（正式版）DB22∕T 2053-2014 《饲料中构巢曲霉测定 实时荧光PCR方法》

备案号：41841-2014饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法2014-04-30实施2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王莹、郎乐、张庆波、韩冰雪、李媛媛、王庆峰。1饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法本标准规定了饲料中构巢曲霉的实时荧光PCR检验方法。本标准适用于饲料中构巢曲霉的快速筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T13092饲料中霉菌总数的测定GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。实时荧光聚合酶链式反应。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理对样品的培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲料中的构巢曲霉进行快速检测。除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。2c)探针：5'-FAM-TCAACGGTGACA5.2TaqDNA聚合酶。5.3dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosinatriphosphate,脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。5.4真菌基因组DNA提取纯化试剂盒。5.510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化钾(KC1),15mmol/L氯5.6高盐察氏培养基：按GB/T13092规定。5.7构巢曲霉质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。6仪器和设备6.1实时荧光PCR仪。6.2生物安全柜：AII型。6.3霉菌培养箱。6.4离心机：转速≥12000r/min。6.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.6高压灭菌器。6.7恒温水浴锅。6.8天平：感量0.1g。6.10均质器或乳钵。6.11涡旋混合器6.12实时荧光PCR反应管。6.13离心管：1.5mL。7.1样品制备与培养参照GB/T13092对样品进行制备与培养。7.2DNA提取从培养平皿上刮取菌丝0.2g～0.5g于1.5mL离心管，使用真菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20℃保存。取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL,使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式(1)计算，当A260/A₂80比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩3式中：c——DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/μL);A—260nm处的吸光值；N—核酸稀释倍数。7.3.1实时荧光PCR反应体系10×PCR缓冲液2.5μL、引物对(10μmol/L)各1μL、探针(10μmol/L)1μL、dNTP(10mmol/L)1μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL、模板DNA2μL、用灭菌去离子水补足体积至25μL。7.3.2实时荧光PCR反应条件95℃预变性2min,95℃变性10s,60℃退火延伸1min,同时收集FAM荧光，共进行40个循环，反应产物可在4℃保存。不同仪器、不同TaqDNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检验过程中分别设置空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以无菌水代替DNA模板；阴性对照采用非构巢曲霉DNA作为实时荧光PCR反应的模板；阳性对照采用构巢曲霉DNA作为实时荧光PCR反应的模板。8结果判定与报告——空白对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0;——阴性对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0;——阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应≤35.0;否则，视为无效。8.2结果判定和报告——Ct值≥40.0,可判定样品实时荧光PCR结果为阴性，可直接报告未检出构巢曲霉；——Ct值≤35.0,可判定样品实时荧光PCR结果为阳性，按附录A进行确证。确证试验结果为构巢曲霉，则报告检出构巢曲霉；——35.0<Ct值<40.0,此时应适当增加DNA模板量重做实时荧光PCR检测。重做结果Ct值≥40.0者为阴性，报告未检出构巢曲霉。否则实时荧光PCR结果为阳性，按附录A进行确证。确证试验结果为构巢曲霉，则报告检出构巢曲霉。9生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应小心处置，并按GB/T27403中的有关规定执行。10废弃物处理和防止污染的措施410.1检验过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。10.2检验过程中防止交叉污染的措施按照G5(规范性附录)构巢曲霉确证方法A.1.1显微镜：10×~100×。A.1.2目镜测微计。A.1.3物镜测微计。A.1.4无菌接种罩。A.1.5放大镜。A.1.6滴瓶。A.1.7接种钩针。A.1.8分离针。A.1.10盖玻片：18mm×18mm。A.1.11灭菌刀子。A.2试剂苯酚10g,乳酸(密度1.21kg/m³)10g,甘油20g,蒸馏水10mL。将苯酚在水中加热溶解，然后加入乳酸及甘油。取载玻片加乳酸-苯酚液一滴，用接种针取一小块霉菌培养物(尽量是纯培养物),置乳酸-苯酚液中，用两支分离针将培养物撕开成小块，切忌涂抹，以免破坏霉菌结构；然后加盖玻片，如有气泡，可在酒精灯上加热排除。制片时最好是在接种罩内操作，以防孢子飞扬。A.3.2镜检观察霉菌的菌丝和孢子的形态和特征、孢子的排列等，并做详细记录。A.3.3构巢曲霉形态特征构巢曲霉菌落生长较快，14d直径5cm～6cm,绒状，绿色，有的菌系由于产生较多的闭囊壳而显现黄色，反面紫红色。分生孢子头短柱形，(40μm～80μm)×(25μm～40μm)。分生孢子梗极短，常弯6