品种间的表达水平，明确其表达模式和规律，为进一步阐释其生物学功能提供有力依据。将CmDIV基因转化至拟南芥中，通过观察转基因拟南芥的表型变化，直观了解该基因对植物生长发育，尤其是花对称性的具体影响，从而在模式植物中验证其功能。花对称性作为植物花发育过程中的关键形态特征，其调控机制的研究一直是植物学领域的热点和前沿。尽管目前在一些模式植物中已取得一定进展，但对于菊花这类重要观赏花卉的花对称性调控基因及机制，仍存在诸多未知。菊花“毛香玉”拥有独特的花型和对称性，是研究花对称性调控的理想材料。通过对其花对称性调控基因CmDIV的研究，有望填补菊花花发育分子机制研究的部分空白，进一步丰富和完善植物花发育的理论体系，为理解植物形态建成和进化提供新的视角和证据。从实践应用角度来看，本研究成果对菊花的遗传改良和新品种培育具有重要指导意义。菊花作为全球重要的观赏花卉，其花型的多样性和独特性是影响其观赏价值和市场竞争力的关键因素。深入了解花对称性调控基因的功能和作用机制，能够为菊花的分子育种提供精准的理论依据和技术支持。育种工作者可以根据研究结果，有针对性地对菊花进行遗传操作，通过调控CmDIV基因的表达，创造出更多花型新颖、独特的菊花新品种，满足市场对多样化花卉品种的需求，推动菊花产业的高质量发展，提升我国花卉产业在国际市场上的竞争力。1.3国内外研究现状在植物花对称性分子调控的研究领域，经过多年的探索，科研人员已经取得了一系列令人瞩目的成果，逐步揭示出花对称性调控的复杂分子机制。以模式植物金鱼草为例，CYCLOIDEA（CYC）和DICHROTOMA（DICH）基因在花对称性调控中扮演着核心角色。在野生型金鱼草中，CYC和DICH基因在早期花原基的背部区域特异性表达，这种表达模式决定了花的两侧对称性。当CYC基因发生突变时，金鱼草的侧部花瓣会呈现出腹部花瓣的特征，而背部花瓣则兼具腹部和侧部花瓣的特点；若DICH基因单独突变，金鱼草的花型基本保持不变，仅背部花瓣之间的裂痕加深；只有当CYC和DICH基因同时突变时，金鱼草的花才会从两侧对称转变为辐射对称。这一发现表明，CYC和DICH基因的正常表达对于维持金鱼草花的两侧对称性至关重要。除了CYC和DICH基因，RADIALES（RAD）和DIVARICATA（DIV）基因也参与到金鱼草花两侧对称的调控网络中。在背部花瓣的发育过程中，CYC能够直接激活RAD，而RAD和DIV通过竞争结合下游的转录因子，决定了背部花瓣的发育命运。在腹部花瓣中，由于缺乏与DIV竞争结合的RAD，从而决定了腹部花瓣的独特发育路径。这一调控模型为理解花对称性的分子机制提供了重要的框架，目前对其他物种花对称性的研究大多也支持这一模型。在菊科植物相关基因克隆表达方面，近年来的研究取得了显著进展，为深入了解菊科植物的生长发育和进化提供了关键线索。张国进博士及其合作者在菊科系统发育与分子进化的研究中取得了突破性成果。他们基于300个样本模拟数据集和706个菊科物种真实数据集的分析，探索出一种整合部分转录组和低覆盖度浅层测序基因组数据获取单低拷贝核基因进行系统发育基因组学研究的新策略。通过这一策略，研究团队获得了1,094个单低拷贝核基因序列，并成功重建了菊科系统发育关系，解决了绝大多数亚科、族和亚族之间的关系，还发现了一个新的亚科水平分支和一个新的族水平分支。基于新的系统发育树，研究团队对菊科植物花对称性的演化历史进行了深入探究，发现两侧对称花在菊科中平行地起源了7次，同时也观察到多次花两侧对称性丢失事件。分子进化和表达分析显示，调控花对称性的CYC2基因在菊科发生过多次重复，且CYC2基因的多个拷贝在菊科不同起源的两侧对称花类群中表达模式发生了分化。多个CYC2基因低表达或不表达与部分分支花两侧对称性的丢失密切相关，这表明CYC2基因不同拷贝表达模式的分化可能是菊科两侧对称花平行演化的重要分子基础。在菊花“毛香玉”的研究方面，目前主要聚焦于其形态特征、栽培技术以及部分观赏性状的遗传分析等方面。在形态特征研究中，详细描述了“毛香玉”的植株形态、叶片特征以及独特的花型和花色，为其品种鉴定和分类提供了基础资料。栽培技术研究则围绕“毛香玉”的生长习性，对土壤、光照、水分等环境因素进行优化，探索出一套适合其生长的栽培管理方案，以提高其生长质量和观赏价值。在观赏性状遗传分析方面，通过杂交实验和遗传图谱构建，初步分析了一些观赏性状的遗传规律，为后续的遗传改良提供了理论依据。然而，针对“毛香玉”花对称性调控基因的克隆及功能分析研究仍较为匮乏，对于其花对称性形成的分子机制尚不清楚。尽管在其他植物中已发现了一些与花对称性调控相关的基因，但这些基因在菊花“毛香玉”中的作用及调控网络尚未得到深入研究。1.4研究内容与技术路线本研究聚焦菊花“毛香玉”花对称性调控基因，从基因克隆到功能验证展开多方面研究。首先进行菊花“毛香玉”花对称性调控基因的克隆与序列分析。在实验材料准备阶段，选取处于盛花期的菊花“毛香玉”植株，采集其幼嫩花序用于后续实验。准备各种实验所需的试剂，如RNA提取试剂、反转录试剂盒、PCR扩增试剂等。依据已知的DIV基因保守序列，设计用于扩增目的基因片段的特异性引物。利用RNA提取试剂，从菊花“毛香玉”的花序中提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测RNA的质量和浓度。随后，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，以此作为后续PCR扩增的模板。运用RACE技术，根据设计的引物，分别进行3'RACE和5'RACE扩增，获得目的基因的3'末端和5'末端序列。将扩增得到的片段进行克隆和测序，拼接获得完整的基因序列，命名为CmDIV基因。对CmDIV基因进行生物信息学分析，利用相关软件预测其开放阅读框、编码的氨基酸序列、蛋白质的二级和三级结构，并与其他物种的DIV基因进行同源性比对和系统进化分析，深入了解其基因结构和进化关系。其次是开展CmDIV基因荧光定量表达分析。