微专题《PCR技术应用》（重叠延伸PCR+大引物PCR+反向PCR+荧光定量PCR+不对称P）课件微专题《PCR技术应用》（重叠延伸PCR+大引物PCR+反向PCR+荧光定量PCR+不对称P）课件

PCR技术的应用1.重叠延伸PCR——基因定点突变①四条引物。引物2和引物3有部分碱基可以互补配对。②分别用引物1和2，引物3和4在不同反应体系中PCR后，得到的DNA链可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。③最后，用引物1和4进行扩增得到更多的融合基因片段。目的基因突变基因①四种引物设计时，碱基不能互补配对，防止随机结合。（）②可在同一反应体系中进行片段A、片段B的扩增。（）③杂交链a、b延伸生成突变基因时需要加入引物。（）④突变基因为模板进行扩增时，需要加入引物。（）不能。引物2和引物3存在互补片段，置于同一反应体系中会发生结合失去作用。1.重叠延伸PCR——基因定点突变××片段A片段Bab×√④至少需要经过2轮循环才能得到图中的杂交链。（）⑤目的链a由引物1延伸而来，含有引物2的互补片段.（）⑥利用重叠延伸PCR还可用于构建融合基因。（）片段A片段Bab1.重叠延伸PCR——基因定点突变√√√1.重叠延伸PCR——连接不同基因①四条引物。引物2和引物3有部分碱基可以互补配对。②分别用引物1和2，引物3和4在不同反应体系中PCR后，得到的DNA链可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。③最后，用引物1和4进行扩增得到更多的融合基因片段。引物1

引物4

2.大引物PCR——基因定点突变ab①用到3条引物：引物1、引物2和大引物，进行2次PCR。②在PCR1中，经过____轮循环得到大引物模板。③选取引物2和_____链（a或b）作为引物延伸子链，即得到改良基因。④优点：两轮PCR可在同一试管内进行，减少材料转移带来的污染。⑤在PCR2时，为避免第一轮引物结合到DNA上，可进行的操作？2b大引物长度比第一轮引物1长一些；第二轮PCR复性温度比第一轮高；当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。

原理是：用限制酶、DNA连接酶处理，获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。3.反向PCR①该技术用到的酶有哪些？②若扩增两侧的未知序列，需要选用引物_______,且_____（能/不能）互补配对。③最终得到的PCR产物？包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子。DNA连接酶、限制酶、Taq酶。3、4不能扩增时需要据未知部分设计引物，无法实现。扩增时根据已知序列设计引物x、y。利用图中的引物___________组合可扩增出两侧的未知序列。①④4.实时(realtime)荧光定量PCR反向引物R正向引物

Q

反向引物正向引物Q

R

步骤3·探针被切断步骤4·聚合完成反向引物报告(荧光)基团淬灭基团QR正向引物QR步骤1·聚合反向引物正向引物QR步骤2·链取代（1）该技术可直接检测新冠病毒核酸的含量。（）（2）该PCR技术中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯键，又催化断裂磷酸二酯键。（）（3）1个双链DNA分子，经n轮循环，共生成________个荧光分子。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈____________关系。×√2n-1正比例习题精练(1)与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有________________________________________________________。(2)Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。(3)某新冠病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为________。Taq酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降越小阳性

(4)阴性结果也不能排除新冠病毒感染。可能产生假阴性的因素有_______。a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解c．病毒发生变异abc

习题精练

不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别为限制性引物（数量较少）与非限制性引物（数量较多），其最佳比例一般为1：50～1：100，在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。5.DNA单链（探针）的扩增——不对称PCR（1）PCR进行最初10-15个循环的目的是：____________________（2）不对称PCR产生大量单链DNA是由___________引物延伸而来。（3）双链与单链DNA的分子量大小不同，可通过______分离。增加模板DNA的数量

非限制性

电泳6.荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术的原理是通过使用特异性染色体/DNA探针与间期细胞核杂交而获得基因和染色体状态信息的技术。（1）DNA荧光探针的准备过程如图1所示，DNA酶Ⅰ随机切开了核苷酸之间的________键从而产生切口，随后在DNA聚合酶作用下，以荧光标记的____________为原料，合成荧光标记的DNA探针。（2）图2表示探针与待测基因结合的原理，先将探针与染色体共同煮沸，使DNA双链中_____键断裂，形成单链，随后在降温复性过程中，探针的碱基按照_________________原则，与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子，图中两条姐妹染色单体中最多可有_______条荧光标记的DNA片段，______个荧光点。磷酸二酯脱氧核苷酸氢碱基互补配对427.第一代基因测序技术——双脱氧链终止法（1）在人工合成DNA体系中，加入单链模板、四种dNTP（原料）、某一种双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)等成分，反应终止时对合成的不同长度子链进行电泳。（2）双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)①可脱去两个磷酸基团形成焦磷酸和双脱氧核苷酸并释放能量。②因为ddNTP缺少3’-OH，不能与另外的dNTP连接形成磷酸二酯键，因此，双脱氧核苷酸可使DNA子链延伸终止。（即ddNTP的碱基可代替dNTP与模板链上的碱基互补配对，但该位点之后不能延伸子链）【思考】1.根据电泳图谱，写出测序DNA序列。2.写出待测DNA序列，并注明方向。

根据电泳结果，子链：5’ATCGTTGA3’待测模板与之互补:3’TAGCAACT5’合成子链：5’ACCGTCAG3’；待测模板：3’TGGCAGTC5’思考：（1）读图：写出待测模板序列：