《杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法》

ICS65.120B40团体标准T/HXCYXXX-2025杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法AuthenticityIdentificationofHybridAlfalfaSeedsbySSR（征求意见稿）202X-XX-XX发布202X-XX-XX实施北京华夏草业产业技术创新战略联盟发布

T/HXCYxxx—2025目次TOC\o"1-1"\h\z\u前言 II1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略词 25原理 26仪器设备 37所需试剂 38引物 39试验步骤 410数据统计记录 711结果分析 7 1范围本文件规定了SSR分子标记法鉴定杂交苜蓿种子真实性的术语和定义、仪器设备、实验步骤、结果分析等内容。本文件适用于杂交苜蓿种子真实性鉴定、品种的审定、新品种知识产权保护及种子市场监管。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T2930.4《草种子检验规程发芽试验》DB62/T4094《草品种真实性检验规程SSR标记法》3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1简单重复序列simplesequencerepeat(SSR)是由1-6个核苷酸为基本单位，通过连续串联重复形成的DNA片段，长达通常在几十个至几百个bp之间，又称微卫星序列或短串联重复序列，重复单元的数量在不同个体或物种中高度可变，形成多态性标记，是遗传分析的重要工具。3.2琼脂糖凝胶电泳agarosegelelectrophoresis是一种基于分子大小分离DNA片段的常用分子生物学技术。琼脂糖凝胶电泳利用琼脂糖凝胶作为介质，在电场作用下，使带负电的核酸分子（DNA）从负极向正极迁移，通过凝胶孔径的分子筛效应，实现不同大小核酸片段的分离。分离后的核酸可通过染色进行可视化分析。3.3聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术，通过模拟DNA天然复制过程，实现目标序列的指数级扩增。DNA双链变性：高温（约95℃）使双链DNA解链为单链模板；引物退火：降温（通常是55℃～65℃）使特异性引物与单链DNA的互补区域结合；链延伸：中温（约72℃）下，DNA聚合酶以单链为模板，按照碱基互补配对原则，以5'→3'方向合成新链；重复循环上述步骤，实现DNA指数增长。3.4引物primer是人工合成的短核苷酸序列（通常在18bp～30bp），能够通过碱基互补配对与模板DNA特异性结合，引导DNA聚合酶从3'端开始合成新链。3.5聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)是一种基于分子大小、电荷或构象分离DNA的高分辨率电泳技术。以聚丙烯酰胺凝胶为介质，通过交联聚合反应，利用电场驱动带电分子迁移。4缩略词下列缩略语适用于本文件。bp:basepair，碱基对DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核苷酸DNAmarker:用于比较DNA片段大小的标准工具TBE：电泳缓冲液Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸ddH2O：双蒸水（超纯水）LoadingBuffer：上样缓冲液5原理因基因组存在着能够世代遗传的简单重复序列，杂交种子具有双亲等位标记互补带型。根据父母本的特征分子标记对应在杂交种中的谱带，可判断该杂交种的真伪性。SSR分子标记技术因其多态性高、重复性好、操作简便等特点，是遗传分析的重要工具。设计特异引物，利用PCR技术进行扩增，扩增产物利用电泳进行分离，分析其长度多态性，达到杂交苜蓿种子真实性鉴定。6仪器设备高压灭菌锅、台式冷冻高速离心机、恒温水浴锅（30-100℃）、超纯水仪、电子天平、凝胶成像系统、PCR扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽及配套制胶工具、摇床、磁力搅拌器等。7所需试剂所用试剂均为分析纯。7.1DNA提取使用植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。