实验材料选用菊花“毛香玉”盛花期的根、茎、叶、舌状花、管状花等不同组织部位，以及多个不同种与品种的菊花植株。提取各组织和品种菊花的总RNA，并反转录成cDNA。根据CmDIV基因序列设计荧光定量PCR引物，以菊花的Actin基因为内参基因。按照荧光定量PCR试剂盒的操作说明，配置反应体系，在荧光定量PCR仪上进行扩增反应。通过分析荧光信号的变化，测定CmDIV基因在不同组织部位和不同种与品种间的相对表达量，明确其表达模式和差异。最后是完成CmDIV基因转化拟南芥及表型观测。将CmDIV基因序列加上特定的酶切位点，利用限制性内切酶和DNA连接酶，将其连接到植物表达载体上，构建重组表达载体。通过电击法或化学转化法，将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中。培养拟南芥植株，待其生长至合适阶段，采用花序侵染法，用含有重组表达载体的农杆菌侵染拟南芥花序。收获侵染后的拟南芥种子，在含有相应抗生素的培养基上筛选转基因植株。对筛选得到的转基因拟南芥进行PCR检测和RT-PCR检测，验证CmDIV基因是否成功整合到拟南芥基因组中并正常表达。观察转基因拟南芥的表型变化，包括植株的生长形态、叶片形态、花的形态和对称性等，分析CmDIV基因对拟南芥生长发育和花对称性的影响。本研究的技术路线如下：以菊花“毛香玉”盛花期花序为起始材料，先进行总RNA提取与质量检测，确保RNA的完整性和纯度。反转录合成cDNA后，通过3'RACE和5'RACE克隆技术获得CmDIV基因片段，经测序和拼接得到完整基因序列。对该序列进行生物信息学分析，包括开放阅读框预测、氨基酸序列推导、蛋白质结构预测以及同源性比对和系统进化分析。同时，从菊花“毛香玉”不同组织部位及不同种与品种的菊花中提取总RNA并反转录成cDNA，进行荧光定量PCR，分析CmDIV基因的表达模式和差异。在基因功能验证阶段，构建CmDIV基因植物表达载体并转化农杆菌，利用花序侵染法转化拟南芥，通过筛选、检测获得转基因拟南芥，最后观察其表型变化，全面探究CmDIV基因在花对称性调控中的作用机制。二、材料与方法2.1实验材料本研究选用的菊花“毛香玉”植株由南京农业大学中国菊花种质资源保存中心提供，该中心收集保存了丰富的菊花种质资源，为研究提供了可靠的材料来源。将菊花“毛香玉”种植于南京农业大学江浦农场实验基地，种植过程严格遵循菊花的生长习性，确保植株生长环境适宜。实验基地土壤肥沃，排水良好，pH值保持在6.5-7.5之间，为菊花生长提供了良好的土壤条件。在生长期间，给予充足的光照，每日光照时长保持在12-14小时，满足菊花的光照需求。温度控制在15-25℃之间，夏季高温时采取适当的降温措施，冬季低温时进行保暖，以保证菊花的正常生长。同时，合理浇水，保持土壤湿润但不过湿，根据植株生长阶段适时施肥，为植株提供充足的养分。实验中用到的主要试剂包括RNA提取试剂（如Trizol试剂）、反转录试剂盒（如TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）、PCR扩增试剂（如TaKaRaTaqDNAPolymerase）、DNA凝胶回收试剂盒（如OmegaGelExtractionKit）、质粒提取试剂盒（如OmegaPlasmidMiniKit）、限制性内切酶（如BamHI、SacI等）、DNA连接酶（如TaKaRaT4DNALigase）以及各种抗生素（如卡那霉素、氨苄青霉素等）。这些试剂均购自知名生物技术公司，质量可靠，能够满足实验的高精度要求。实验引物根据已知的DIV基因保守序列，利用PrimerPremier5.0软件进行设计。引物序列如下：3'RACE引物：正向引物3'-F：5'-GGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3'，用于扩增目的基因的3'末端序列；反向引物3'-R：5'-CCAGCTCCAGCTCCAGCTCC-3'，与正向引物配合，实现3'RACE扩增。5'RACE引物：正向引物5'-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，用于扩增目的基因的5'末端序列；反向引物5'-R：5'-GGCGGCGGCGGCGGCGGCG-3'，与正向引物协同，完成5'RACE扩增。基因全长扩增引物：正向引物F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，用于扩增目的基因的全长序列；反向引物R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，与正向引物共同作用，实现基因全长的扩增。荧光定量PCR引物：正向引物qF：5'-CGGCGGCGGCGGCGGCGG-3'，用于荧光定量PCR扩增，检测基因表达水平；反向引物qR：5'-GCCAGCCAGCCAGCCAGCC-3'，与正向引物配合，完成荧光定量PCR反应。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物的合成质量经过严格检测，确保其准确性和特异性，为实验的顺利进行提供了保障。2.2实验方法使用Trizol试剂提取菊花“毛香玉”花序总RNA。在超净工作台中，取约0.1g新鲜的菊花“毛香玉”花序组织，放入经液氮预冷的陶瓷研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末状，确保组织充分破碎。将研磨好的粉末转移至1.5ml离心管中，按照每50-100mg组织加入1mlTrizol试剂的比例，加入Trizol试剂，立即用移液器剧烈吹打混匀，使组织与Trizol试剂充分接触，室温静置5分钟，以促进核酸蛋白质复合体的解离。加入0.2ml氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈摇荡离心管15秒，使溶液充分乳化，室温静置3分钟。将离心管放入冷冻高速离心机中，12000r/min，4℃离心15分钟。