3.2基因工程操作的基本程序2课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节：基因工程的基本操作程序-2扩展1：PCR相关计算拓展2：PCR引物设计基因表达载体的构建选择性必修3拓展1：PCR相关计算第一次扩增DNA分子数含引物的DNA分子数含其中一种引物的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数共消耗引物的对数含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数复制1次第二次扩增DNA分子数含引物的DNA分子数含其中一种引物的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数共消耗引物的对数含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数复制2次第三次扩增在第3轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段DNA分子数含引物的DNA分子数含其中一种引物的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数共消耗引物的对数含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数复制3次第四次扩增DNA分子数含引物的DNA分子数含其中一种引物的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数共消耗引物的对数含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数复制4次复制次数123nDNA分子数212223含引物的DNA分子数212223含其中一种引物的DNA分子数1＝21－13＝22－17＝23－1同时含两种引物的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－1含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数0＝21－20＝22－42＝23－62n2n2n－12n－12n－22n－2n第n次复制需要引物_________个2nPCR扩增DNA规律1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有()A.8个B.6个C.4个D.2个A图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为________。15/162.利用PCR技术扩增目的基本基因，其原理与细胞内DNA复制类似。拓展2：PCR引物的设计PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增高效性。1.引物设计需考虑的两个因素扩增特异性扩增高效性引物特异性：只扩增出目标DNA的特性高效性：单位时间内扩增产物的量特异性太强，扩增效率就会下降提高扩增效率，扩增特异性就会下降拓展2：PCR引物的设计2.引物设计的原则①引物长度一般在20-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq酶进行反应。过短特异性差。②引物GC含量一般在40%~60%之间，GC含量过高或过低都不利于引发反应。拓展2：PCR引物的设计2.引物设计的原则③引物自身及引物之间不应存在互补序列上图是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。拓展2：PCR引物的设计2.引物设计的原则④退火温度退火温度高，扩增特异性强，退火温度低扩增效率高。如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。拓展2：PCR引物的设计2.引物设计的原则⑤引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。第二步：基因表达载体的构建1.基因表达载体的作用①使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代②使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用核心步骤2.基因表达载体的组成复制原点启动子插入目的基因标记基因终止子基因表达载体2.基因表达载体的组成位置：位于基因的上游，功能：是RNA聚合酶识别和结结合的部位，具有驱动基因转录的作用。位置：位于基因下游功能：终止转录复制原点启动子插入目的基因标记基因终止子基因表达载体2.基因表达载体的组成诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达复制原点启动子插入目的基因标记基因终止子基因表达载体2.基因表达载体的组成便于重组DNA的筛选能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上基因组的复制起始序列，是解旋酶的作用位点，（富含A-T），有利于解旋复制原点启动子插入目的基因标记基因终止子基因表达载体基因克隆载体必须具备的条件标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点基因表达载体必须具备的条件基因克隆载体与基因表达载体基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点的序列。

项目启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分位置目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端作用启动子和终止子与起始密码子和终止密码子启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，决定转录的开始和结束；而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出RNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束3.基因表达载体的构建过程限制酶限制酶同种限制酶或产生相同末端的限制酶切割DNA连接酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因限制酶切割位点质粒重组DNA分子3.基因表达载体的构建过程限制酶限制酶DNA连接酶质粒重组DNA分子第1步：用同种限制酶或产生相同末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。第2步：用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。拓展：“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段构建基因表达载体1.单酶切限制酶切割DNA连接酶连接启动子方向目的基因转录方向思考：单酶切有什么缺点？单酶切有什么缺点？缺点1：质粒自身环化限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接单酶切有什么缺点？缺点2：目的基因自身环化限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接单酶切有什么缺点？缺点3：目的基因与质粒反向连接aaaa限制酶切割DNA连接酶连接反向连接重组DNAaaaa限制酶切割DNA连接酶连接缺点1缺点2缺点3单酶切的缺点反向连接质粒自身环化目的基因自身环化2.双酶切用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段构建基因表达载体限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abab2.双酶切限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abab质粒不会自身环化目的基因不会自身环化优点1优点2优点3目的基因与质粒不会发生反向连接图解限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。【能力提升】质粒和目的基因构建重组质粒，应选用___________________两种限制酶切割。HindⅢ、Bcl

Ⅰ启动子的类型拓展延伸①组成型启动子

能够调控基因的表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差