《肿瘤个体化治疗检测技术指南(试行)》的文件

《肿瘤个体化治疗检测技术指南(试行)》的文件1目的与适用范围为规范我国肿瘤个体化治疗相关生物标志物检测的技术流程，保障检测结果的准确性和重复性，指导临床合理选择治疗药物，提高肿瘤患者治疗应答率、降低不良反应发生率、改善长期预后，根据我国肿瘤诊疗实际需求，结合国内外肿瘤诊疗指南与技术进展，制定本指南。据国家癌症中心2023年发布数据，我国年新发恶性肿瘤约406.4万例，超过40%的患者可从肿瘤个体化治疗检测中获益，本指南适用于全国各级医疗机构、医学检验实验室开展以指导肿瘤药物治疗为目的的体细胞变异、表达谱等生物标志物检测，也可用于肿瘤个体化治疗检测的质量控制与管理。2术语和定义2.1肿瘤个体化治疗检测：指通过分析肿瘤患者生物样本中的基因组、转录组、蛋白组层面的生物标志物，明确肿瘤分子特征，为临床治疗方案选择、疗效预测、预后判断、耐药监测提供依据的检测技术，本指南主要针对指导药物治疗的体细胞分子标志物检测。2.2体细胞变异：指肿瘤发生发展过程中肿瘤细胞基因组获得的非遗传性变异，区别于生殖细胞来源的可遗传性变异，是肿瘤靶向、免疫治疗的核心预测标志物。2.3伴随诊断：指与特定治疗药物的应答或安全性明确相关，能够准确识别最可能从该药物中获益患者人群的体外诊断检测，已获得药品监督管理部门批准伴随诊断资质。2.4肿瘤突变负荷（TMB）：指人类基因组编码区每百万碱基对中检测到的体细胞单核苷酸变异和插入缺失变异的总数，单位为mut/Mb。2.5微卫星不稳定性（MSI）：指由于DNA错配修复功能缺陷，导致基因组中短串联重复序列（微卫星）长度发生异常改变的现象，分为高度微卫星不稳定（MSI-H）、低度微卫星不稳定（MSI-L）、微卫星稳定（MSS）三类。3检测技术类型及适用场景3.1PCR类技术3.1.1Sanger测序：检测准确率可达99%以上，检测限为等位基因频率（AF）≥10%，适用于单个或少数已知位点变异检测，成本低、周期短（1~2天），缺点为仅能检测已知变异，对低丰度变异漏检率高，目前多用于小样本位点验证。3.1.2荧光定量PCR（qPCR）：检测灵敏度可达AF≥1%，检测周期短，技术标准化程度高，适用于已知热点变异的常规临床检测，如EGFR、KRAS热点突变检测，缺点为仅能检测预先设计的位点，无法发现未知变异，检测通量低。3.1.3数字PCR（dPCR）：检测灵敏度可达AF≥0.1%，可实现变异的绝对定量，适用于液体活检低丰度变异检测、术后微小残留病（MRD）动态监测、靶向治疗耐药监测，缺点为仅能检测已知位点，检测成本高于qPCR。3.2杂交类技术3.2.1荧光原位杂交（FISH）：检测准确率可达95%以上，是HER2基因扩增、ALK融合基因检测的金标准方法，检测限可检出含5%以上肿瘤细胞的样本中的目标变异，缺点为检测通量低，仅能检测已知靶标，操作复杂，对人员技术要求高。3.2.2基因芯片：可高通量检测全基因组范围的拷贝数变异、杂合性缺失，通量显著高于FISH，适用于大样本组学分析，缺点为无法检测未知点突变，灵敏度中等，检测限为AF≥10%。3.3下一代测序（NGS）技术3.3.1扩增子测序：针对预先设计的热点变异区域扩增建库，文库制备简单，对DNA质量要求低，灵敏度可达AF≥1%~5%，成本较低，适用于大样本热点变异检测，缺点为仅能检测预设区域，拷贝数变异（CNV）检测准确性低于杂交捕获测序。