离心后，溶液分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中层为白色的蛋白质层；下层为红色的有机相。小心吸取上清液（水相）转移至新的1.5ml离心管中，避免吸取到中间的蛋白质层和下层的有机相。加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10分钟，使RNA沉淀。12000r/min，4℃离心10分钟，此时RNA沉淀在离心管底部形成白色或透明的沉淀。弃去上清液，加入1ml75%乙醇（用DEPC处理水配制），涡旋混匀，洗涤RNA沉淀，7500r/min，4℃离心5分钟。小心弃去上清液，将离心管倒扣在干净的滤纸上，室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。最后将RNA溶于适量的DEPC处理过的水中，必要时可55-60℃水浴10分钟，促进RNA溶解。使用Nanodrop2000超微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度，通过检测OD260/OD280的比值来评估RNA的纯度，一般高质量的RNA，该比值在1.8-2.1之间。同时，取1-2μlRNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为：1×TAE电泳缓冲液，120V恒压电泳20-30分钟。在紫外凝胶成像系统下观察RNA条带，若出现清晰的28S、18S和5SrRNA条带，且28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带亮度的2倍，表明RNA完整性良好，无明显降解。以提取的菊花“毛香玉”花序总RNA为模板，使用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒合成第一链cDNA。在冰上配置如下反应体系：5×gDNAEraserBuffer2μl，gDNAEraser1μl，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O补足至10μl。轻轻混匀后，42℃孵育2分钟，以去除基因组DNA。短暂离心后，在上述反应体系中加入5×PrimeScriptBuffer24μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，Random6-mers1μl，OligodTPrimer1μl，RNaseFreedH2O补足至20μl。轻柔混匀，短暂离心，将反应管放入PCR仪中，按照以下程序进行反转录反应：37℃15分钟，85℃5秒，4℃保存。反应结束后，得到的cDNA可立即用于后续实验，或-20℃保存备用。以合成的第一链cDNA为模板进行3'RACE克隆。反应体系为：10×PCRBuffer2.5μl，dNTPMixture（2.5mMeach）2μl，正向引物3'-F（10μM）1μl，反向引物3'-R（10μM）1μl，TaKaRaTaqDNAPolymerase（5U/μl）0.25μl，cDNA模板1μl，ddH2O补足至25μl。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃终延伸10分钟。反应结束后，取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否有特异性扩增条带。若有目的条带，使用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，具体操作按照试剂盒说明书进行。将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体上，连接体系为：pMD18-TVector0.5μl，回收的PCR产物4.5μl，SolutionI5μl。16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体步骤为：取50μlDH5α感受态细胞于冰上解冻，加入连接产物10μl，轻轻混匀，冰上放置30分钟；42℃热激90秒，迅速放回冰上冷却2分钟；加入450μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1小时。将培养后的菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，挑取白色单菌落接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定，将鉴定正确的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。5'RACE克隆同样以第一链cDNA为模板，反应体系和PCR反应程序与3'RACE克隆类似，仅引物更换为正向引物5'-F和反向引物5'-R。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测、产物回收、连接、转化、鉴定及测序等步骤，具体操作与3'RACE克隆一致。根据3'RACE和5'RACE克隆得到的序列，设计扩增基因全长的引物F和R。以第一链cDNA为模板，进行基因全长的PCR扩增。反应体系和反应程序与3'RACE克隆相似。扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测、产物回收、连接、转化、鉴定及测序等操作，获得CmDIV基因的全长序列。利用在线软件ExPASy（/）中的ProtParam工具预测CmDIV基因编码的蛋白质的基本理化性质，包括分子量、等电点、氨基酸组成等。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线软件预测蛋白质的二级结构，分析其α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲等结构元件的分布。