3.2基因工程的基本操作程序（第1课时）课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节基因工程的基本操作程序（第一科时）【本节聚焦】1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？第3章基因工程学习目标、重难点核心素养1.阐明PCR的原理，说出PCR反应所需的条件和PCR反应的过程。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。1.科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。2.科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。1.教学重点(1)基因工程的基本操作程序。(2)目的基因的筛选与获取方法。(3)基因表达载体的构建及其组成。2.教学难点(1)理解基因表达载体的构建过程。(2)掌握PCR技术及其在基因工程中的应用。一、目的基因的筛选与获取请同学们自主阅读教材P76-79，思考并回答下列问题：

1.基因工程的基本操作程序有哪几个步骤？2.目的基因的筛选与获取方法有哪些？3.什么是PCR技术？PCR在基因工程中有哪些应用？转基因抗虫棉与普通棉花情境导入如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花呢？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？培育转基因抗虫棉的简要过程与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉

（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取（前提）2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞（关键）4.目的基因的检测与鉴定（保证）提取苏云金杆菌情境导入一、目的基因的筛选与获取(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子1、目的基因(2)实例：抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因抗虫棉

目的基因：Bt抗虫蛋白基因苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因一、目的基因的筛选与获取2、目的基因的筛选：抗虫原理？

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。如何掌握？怎么获得？3、获取目的基因常用的方法①人工合成②从基因文库中获取③利用PCR获取和扩增目的基因基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成基因组文库（某生物全部基因）部分基因文库（主要是cDNA文库）前提：方法：一、目的基因的筛选与获取DNA合成仪4、从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（cDNA文库）（包含一种生物的一部分基因）一、目的基因的筛选与获取（1）基因文库概念（2）基因文库类型基因组DNA限制酶切基因组文库mRNA逆转录得cDNA,酶切cDNA文库拼接质粒，导入细菌中保存为文库一、目的基因的筛选与获取（3）基因组文库的构建5、利用PCR获取和扩增目的基因苏云金杆菌Bt基因？快速获得大量Bt基因提取PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR——聚合酶链式反应原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。一、目的基因的筛选与获取PCR扩增仪思考：DNA是如何复制的呢？一、目的基因的筛选与获取DNA复制的条件:原则:③能量：亲代DNA的两条链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等由细胞代谢提供的ATP①模板：②原料：④酶：

碱基互补配对原则从子链的5'端向3'端延伸方向:特点:边解旋边复制、半保留复制

、多起点双向复制体外复制怎么改进体外用高温代替体外需用耐高温的DNA聚合酶子链合成需要引物

引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)温故知新引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链，体内的DNA复制通常以RNA单链为引物体外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端相关信息P77：一、目的基因的筛选与获取体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常与两条模板链结合的2种为小的单链DNA）反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸一、目的基因的筛选与获取思考：结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。1．下列有关限制性内切核酸酶的说法，错误的是(

)A．限制性内切核酸酶主要是从微生物细胞中分离提纯的B．限制性内切核酸酶不能将目的基因连接到不同的载体上C．一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的核苷酸序列D．限制性内切核酸酶既可切割链状DNA也可切割环状DNA

趁热打铁C一、目的基因的筛选与获取6、PCR反应的过程（重点）一、目的基因的筛选与获取6、PCR反应的过程（重点）1）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA第一步：变性待扩增的DNA片段3’3’5’5’3’5’3’5’变性90℃思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。6、PCR反应的过程（重点）一、目的基因的筛选与获取2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

与两条单链DNA结合。

第二步：复性DNA引物3’5’3’5’碱基互补配对思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能头开始合成子链DNA②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从

5'端→3'端方向复制。引物15’3’引物25’3’由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物。引物设计1.引物长度：20-30个核苷酸2.引物自身不能互补配对3.两种引物之间不能互补配对6、PCR反应的过程（重点）一、目的基因的筛选与获取3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脱氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端思考3：延伸过程是否需要ATP供能不需要，由dNTP水解供能6、PCR反应的过程（重点）一、目的基因的筛选与获取耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’