（液氮、研钵等）7.2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖、核酸染料、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、冰醋酸、氢氧化钠、6×LoadingBuffer等。7.3PCR扩增引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×Buffer缓冲液、ddH2O、Mg2+、Mix反应混合液。7.4聚丙烯酰胺凝胶电泳溴酚蓝、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、硼酸、亲和硅烷、玻璃硅烷、乙酸、DNAmarker、无水乙醇、碳酸钠、四甲基乙二胺、过硫酸铵、去离子甲酰胺、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠等。8引物引物信息见表1。表1引物信息表引物名称正向序列（5‘-3’）反向序列（3‘-5’）MTB60AAGAATGACGAAGAGGCGAATCAGAAATTCCCTCCCATTGAFcact60CCTCCCTAACTTTCCAACATGGATCAACGTGTCTTTCAFct32TTTTTGTCCCACCTCATTAGTTGGTTAGATTCAAAGGGTTACMTLEC2ACGGAAAGATTCTTGAATAGATCTGGTTCGCTGTTCTCATGMTB330ATCAACGTGTTGTCACCTCCTTCCATAAGCATTGTCGCTTGB14B03GCTTGTTCTTCTTCAAGCTCACCTGACTTGTGTTTTATGCMTB45TCCTTGAGAGGTTTACAAAGCATCAATGGTACCTCATTTCAACAAMTB340GACTTTGATTGGAAGGCCAAATCCACCACAAATCACAGGAAMTB200ATTAGTGTGCGGGTCACCTCAGTTTCGTACTCCCTCCGGTMMT42CGTCGTTTACTCAAACGACACCGCGTGTTTCTGCTGATTCATMMTB76AAAAAGGGATCGGCACACTTGAGGACACAGTCTCCGTGAGCMTRmiR045ATGACTTCAACCATAACTCCAAAAAGAAAAAGAGGCTGACATMTRmiR054TAGCTAGCAATGAAAACCACTCAAGCACAGAAGAAAAGTTGAMTRmiR072ACTCCAATTGTGGCTATAAAAGGTCCATGAGCTAACAAACTA9试验步骤9.1取样供检的样品按GB/T2930.4《草种子检验规程发芽试验》标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中取样进行检测。同时对父、母本幼嫩叶片进行取样。9.2DNA提取本文件采用植物基因组DNA提取试剂盒进行苜蓿DNA的提取，提取流程按照DNA提取试剂盒流程说明书进行。9.3DNA质量检测将2L的DNA样品与1L的6×LoadingBuffer充分混合均匀后点于0.8%的琼脂糖凝胶点样孔内。进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，在凝胶成像仪下进行拍照观察。凝胶配制：（1）配制TBE溶液：称取108g的Tris碱、55g硼酸、EDTA-Na29.3g于烧杯中，加800ml去离子水搅拌溶解，用NaOH调节PH值为8.0，混合均匀，定容至1L;（2）称取0.4g琼脂粉置于100ml锥形瓶中，加入20ml1×TBE后，放到加热器加热至琼脂糖完全融化;（3）待琼脂糖完全融化后，加入2μl核酸染料，混合均匀后，冷却;（4）将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶沿制胶槽边沿小心缓慢地倒入内槽玻璃板上，待琼脂糖凝胶溶液缓慢展开，直至整个制胶槽内槽表面形成均匀无气泡的胶层，室温静置;（5）待凝胶完全凝固后，垂直轻拔出梳子，取出胶带，放入电泳槽中，用于上样。9.4引物筛选利用亲本DNA，在核心引物中筛选出具有较好多态性、亲本间DNA片段差异较大，条带清晰的引物，作为特定引物对供检样品进行检测。9.5PCR扩增9.5.1反应体系10L的反应体系包含2L的DNA，正反引物各0.4L、5LMix反应混合液和2.2L超纯水。