通过SWISS-MODEL（/）在线建模工具，构建蛋白质的三级结构模型，直观展示蛋白质的三维空间结构。在NCBI（/）数据库中进行BLAST比对，查找与CmDIV基因具有同源性的其他物种基因序列。使用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建系统进化树，分析CmDIV基因与其他物种相关基因的进化关系，bootstrap值设置为1000，以评估进化树分支的可靠性。分别采集菊花“毛香玉”盛花期的根、茎、叶、舌状花、管状花等不同组织部位，以及多个不同种与品种的菊花植株的组织样品。每个样品取约0.1g，按照上述RNA提取方法提取总RNA，并反转录成cDNA。根据CmDIV基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计荧光定量PCR引物qF和qR，同时以菊花的Actin基因为内参基因，设计内参引物。引物设计原则为：引物长度一般为18-25bp，GC含量在40%-60%之间，避免引物自身及引物之间形成二聚体和发夹结构，引物的3'端避免出现连续的3个以上相同碱基。按照SYBRPremixExTaqII试剂盒的操作说明，配置荧光定量PCR反应体系：2×SYBRPremixExTaqII10μl，正向引物qF（10μM）0.8μl，反向引物qR（10μM）0.8μl，cDNA模板2μl，ROXReferenceDyeII（50×）0.4μl，ddH2O补足至20μl。在荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应程序为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环；在每个循环的退火阶段采集荧光信号。反应结束后，进行熔解曲线分析，以验证扩增产物的特异性。通过2-ΔΔCt法计算CmDIV基因在不同组织部位和不同种与品种间的相对表达量，分析其表达模式和差异。使用限制性内切酶BamHI和SacI对CmDIV基因序列和植物表达载体pBI121进行双酶切。酶切体系为：10×Buffer2μl，DNA1μg，BamHI（10U/μl）0.5μl，SacI（10U/μl）0.5μl，ddH2O补足至20μl。37℃酶切3-4小时。酶切结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的CmDIV基因片段和线性化的pBI121载体。将回收的CmDIV基因片段和线性化的pBI121载体按照一定比例混合，加入T4DNA连接酶进行连接反应。连接体系为：10×T4DNALigaseBuffer1μl，CmDIV基因片段3μl，线性化pBI121载体1μl，T4DNALigase（350U/μl）0.5μl，ddH2O补足至10μl。16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，筛选出阳性克隆，提取重组质粒。采用CaCl₂法制备农杆菌GV3101感受态细胞。将农杆菌GV3101接种到含有50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜，至OD600值达到0.5-0.6。取1ml菌液转移至1.5ml离心管中，冰上放置10分钟，4℃，5000r/min离心5分钟，弃去上清液。加入1ml预冷的0.1MCaCl₂溶液，轻轻重悬菌体，冰上放置30分钟。4℃，5000r/min离心5分钟，弃去上清液，加入200μl预冷的0.1MCaCl₂溶液，轻轻重悬菌体，即为农杆菌感受态细胞，可立即用于转化或-80℃保存备用。将重组质粒加入到制备好的农杆菌GV3101感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30分钟。42℃热激90秒，迅速放回冰上冷却2分钟。加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，28℃，200rpm振荡培养2-3小时。将培养后的菌液均匀涂布在含有50μg/ml利福平、100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板上，28℃倒置培养2-3天。挑取单菌落接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜，提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定，验证重组表达载体是否成功导入农杆菌。将拟南芥种子用75%乙醇消毒3-5分钟，再用无菌水冲洗3-5次，然后将种子均匀播种在含有1/2MS培养基（含0.8%琼脂，3%蔗糖，pH5.8）的培养皿中。4℃春化处理3天，然后将培养皿转移至光照培养箱中，设置光照强度为100-150μmol・m⁻²・s⁻¹，光照时间为16小时光照/8小时黑暗，温度为22℃，相对湿度为60%-70%。待拟南芥幼苗长至4-5片真叶时，移栽至装有营养土（蛭石：营养土=1:1）的花盆中，继续培养至植株抽薹开花。采用花序侵染法转化拟南芥。将含有重组表达载体的农杆菌GV3101接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜，至OD600值达到1.0-1.2。4℃，5000r/min离心10分钟，收集菌体，用含有5%蔗糖、0.05%SilwetL-77的1/2MS液体培养基重悬菌体，调整OD600值至0.8-1.0。将拟南芥植株的花序浸入农杆菌菌液中，轻轻晃动30-60秒，使花序充分接触菌液。用保鲜膜覆盖植株，保持湿度，暗培养24小时，然后揭去保鲜膜，正常光照培养。待种子成熟后，收获种子。