3.1+重组DNA技术的基本工具+课件++2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

棉花细胞

普通棉花

(无抗虫特征)(含抗虫基因)

棉花植株(有抗虫特征)基因工程抗虫基因提取课堂导入

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。

（1）原理：

（2）操作水平：

（3）操作环境：

（4）操作对象：

（5）结果：基因工程的概念基因重组分子水平生物体外基因赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。（6）特点（优点）：定向改造生物（遗传性状），克服远缘杂交不亲和障碍1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达成功？①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。③所有生物DNA碱基对均遵循严格的“互补配对”原则，不同DNA分子得以连接在一起。①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。DNA分子结构相似生物界共用一套遗传密码基因工程得以成功的原因基因工程发展历程1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了

，还证明了DNA可以在

。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。遗传物质是DNA同种生物个体间转移1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。抗虫基因普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌问题一：如何获取Bt抗虫基因?问题二：剪下来的抗虫基因怎样把它导入到棉花体内？需要用到什么工具？又是怎么操作的呢？3.1重组DNA技术的基本工具

学习目标1.通过资料分析，阐明基因工程的理论基础。2.通过模拟制作活动，阐明限制酶、DNA连接酶和载体的作用。3.通过了解基因工程的发展历程，认同基因工程的诞生和发展离不开多个学科的理论研究和技术创新。目录一.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”二.DNA连接酶——“分子缝合针”三.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”四.探究实践：DNA的粗提取与鉴定一.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（限制酶）11、来源：2、种类：主要来自

。3、特点：数千种能够识别

，并且使每一条链中特定部位的

断开，因此具有

。（限制酶不是一种酶，而是一类酶）原核生物双链DNA分子的特定核苷酸序列磷酸二酯键①识别序列长度：②结果：大多数是

，也有少数是

、

，或其他数量。产生

或

。6个核苷酸序列4个8个黏性末端平末端专一性

（1）

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。中轴线（2）中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。观察右侧限制酶所识别的序列有什么特点？5'3'5'3'TAGGTATCCADNA的结构1’2’3’4’5’

G1’2’3’4’5’碱基磷酸脱氧核糖—腺嘌呤—胸腺嘧啶—胞嘧啶—鸟嘌呤ATCG磷酸二酯键DNA的双螺旋结构“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（限制酶）EcoRI(在G与A之间切割)SmaI(在G与C之间切割)5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。【练习】(P75拓展应用2改编)1.请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。SpeⅠ：

HindⅢ：

XbaⅠ：

XhoⅠ：2.同种限制酶切割形成的黏性末端相同吗？相同3.哪种限制酶切割产生的片段能与SpeⅠ切割产生的片段相连接?为什么？两者切割产生了相同的黏性末端4.（拓展2第2问）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？切割位点的选择范围扩大XbaⅠ

同尾酶

1.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么?P71含某种限制酶的细菌DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？P74限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。思考与讨论活动1：大脑模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。识别GAATTC序列，并在G和A之间切开--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---苏-基因2Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’思考1：要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。思考2：目的基因（Bt基因）是否可以直接导入到受体细胞？为什么？否。目的基因直接导入受体细胞，可能会被细胞中的酶降解或不能复制、表达。思考3：有没有什么DNA分子可以进入宿主细胞并负责表达？识别GAATTC序列，并在G和A之间切开--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---苏-基因2Bt基因苏云金杆菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’二.DNA连接酶——“分子缝合针”

将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。作用：作用部位：磷酸二脂键不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是____________________________________________________。DNA的基本组成单位、空间结构和碱基互补配对方式相同种类：①E.coliDNA连接酶②T4DNA连接酶从大肠杆菌中分离得到只能连接互补黏性末端的DNA片段从T4噬菌体中分离得到黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。平末端黏性末端GAATTCGATTCA

由于黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对形成氢键，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能，所以T4DNA连接酶黏性末端的连接速度比平末端的连接速度更快3.作用部位:磷酸二脂键DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？DNA聚合酶相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；