3.3.2杂交捕获测序：可覆盖从几十基因到全外显子的大范围区域，可同时检测点突变、插入缺失、融合基因、CNV、TMB、MSI等多种标志物，检测TMB、MSI的准确性高于扩增子测序，缺点为对DNA样本量和质量要求高，成本较高，周期较长（3~7天）。用于临床TMB检测的panel要求编码区覆盖长度不低于1Mb，覆盖长度不足1Mb时检测准确性会下降30%以上。3.3.3全外显子测序（WES）/全基因组测序（WGS）：可覆盖全部编码区或全基因组，可发现罕见变异、结构变异，适用于多线治疗耐药、罕见肿瘤患者的潜在靶点筛选，WGS还可检测复杂结构变异，缺点为成本高、数据分析复杂，目前仅用于临床研究或特殊病例，暂不普及。4检测前质量控制据统计，分子检测流程中超过60%的错误发生在检测前环节，必须严格控制检测前质量。4.1样本类型与处理规范组织样本为肿瘤个体化治疗检测的金标准，优先选择原发灶或转移灶的手术/穿刺样本，要求：手术切除样本离体后30分钟内浸入10%中性缓冲福尔马林固定，固定液体积不低于样本体积的10倍，固定时间控制在6~48小时，最长不超过72小时，过长固定会导致核酸过度交联降解，降低检测准确性；穿刺样本固定要求与手术样本一致；用于检测的组织样本中肿瘤细胞占比不低于20%，若肿瘤细胞占比<20%，需由病理医师标记肿瘤区域，通过显微切割富集肿瘤细胞后再检测，避免正常细胞稀释导致假阴性。液体样本适用于组织样本无法获取、需要动态监测耐药或MRD的情况，以循环肿瘤DNA（ctDNA）检测最常用，要求：外周血采集优先使用cfDNA专用保存管，若使用EDTA抗凝管，必须在采集后2小时内分离血浆；血浆分离采用两步离心法：第一步1600g离心10分钟，吸取上层血浆后，第二步16000g离心10分钟去除残留细胞碎片，避免基因组DNA污染；做NGS检测需要至少采集10ml外周血，可获得50~100ngcfDNA，满足检测需求；胸水、脑脊液等体腔样本需离体1小时内离心沉淀肿瘤细胞提取核酸。4.2核酸质量控制核酸提取需选用对应样本类型的商品化试剂盒，提取后必须进行质量控制：DNA浓度用Qubit荧光法定量，片段大小用毛细管电泳检测；FFPE样本DNA片段中位数<100bp的判定为不合格，不适合NGS检测；ctDNA片段大小集中在160~180bp，若出现大片段峰，提示存在基因组DNA污染，需重新处理样本。4.3临床信息收集检测申请需提供患者完整临床信息：年龄、性别、病理诊断、肿瘤分期、既往治疗史、用药史、检测目的，便于区分体细胞变异与生殖细胞变异，准确解读结果。5检测流程与技术要求5.1靶向药物相关生物标志物检测①EGFR突变（非小细胞肺癌）：必测位点包括18外显子G719X、19外显子缺失、20外显子T790M、20外显子插入突变、21外显子L858R、L861Q，覆盖95%以上临床有意义变异，检测灵敏度要求可检出AF≥5%的变异；②ALK融合（非小细胞肺癌）：首选VENTANAIHC初筛，IHC3+直接判定为阳性，IHC0/1+判定为阴性，IHC2+需用FISH或NGS验证，整体诊断准确性超过98%；③HER2检测（乳腺癌、胃癌、肺癌）：IHC初筛，IHC3+为阳性，IHC0/1+为阴性，IHC2+需FISH或NGS验证，FISH检测HER2/CEP17比值≥2.0或平均HER2拷贝数≥6个/细胞判定为阳性，NGS检测与FISH一致性超过92%；④BRAFV600E突变（黑色素瘤、肺癌、结直肠癌）：可采用PCR或NGS检测，用于指导BRAF抑制剂治疗；⑤KRAS/NRAS突变（结直肠癌）：需检测2、3、4外显子所有热点变异，突变阳性患者不推荐使用抗EGFR单抗治疗。