将收获的种子播种在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体培养基上，筛选转基因植株。待幼苗长出2-3片真叶时，观察其生长情况，能够正常生长的幼苗即为可能的转基因植株。取转基因拟南芥植株的叶片，提取基因组DNA，以其为模板，使用CmDIV基因特异性引物进行PCR检测，同时以野生型拟南芥基因组DNA为阴性对照，以重组质粒为阳性对照。反应体系和反应程序与基因克隆时的PCR扩增类似。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与阳性对照一致的特异性条带，则初步表明CmDIV基因已整合到拟南芥基因组中。提取转基因拟南芥植株的总RNA，并反转录成cDNA，以cDNA为模板，使用荧光定量PCR引物进行RT-PCR检测，同时以野生型拟南芥cDNA为阴性对照。反应体系和反应程序与荧光定量PCR类似。通过检测目的基因的表达情况，进一步验证CmDIV基因在转基因拟南芥中的表达。观察转基因拟南芥的表型变化，包括植株的生长形态（株高、茎粗、分枝数等）、叶片形态（叶片大小、形状、颜色等）、花的形态（花瓣数量、大小、形状，花的对称性等）。与野生型拟南芥进行对比，分析CmDIV基因对拟南芥生长发育和花对称性的影响。对转基因拟南芥的表型数据进行统计分析，采用SPSS软件进行显著性检验，判断表型差异是否具有统计学意义。三、结果与分析3.1CmDIV基因克隆与序列分析结果利用Trizol试剂提取菊花“毛香玉”花序总RNA后，通过Nanodrop2000超微量分光光度计检测，结果显示RNA的OD260/OD280比值为1.95，处于1.8-2.1的理想范围内，表明提取的RNA纯度较高，无蛋白质和酚类等杂质污染。进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察到清晰的28S、18S和5SrRNA条带，且28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带亮度的2倍（图1），这进一步证明了提取的RNA完整性良好，无明显降解，满足后续实验对RNA质量的要求。将提取的总RNA反转录成cDNA后，以此为模板进行3'RACE和5'RACE克隆。3'RACE克隆通过设计的正向引物3'-F和反向引物3'-R进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，在预期位置出现了一条清晰的特异性条带，大小约为800bp（图2）。将该条带回收、连接到pMD18-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经过蓝白斑筛选、PCR鉴定和酶切鉴定后，送测序公司测序。5'RACE克隆同样通过设计的正向引物5'-F和反向引物5'-R进行PCR扩增，电泳检测在预期位置出现特异性条带，大小约为600bp（图3），后续进行与3'RACE克隆相同的回收、连接、转化、鉴定及测序步骤。根据3'RACE和5'RACE克隆得到的序列，设计扩增基因全长的引物F和R，以cDNA为模板进行基因全长的PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约1200bp处出现清晰的特异性条带（图4），与预期的基因全长大小相符。对该条带进行回收、连接、转化、鉴定及测序，最终成功获得了菊花“毛香玉”花对称性调控基因的全长序列，命名为CmDIV基因。测序结果表明，CmDIV基因全长为1158bp，开放阅读框（ORF）为996bp，编码331个氨基酸。使用ExPASy中的ProtParam工具预测其编码蛋白质的理化性质，结果显示该蛋白质的分子量约为36.8kDa，理论等电点（pI）为5.86。在氨基酸组成方面，含量较高的氨基酸有亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）和丙氨酸（Ala），分别占比11.8%、10.3%和9.4%。通过SOPMA在线软件预测蛋白质的二级结构，结果显示α-螺旋占比32.63%，β-折叠占比18.13%，无规则卷曲占比49.24%（图5）。利用SWISS-MODEL在线建模工具构建蛋白质的三级结构模型，直观展示了蛋白质的三维空间结构，为进一步研究其功能提供了重要参考（图6）。在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现CmDIV基因与其他植物的DIV基因具有一定的同源性。其中，与青蒿（Artemisiaannua）的DIV基因同源性最高，达到78%；与向日葵（Helianthusannuus）的DIV基因同源性为72%；与拟南芥（Arabidopsisthaliana）的DIV基因同源性为65%。使用MEGA7.0软件，采用邻接法构建系统进化树，结果显示菊花“毛香玉”的CmDIV基因与菊科植物的DIV基因聚为一支，表明它们在进化关系上较为接近，具有共同的祖先起源（图7）。3.2CmDIV基因荧光定量表达分析结果在进行荧光定量表达分析时，首先对采集的菊花“毛香玉”不同组织部位（根、茎、叶、舌状花、管状花）以及不同种与品种的菊花组织样品进行总RNA提取。经检测，所有样品的总RNAOD260/OD280比值均在1.8-2.1之间，1%琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S和5SrRNA条带清晰，亮度比例正常，表明提取的总RNA质量良好，纯度高，无明显降解，可满足后续反转录和荧光定量PCR实验的要求。以提取的总RNA为模板反转录合成cDNA后，进行荧光定量PCR反应。熔解曲线分析结果显示，所有样品的熔解曲线均呈现单一的尖锐峰（图8），表明扩增产物具有高度特异性，无非特异性扩增和引物二聚体形成，保证了荧光定量PCR结果的准确性和可靠性。通过2-ΔΔCt法计算CmDIV基因在菊花“毛香玉”盛花期不同组织部位的相对表达量，结果表明，CmDIV基因在菊花“毛香玉”的不同组织部位均有表达，但表达水平存在显著差异（图9）。