变性

复性

延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高一、目的基因的筛选与获取6、PCR反应的过程当堂检测Q1PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。下列有关该技术的叙述，不正确的是（）DA.PCR技术的原理是DNA复制B.变性过程中利用高温使DNA双链解开C.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的D.延伸过程需要Taq酶、ATP、四种核糖核苷酸学法P77-78：应用提升（2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。（2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是________________________________。（3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指___________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。

一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术④②③①Taq酶(耐高温的DNA聚合酶）延伸引物通过碱基互补配对与单链DNA结合当堂检测2．科研人员利用PCR技术扩增X基因片段，需加入两种引物，引物结合位置如图甲所示。PCR循环后产生五种DNA分子，如图乙所示。下列叙述正确的是(

)A．利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程B.如果加入大量引物1和引物2，会干扰正常的PCR扩增过程C．在第四轮复制后，会出现8个X基因片段D．经过第二轮PCR后会出现①②③④⑤五种DNA分子一、目的基因的筛选与获取C第二轮循环的产物第三轮的产物3’5’3’5’3’5’3’5’第一轮循环的产物3’5’3’5’【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；一、目的基因的筛选与获取6、PCR反应的过程DNA扩增成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）（重点）①DNA分子有_____个②总链数_____条③不含引物的链数：___④含引物的链数_____⑤含引物1或2的链数：______⑥仅含引物1的DNA数：______⑦仅含引物2的DNA数：______⑧引物1、2均含有的DNA数：_____⑨不含引物的DNA数：______⑩需要引物的总数：______2n2n+122n+1-2循环n次：2n-1112n-202n+1-2★一、目的基因的筛选与获取6、PCR反应的过程（重点）例题．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，下列说法正确的是(

)A．延伸的温度必须小于复性温度，且小于变性温度B．PCR反应过程中需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶C.共需2n+1－2个引物参与子代DNA分子的合成D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/16趁热打铁Cb、两种引物都结合在DNA模板链的

端；

脱氧核苷酸连接在引物的

端进行延伸。a、要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2【问题探究1】3’c、设计引物的依据是？已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。

3’d、用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。一、目的基因的筛选与获取设计引物依据③引物GC含量要适宜，过高复性温度也要升高①引物自身及两种引物之间不能互补配对②引物长度适宜原则已知目的基因两端的核苷酸序列笔记【拓展思维】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’一、目的基因的筛选与获取思考：PCR扩增的是整个模板DNA分子吗？不是，PCR扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段一、目的基因的筛选与获取比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所酶温度结果联系解旋酶催化主要在细胞核内解旋酶、DNA聚合酶等细胞内温和条件合成整个DNA分子DNA在高温下变性解旋细胞外(主要在PCR扩增仪内)热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)控制温度，需在不同温度下进行扩增特定的DNA片段或基因①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料：均为四种脱氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)③酶：均需DNA聚合酶④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成目的基因以指数形式在短时间内大量扩增。7、pcr产物鉴定PCR过程可以在

中自动完成，完成以后，常采用

来鉴定PCR的产物琼脂糖凝胶电泳PCR扩增仪一、目的基因的筛选与获取例题.(2022·天津一中高二期中)下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（

）A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4D趁热打铁1.实验原理(1)PCR在体外进行DNA片段的扩增原理PCR利用了_____________________和__________________的原理。DNA的热变性原理DNA半保留复制(2)DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有______________，在一定的____下，这些基团可以带上________________，在_________的作用下，这些___________会向着____________________的电极移动，这个过程就是_____。可解离的基团pH正电荷或负电荷带电分子电泳与它所带电荷相反电场在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和_______等有关。凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的________下被检测出来。凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)试剂①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。2.材料用具③PCR反应体系的配方(见教材)②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）2.材料用具(2)用具探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定3.方法步骤（1）DNA片段的扩增移液用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分离心待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）反应参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。可根据目的片段长度适当调整延伸时间预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定①熔化：电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。②倒模:将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③凝固:待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定3.方法步骤（2）制备凝胶探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定3.方法步骤（3）进行电泳①加液：将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。②加样：扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。③电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳④观察鉴定:取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。4.结果分析与评价1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。