5.2化疗药物相关生物标志物检测①DPYD基因变异：DPYD2A是最常见的DPD酶失活变异，纯合变异携带者使用5-氟尿嘧啶发生4级以上毒性风险接近100%，禁止使用5-氟尿嘧啶类药物；杂合变异携带者严重毒性风险约40%，需减量50%；②UGT1A1基因多态性：UGT1A128纯合变异携带者使用伊立替康后，3级以上迟发性腹泻风险约35%，显著高于野生型的8%，起始剂量需降低25%~30%；③ERCC1mRNA表达：ERCC1高表达提示顺铂耐药，可用于指导顺铂用药选择。5.3免疫检查点抑制剂相关生物标志物检测①MSI检测：NCI推荐的5位点PCR法是金标准，≥2个位点不稳定判定为MSI-H，1个为MSI-L，0个为MSS；NGS检测MSI与金标准一致性超过95%，适用于多基因检测同步分析；MSI-H实体瘤患者接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的客观应答率约45%，显著高于MSS患者的5%~10%，FDA已批准MSI-H作为泛癌种免疫治疗适应症；②TMB检测：行业公认高TMBcutoff值为≥10mut/Mb，高TMB患者免疫单药治疗应答率约为低TMB患者的3倍；检测需排除克隆性造血变异、生殖细胞变异，避免假阳性；③PD-L1表达检测：采用IHC法，不同药物对应不同抗体与cutoff值：帕博利珠单抗治疗非小细胞肺癌采用22C3抗体，TPS≥1%即可推荐，TPS≥50%优先推荐；阿替利珠单抗采用SP142抗体，TC≥1%或IC≥1%即为阳性，需严格按照伴随诊断试剂规范操作判读。5.4耐药监测与MRD检测靶向治疗耐药后约50%的EGFR-TKI耐药患者会出现T790M突变，10%会出现MET扩增，需再次活检或液体活检明确耐药变异，指导后续治疗；术后MRD检测采用高深度NGS或dPCR，灵敏度要求达到可检出AF≥0.01%的变异，ctDNA-MRD阳性患者复发风险约为阴性患者的10倍，可指导辅助治疗方案选择。6结果解读与报告规范6.1结果解读原则所有变异命名采用人类基因组变异协会（HGVS）最新规范命名，需区分体细胞变异与生殖细胞变异，根据变异临床意义分为四类：①明确临床意义：有充分循证医学证据（指南、药物说明书、大规模临床研究）支持变异与药物敏感性/耐药相关；②潜在临床意义：有小型临床研究或临床前证据支持相关性，尚未被权威指南明确推荐；③意义未明变异：现有证据无法明确临床意义；④良性/多态性变异：明确不影响药物应答。对于意义未明变异不得随意推荐用药，需明确告知临床现有证据不足。6.2报告内容要求报告必须包含：患者基本信息、样本信息（样本类型、采集时间、处理时间、肿瘤细胞占比）、检测方法、检测平台、检测范围、检测结果（含变异信息、等位基因频率、分类）、结果解读及临床建议、检测局限性说明、检测人员、审核人员签名、实验室资质信息。7质量保障与伦理要求7.1质量控制开展检测的实验室必须建立室内质控体系，每批次检测必须加入阳性对照和阴性对照，对照结果符合要求才可发报告；开展新检测项目前必须完成方法学验证，与金标准比对，满足灵敏度≥95%、特异性≥99%、符合率≥90%才可用于临床；实验室必须参加国家卫生健康委临床检验中心或其他认可机构的室间质评，所有参评项目必须