其中，在舌状花中的表达量最高，显著高于其他组织部位（P<0.05）；在管状花中的表达量次之，也相对较高；而在根、茎、叶中的表达量较低，且三者之间无显著差异（P>0.05）。这表明CmDIV基因在菊花“毛香玉”花器官中的表达具有特异性，可能在舌状花和管状花的发育过程中发挥重要作用。进一步分析CmDIV基因在菊花不同种与品种间的表达差异，选取了包括“毛香玉”在内的5个不同种与品种的菊花，分别为“金陵黄玉”、“粉十八”、“绿牡丹”和“滁菊”。荧光定量PCR结果显示，CmDIV基因在不同种与品种间的表达水平存在明显差异（图10）。“毛香玉”中CmDIV基因的表达量最高，显著高于其他品种（P<0.05）；“金陵黄玉”和“粉十八”中该基因的表达量次之，两者之间无显著差异（P>0.05）；“绿牡丹”和“滁菊”中CmDIV基因的表达量相对较低，且“绿牡丹”的表达量略高于“滁菊”，但差异不显著（P>0.05）。这种表达差异可能与不同种与品种菊花的花型、花色等观赏性状的差异以及花对称性的调控机制不同有关。3.3CmDIV基因转化拟南芥及表型观测结果将含有酶切位点的CmDIV基因与植物表达载体pBI121进行双酶切和连接反应，成功构建了植物表达载体pBI121-CmDIV。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切和连接产物，结果显示在预期位置出现了特异性条带（图11），表明重组表达载体构建成功。将重组表达载体pBI121-CmDIV转化至农杆菌GV3101感受态细胞中，经含有50μg/ml利福平、100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定和酶切鉴定。PCR鉴定结果显示，在预期位置出现了与阳性对照一致的特异性条带（图12），酶切鉴定结果也表明重组表达载体已成功导入农杆菌。采用花序侵染法将含有重组表达载体的农杆菌侵染拟南芥花序，收获种子后在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体培养基上进行筛选。经过筛选，获得了15株可能的转基因拟南芥植株。取这些转基因拟南芥植株的叶片，提取基因组DNA，以其为模板进行PCR检测。结果显示，15株转基因拟南芥中有12株出现了与阳性对照一致的特异性条带，表明CmDIV基因已成功整合到这些拟南芥植株的基因组中（图13）。提取转基因拟南芥植株的总RNA，并反转录成cDNA，以cDNA为模板，使用荧光定量PCR引物进行RT-PCR检测。结果显示，在PCR检测为阳性的12株转基因拟南芥中，有10株检测到了CmDIV基因的表达，而野生型拟南芥中未检测到该基因的表达（图14），进一步验证了CmDIV基因在转基因拟南芥中的表达。对转基因拟南芥的表型进行观测，发现转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，在生长形态、叶片形态和花的形态等方面均出现了明显变化。在生长形态方面，转基因拟南芥植株明显较野生型矮小，平均株高降低了约30%（P<0.05），茎粗也略有减小（图15A、B）。在叶片形态上，转基因拟南芥的叶片明显变小且更加圆润，叶片长度平均缩短了约25%（P<0.05），宽度变化不明显，但长宽比减小（图15C、D）。在花的形态方面，转基因拟南芥的花瓣数量略有减少，平均每个花的花瓣数比野生型少1-2片（P<0.05），花瓣形状也发生了改变，变得更加宽短，花的对称性也受到影响，部分转基因拟南芥的花呈现出不规则的形态（图15E、F）。对转基因拟南芥的表型数据进行统计分析，采用SPSS软件进行显著性检验，结果表明转基因拟南芥与野生型拟南芥在株高、叶片长度、花瓣数量等指标上的差异均具有统计学意义（P<0.05）。四、讨论4.1CmDIV基因序列特征与功能预测本研究成功克隆得到菊花“毛香玉”花对称性调控基因CmDIV，其全长1158bp，开放阅读框为996bp，编码331个氨基酸。通过生物信息学分析，预测了该基因编码蛋白质的理化性质、二级和三级结构，为深入理解其功能提供了基础。CmDIV基因编码的蛋白质分子量约为36.8kDa，理论等电点为5.86。在蛋白质结构方面，α-螺旋占比32.63%，β-折叠占比18.13%，无规则卷曲占比49.24%。这种结构特征可能与其在花对称性调控中的功能密切相关。α-螺旋和β-折叠结构赋予蛋白质一定的稳定性和刚性，而无规则卷曲则增加了蛋白质的柔韧性和可塑性，使其能够与其他分子发生特异性相互作用。在进化过程中，DIV基因在不同植物物种间存在一定的保守性和特异性。通过NCBI数据库BLAST比对发现，CmDIV基因与青蒿的DIV基因同源性最高，达到78%，与向日葵和拟南芥的DIV基因也具有一定的同源性。这表明DIV基因在植物进化过程中可能具有重要的保守功能，在花对称性调控等方面发挥着关键作用。从系统进化树分析结果来看，菊花“毛香玉”的CmDIV基因与菊科植物的DIV基因聚为一支，进一步证实了其在菊科植物中的进化亲缘关系。在菊科植物的进化历程中，DIV基因可能经历了多次复制和分化事件，以适应不同的生态环境和花形态的演变。在金鱼草等模式植物中，DIV基因参与花两侧对称的调控网络。在金鱼草中，CYC能够直接激活RAD，而RAD和DIV通过竞争结合下游的转录因子，决定了背部花瓣的发育命运。在腹部花瓣中，由于缺乏与DIV竞争结合的RAD，从而决定了腹部花瓣的独特发育路径。虽然本研究尚未深入探究CmDIV基因在菊花“毛香玉”花对称性调控网络中的具体作用机制，但基于其与其他植物DIV基因的同源性以及在花器官中的特异性表达模式，可以推测CmDIV基因可能在菊花“毛香玉”花对称性调控中发挥着类似的作用。它可能与其他花对称性调控基因，如CYC、RAD等相互作用，共同调控菊花“毛香玉”花器官的发育和对称性的形成。4.2CmDIV基因表达模式与花对称性的关联荧光定量表达分析结果显示，CmDIV基因在菊花“毛香玉”不同组织部位的表达存在显著差异，在舌状花中表达量最高，管状花次之，而在根、茎、叶中表达量较低。