如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？加样孔→探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定例题.一种双链DNA分子被两种不同的限制酶进行三种切割,切割产物通过电泳分离,用大小已知的DNA片段的电泳结果作为相对分子质量大小标记(下图左边一列)。关于该双链DNA,下列说法错误的是（

）A.呈环状结构B.分子质量大小为10kbC.有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切点D.其NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为2kbD标样

请标出限制酶的切割位点

3．(2024·菏泽期中)在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。下列说法错误的是(

)A．两种限制酶在载体上识别的序列不相同B．两种限制酶在载体上至少各有一个酶切位点C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距约为200bpD．DNA在凝胶中迁移的速率与DNA构象无关趁热打铁

D问题1：获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？---基因工程的核心1、目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；

使目的基因能够表达和发挥作用。思考：各个元件有什么作用？二、基因表达载体的构建2、基因表达载体的组成：包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等诱导型启动子二、基因表达载体的构建（启动子=起始密码?）（终止子=终止密码?）项目启动子终止子起始密码终止密码化学成分DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基位置目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束DNA片段

基因1基因2基因3补充知识：真核生物基因的结构（基因通常是有遗传效应的DNA片段）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子放大（1）非编码区：位于编码区上游与编码区下游，不能转录

为相应的mRNA,

不能编码蛋白质。（2）编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码蛋白质的合成。启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号。终止子：终止RNA的合成拓展：第一步：目的基因的筛选与获取非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子内含子外显子转录前体mRNA成熟mRNA剪切、拼接不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子DNA片段基因1基因2基因3放大（1）外显子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。（2）内含子：：能转录相应的mRNA，但不能编码蛋白质的DNA序列。拓展：补充知识：原核生物基因的结构非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区终止子：终止转录转录mRNA原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都由能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成的连续不连续编码区非编码拓展：①不编码蛋白质，调控遗传信息表达。：编码蛋白质，连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②上游有启动子，下游有终止子编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子非编码区编码区非编码区二、基因表达载体的构建知识补充：原核生物基因的转录过程知识补充：真核生物基因的转录过程编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子非编码区非编码区编码区二、基因表达载体的构建编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子非编码区非编码区编码区真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列①不编码蛋白质，调控遗传信息表达②上游有启动子，下游有终止子包括非编码区和内含子内含子：不能编码蛋白质的序列内含子外显子二、基因表达载体的构建知识补充：原核生物基因的转录过程非编码序列：真核细胞VS原核细胞的基因结构原核细胞真核细胞示意图不同点编码区是_____的编码区是间隔的、______的相同点都由能够编码蛋白质的_________和具有调控作用的_________区组成的连续不连续编码区非编码二、基因表达载体的构建问题2：目的基因应该插入什么位置？

目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入

，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位诱导型启动子：诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达二、基因表达载体的构建？同种限制酶或能产生相同末端的限制酶基因表达载体构建模式图二、基因表达载体的构建问题3：如何构建抗虫棉的基因表达载体？基因表达载体载体问题4：如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)①单酶切法质粒自身环化目的基因自身环化质粒与目的基因反向连接

单酶切缺点:如何避免上述问题？二、基因表达载体的构建讨论5：如何防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因反向连接？abab双酶切的优点:防止质粒自身环化防止质粒与目的基因反向连接防止目的基因自身环化②双酶切法二、基因表达载体的构建选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，使基因两端产生两个不同的粘性末端请结合下图，回答问题：思考1：构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。二、基因表达载体的构建图解限制酶的选择原则：(1)不破坏目的基因原则：(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选SmaⅠ。如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：思考2：若目的基因片段两端不存在和质粒相同的限制酶酶切位点，如何处理？在引物的5’端设计质粒上存在的酶切位点同种限制酶或能产生相同末端的限制酶5．如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，欲将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述正确的是(

)A．应选择的限制酶组合是酶E和酶GB．应选择含有ApR和TcR基因的受体菌C．用含四环素的培养基能筛选出含重组质粒的受体菌D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带

趁热打铁D课堂小结1．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和