DNA连接酶连接的是DNA片段，不需要模板。DNA连接酶提示：DNA连接酶与DNA聚合酶的比较比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点不同点是否需要模板接DNA链作用过程作用结果用途作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成不需要需要双链单链在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子基因工程DNA复制总结归纳几种相关酶的比较名称作用部位作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链将两个DNA片段连接为一个DNA分子将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将DNA切成两个片段几种相关酶的比较作用底物作用部位作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶DNA水解酶DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA分子片段磷酸二酯键重组DNA分子脱氧核苷酸磷酸二酯键新的DNA分子DNA分子氢键单链DNADNA分子磷酸二酯键脱氧核苷酸三.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”03质粒将外源基因送入受体细胞,

在受体细胞内对目的基因进行大量复制.

1.作用：动植物病毒噬菌体2.种类：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。27思考：噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是

。病毒对宿主细胞的侵染具有一定的

。利用病毒对宿主细胞的侵染性物种（组织）特异性若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用

作为载体，其原因是

。噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕种类用途不同点质粒噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入细菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别2.种类：0329033.载体需具备的条件——供外源DNA片段（目的基因）插入其中✭真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因④对受体细胞无害，易分离。——便于重组DNA分子的筛选如何利用标记基因的筛选呢？普通培养基不含抗生素选择培养基50µg/ml氨苄青霉素03质粒人的DNA分子用EcoRⅠ限制酶切割用EcoRⅠ限制酶切割用DNA连接酶粘合计划让大肠杆菌表达人类生长激素？31

请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：实例：重组DNA分子的模拟操作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…运载体分子运输车…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…AATTCGGCATAC…GCCGTATG…实例：重组DNA分子的模拟操作DNA连接酶分子运输车…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGDNA连接酶实例：重组DNA分子的模拟操作分子运输车…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGDNA连接酶通常用两种不同限制酶同时切割目的基因和运载体（双酶切法）：防止载体自身连接、目的基因自身环化和反向拼接实例：重组DNA分子的模拟操作1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？

如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。四.探究实践：DNA的粗提取与鉴定一、实验原理00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度1.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同观察左图，尝试描述DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线。

利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？

用高浓度的盐溶液（2mol/L的NaCl溶液）溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；

用低浓度的盐溶液（0.14mol/L的NaCl溶液）使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。取过滤液取过滤物2.DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质能溶于酒精。3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性酶——蛋白酶高温——大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，但DNA在

80℃以上才会变性洗涤剂——能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响4.DNA的鉴定DNA+二苯胺

蓝色物质沸水浴对照组实验组二、实验设计（一）实验材料的选取那么应该选择什么样的材料呢？思考：上述材料中哪些不能进行选择？为什么？凡是含有DNA的生物材料都可，但是选用富含DNA的材料成功率会更高。材料用具：

新鲜洋葱、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等（二）实验步骤1.破碎细胞，获取DNA的滤液

称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。研磨注意事项：研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量；有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶，研磨效果好（有利于充分研磨）；研磨不宜太用力思考：若是动物细胞，该如何获取DNA滤液？吸水涨破2.去除滤液中的杂质a.漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液；b.也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。（核蛋白、脂质、多糖和RNA等杂质）3.DNA的析出减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。4.DNA的鉴定DNA滤液+同体积冷却的95%酒精静置2~3min白色絮状物用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。思考：为什么要沿一个方向搅拌？丝状物或沉淀物+2mol/L的NaCl溶液5mL二苯胺加热冷却后观察颜色变化实验组对照组水浴加热加入4mL二苯胺试剂加入2mol/L氯化钠溶液加入丝状物加入2mol/L氯化钠溶液不加入丝状物加入4mL二苯胺试剂合作探究1.为什么要提取出白色丝状物？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。

如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。

鉴定结果呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。课堂小结限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类：磷酸二酯键来源

：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来

1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶，以下说法正确的是

(

)A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.