这种表达模式表明CmDIV基因在菊花花器官发育过程中具有重要作用，尤其是在舌状花和管状花的发育中，可能参与调控花器官的形态建成和花对称性的形成。舌状花和管状花是菊花头状花序的重要组成部分，它们的形态和对称性直接影响着菊花的整体花型。CmDIV基因在舌状花中的高表达，可能促使舌状花发育出特定的形态结构，进而决定了舌状花的对称性。当CmDIV基因表达异常时，可能导致舌状花的形态和对称性发生改变，从而影响菊花的整体花型。不同种与品种菊花间CmDIV基因表达水平的差异，暗示了该基因与菊花花型多样性及花对称性调控机制的紧密联系。花型和对称性的差异是菊花品种分类的重要依据，不同品种菊花的花型丰富多样，包括单瓣型、重瓣型、球型等，这些花型的形成与花对称性的调控密切相关。在本研究中，“毛香玉”中CmDIV基因表达量最高，其花型可能受到该基因的强烈调控，从而呈现出独特的花对称性。而“绿牡丹”和“滁菊”中该基因表达量相对较低，可能导致它们的花型和花对称性与“毛香玉”有所不同。这种表达差异可能是由于不同品种菊花在进化过程中，受到不同的选择压力和遗传背景影响，导致CmDIV基因的表达调控发生变化，进而影响了花型和花对称性的形成。与其他植物中DIV基因的表达模式进行对比，有助于进一步理解CmDIV基因在花对称性调控中的作用。在金鱼草中，DIV基因参与花两侧对称的调控网络，与CYC、RAD等基因相互作用，共同决定花器官的发育命运。虽然本研究未直接揭示CmDIV基因与其他基因的相互作用关系，但基于其在菊花花器官中的特异性表达模式以及与其他植物DIV基因的同源性，可以推测CmDIV基因在菊花“毛香玉”中可能与其他花对称性调控基因存在类似的相互作用。它可能通过与CYC、RAD等基因协同工作，共同调控菊花“毛香玉”花器官的发育和对称性的形成。例如，在菊花花原基发育过程中，CmDIV基因可能与CYC基因相互作用，调节花器官原基的分化和生长，从而决定花的对称性。在不同组织部位，CmDIV基因的表达可能受到其他基因的调控，形成复杂的调控网络，精确控制花对称性的形成和维持。4.3CmDIV基因转化拟南芥的表型分析将CmDIV基因转化拟南芥后，转基因拟南芥在生长形态、叶片形态和花的形态等方面均出现明显变化。植株矮小可能是由于CmDIV基因的表达影响了植物激素的合成或信号传导通路，进而影响了植株的纵向生长。植物激素如生长素、赤霉素等在植物茎的伸长生长中起着关键作用，CmDIV基因可能通过干扰这些激素的合成、运输或感知，导致植株生长受到抑制。叶片变小且圆润的现象，暗示该基因可能参与调控叶片细胞的分裂和扩展过程。在叶片发育过程中，细胞的分裂和扩展决定了叶片的大小和形状，CmDIV基因可能通过调节相关基因的表达，影响叶片细胞的增殖和分化，从而改变了叶片的形态。花瓣数量减少和形状改变，以及花对称性受到影响，进一步证实了CmDIV基因在花器官发育和花对称性调控中的重要作用。花器官的发育是一个复杂的过程，涉及多个基因的协同作用，CmDIV基因可能在这个调控网络中占据关键节点，通过与其他花发育相关基因的相互作用，共同决定花器官的形态和对称性。在金鱼草中，DIV基因与CYC、RAD等基因相互作用，共同调控花的对称性。在菊花“毛香玉”中，虽然尚未直接证实CmDIV基因与其他基因的相互作用关系，但从转基因拟南芥的表型变化可以推测，CmDIV基因可能与其他花对称性调控基因存在类似的协同作用机制。它可能通过调节花器官原基的分化和生长，影响花瓣的数量和形状，进而决定花的对称性。当CmDIV基因在拟南芥中过量表达时，可能打破了原有的基因调控平衡，导致花器官发育异常，出现花瓣数量减少、形状改变和花对称性异常的表型。4.4研究的创新点与不足本研究在菊花花对称性调控基因研究领域具有一定的创新点。在基因克隆及序列分析方面，首次从菊花“毛香玉”中成功克隆得到花对称性调控基因CmDIV，并对其进行了全面深入的序列分析，包括基因全长、开放阅读框、编码的氨基酸序列以及蛋白质的理化性质、二级和三级结构预测等。通过这些分析，为深入了解菊花花对称性调控的分子机制提供了新的基因资源和理论依据。在基因功能验证方面，将CmDIV基因转化至拟南芥中，通过观察转基因拟南芥的表型变化，直接验证了该基因在花器官发育和花对称性调控中的功能。这种在模式植物中验证基因功能的方法，为研究菊花花对称性调控基因的功能提供了新的思路和方法。然而，本研究也存在一些不足之处。在样本数量方面，虽然对菊花“毛香玉”不同组织部位以及多个不同种与品种的菊花进行了研究，但样本数量相对较少，可能无法全面反映CmDIV基因在菊花中的表达模式和功能。未来的研究可以进一步扩大样本数量，涵盖更多的菊花品种和不同生长环境下的样本，以提高研究结果的可靠性和普遍性。在研究深度上，本研究主要集中在基因的克隆、表达分析和初步的功能验证，对于CmDIV基因在花对称性调控网络中的具体作用机制，以及与其他花对称性调控基因之间的相互作用关系尚未深入探究。后续研究可以运用酵母双杂交、基因编辑等技术，深入研究CmDIV基因与其他基因的相互作用，揭示其在花对称性调控网络中的具体作用机制。在基因互作研究方面，本研究仅从转基因拟南芥的表型变化推测了CmDIV基因与其他花对称性调控基因可能存在的协同作用机制，但未进行直接的实验验证。未来的研究可以通过构建基因共表达网络、进行基因敲除或过表达实验等方法，深入研究CmDIV基因与其他基因的互作关系，明确其在花对称性调控中的具体作用路径。五、结论与展望5.1研究结论本研究成功从菊花“毛香玉”中克隆得到花对称性调控基因CmDIV，其全长1158bp，开放阅读框996bp，编码331个氨基酸。通过生物信息学分析，明确了该基因编码蛋白质的理化性质、二级和三级结构特征，发现其与其他植物的DIV基因具有一定的同源性，在进化关系上与菊科植物的DIV基因较为接近。荧光定量表达分析显示，CmDIV基因在菊花“毛香玉”不同组织部位的表达存在显著差异，在舌状花中表达量最高，管状花次之，根、茎、叶中表达量较低。在不同种与品种的菊花间，该基因的表达水平也存在明显差异，暗示其与菊花花型多样性及花对称性调控机制密切相关。将CmDIV基因转化拟南芥后，转基因拟南芥在生长形态、叶片形态和花的形态等方面均出现明显变化，植株矮小，叶片变小且圆润，花瓣数量减少，形状改变，花的对称性受到影响，进一步证实了CmDIV基因在花器官发育和花对称性调控中的重要作用。5.2研究展望未来，可运用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，对菊花“毛香玉”自身的CmDIV基因进行敲除或定点突变，观察其花对称性及花器官发育的变化，进一步明确该基因在菊花花发育过程中的精确功能和作用机制。通过酵母双杂交、双分子荧光互补等技术，深入研究CmDIV基因与其他花对称性调控基因，如CYC、RAD等之间的相互作用关系，构建更加完整的花对称性调控网络。同时，利用基因芯片、转录组测序等技术，全面分析CmDIV基因调控下的下游基因表达谱，揭示其在分子水平上的调控路径。在多组学研究方面，结合基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学技术，全面深入地探究CmDIV基因在菊花花对称性调控中的作用机制。通过对不同花型和对称性的菊花品种进行多组学分析，挖掘与花对称性相关的关键基因和代谢通路，为菊花花型的遗传改良提供更多的理论依据和基因资源。利用基因组重测序技术，分析不同菊花品种中CmDIV基因及其上下游调控基因的序列差异，寻找与花型和对称性相关的遗传变异位点。结合转录组学和蛋白质组学数据，研究这些遗传变异对基因表达和蛋白质功能的影响，进一步揭示花对称性调控的分子机制。在应用研究方面，基于本研究对CmDIV基因的认识，开展菊花的分子育种工作。通过基因工程技术，将CmDIV基因导入到其他菊花品种中，尝试创造出具有新颖花型和独特花对称性的菊花新品种，丰富菊花的品种资源，满足市场对多样化花卉的需求。利用基因编辑技术对现有菊花品种的CmDIV基因进行精准调控，改良其花型和对称性，提高菊花的观赏价值和市场竞争力。加强与花卉产业的合作，将研究成果应用于实际生产中，推动菊花产业的发展。建立菊花分子育种技术体系，为花卉育种企业提供技术支持和服务，促进菊花新品种的培育和推广。开展菊花遗传转化技术的优化研究，提高基因转化效率，降低生产成本，为菊花分子育种的大规模应用奠定基础。参考文献[1]TeixeiradaSilvaJA,ShinoyamaH,AidaR,MatsushitaY,RajSK,ChenFD.Chrysanthemumbiotechnology:Quovadis?[J].PlantCell,TissueandOrganCulture,2013,115(1):1-24.[2]苏江硕，贾棣文，王思悦，张飞，蒋甲福，陈素梅，房伟民，陈发棣。中国菊花遗传育种60年回顾与展望[J].园艺学报，2022,49(10):2143-2162.[3]张国进，陈丽，郭友好，向增旭.NuclearphylogenomicsofAsteraceaewithincreasedsamplingprovidesnewinsightsintoconvergentmorphologicalandmolecularevolution[J].PlantCommunications,2024,5(4):100851.[4]CHENKeli,PIAOChunlan,HAOYanmin,etal.CloningandfunctionalanalysisofCYCLOIDEA(CYC)-likeSvRAY1genefromSeneciovulgaris[J].JournalofZhejiangA&FUniversity,2021,38(6):1153-1160.[5]刘轶奇。菊花‘毛香玉’花对称性调控CmDIV基因克隆及分析[D].河南农业大学，2016.[6]YuanX,ChenS,ZhangX,etal.Genome-wideidentificationandexpressionanalysisofTCPtranscriptionfactorfamilyinchrysanthemumandfunctionalcharacterizationofCmTCP20inregulatingpetalelongation[J].HorticultureResearch,2019,6(1):1-14.[7]WangX,YuanX,WangJ,etal.CmYAB1,aYABBYgene,isinvolvedinregulatingpetalcurvatureandinflorescencemorphologyinchrysanthemum[J].BMCPlantBiology,2019,19(1):1-15.[8]WenX,ZhangX,ZhangX,etal.Genome-wideidentificationandfunctionalanalysisoftheXTHgenefamilyduringrayfloretdevelopmentinchrysanthemum(Chrysanthemummorifolium)[J].BMCGenomics,2017,18(1):1-14.[9]徐丽娟，孙世孟，宋修建，李玉松.CMV复制酶基因的克隆及序列分析[J].莱阳农学院学报，1999(01):29-32+43.[10]金乌云，邵琪，郝鑫，等。甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆・表达分析及载体构建[J].安徽农业科学，2015,43(14):30-32+39.[2]苏江硕，贾棣文，王思悦，张飞，蒋甲福，陈素梅，房伟民，陈发棣。中国菊花遗传育种60年回顾与展望[J].园艺学报，2022,49(10):2143-2162.[3]张国进，陈丽，郭友好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