9.5.2反应程序94℃预变性4min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃下延伸1min，循环35次，在72℃下延伸10min。注：此程序中退火温度根据引物进行调节。9.5.3扩增产物PAGE电泳检测扩增产物基因型用PAGE电泳检测，本标准使用100孔垂直电泳槽进行PAGE电泳检测的方法。9.6PAGE电泳9.6.1凝胶制备（1）先取六对十二板玻璃板，加洗洁精，用自来水洗净每板玻璃板表面灰尘和污渍直至光滑无污渍（避免凝胶过程中产生气泡），再用蒸馏水冲洗，直立晾干，用95%的酒精擦拭玻璃板后，晾干备用;（2）取适量的剥离硅烷均匀地涂抹在短玻璃板上，取同量的亲和硅烷，均匀地涂抹在长玻璃板上，干燥待用；（3）将两块玻璃板对向放置，四边对齐后用夹子夹牢两个竖边，备用；（4）量取40ml的8%聚丙烯酰胺（提前配好）于100ml烧杯中；（5）向烧杯中分别加入40μl的四甲基乙二胺和200μl的过硫酸铵，迅速混匀；（6）将混合均匀的溶液沿孔边缘缓缓倒入，使溶液充满两板之间而不外漏。灌胶过程中应缓慢避免出现气泡。同时，也不宜过慢，以免在还未灌完胶时出现已凝固的情况；（7）灌胶完成后，插上梳子（不能左右摇晃），放置2h以上，使其完全凝固；（8）胶完全凝固之后，缓慢拔出梳子，拔梳子过程中要垂直拔出，不能左右摇晃；（9）将配好的5×TBE倒入电泳槽下槽，用夹子将制好的胶固定在电泳槽两侧，在电泳槽的上侧倒入5×TBE没过胶面。预电泳10min~20min。9.6.2电泳在胶板两侧点入2μl的2000bpDNA分子量标准，依次将2μl的PCR产物迅速注入点样孔内（避免出现气泡），同时记录好点样顺序。加样完成后，在200V恒压下电泳2h。9.6.3银染显色（1）关闭电泳槽，切断电源，去掉夹子，回收电泳槽上槽的5×TBE于烧杯中。取下玻璃板并冲洗，缓慢取下涂有剥离硅烷的玻璃板，将涂有亲和硅烷的玻璃板置于盛有固定液（提前配制）的盘中。放在80rmp的摇床上，摇晃15min；（2）取出胶板（带有凝胶的玻璃板），将胶板放入盛有1L蒸馏水的盘内5min；（3）硝酸银溶液配制：称取2g的硝酸银，加入1000ml的蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀;（4）将漂洗好的胶板取出放入盛有硝酸银溶液的盘中，在80rmp的摇床上，摇晃15min；（5）取出胶板，放入盛有1L蒸馏水的盘内清洗；（6）显示溶液配制：称取20g氢氧化钠，加入1000ml的蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀后，加入5ml甲醛溶液，摇匀，使其充分混合备用;（7）取出清洗过的胶板，放入显示溶液中，放置在80rmp的摇床上，直至条带清晰；（8）出现清晰条带后，加入配制好的终止液。待终止后，取出胶板，用清水冲洗干净；（9）将条带清晰的胶板放到扫描仪上扫描并保存图片。注：银染过程中戴专用塑胶手套。10数据统计记录根据聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增出来的条带来判断杂交种的真伪。依据保存好的图片，位点由上到下记录。该位点有条带的标记为“1”，无条带的标记为“0”。如果该位点出现无法分辨，缺失等情况，则记为“0”。11结果分析首先依据父母本中的条带，对杂交种的条带进行分析，将含有父母本条带的检测样品判定为真杂种。团体标准《杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法》编制说明《杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法》团标制定组二〇二五年五月一、任务来源及标准制定背景1、任务来源在内蒙古自治区苜蓿种业“揭榜挂帅”--“抗寒与耐盐碱高产优质苜蓿新品种选育”等项目的资助和支持下完成。2、起草单位与参编单位内蒙古大学、中国农业科学院草原研究所、内蒙古农业大学3、标准制定背景苜蓿作为重要的优质饲草，有着“牧草之王”的美称。它是草食畜牧业等最重要的蛋白质来源之一，在我国畜牧业发展中占据重要地位。随着畜牧业的不断快速发展，对苜蓿的需求量日益增长。目前我国自主培育的苜蓿品种远不能满足市场需求。与国外相比，我国育成的苜蓿品种数量较少，技术含量较低，苜蓿种子大量依赖于进口。2022年，农业农村部印发的《“十四五”全国饲草产业发展规划》中提出要确保牛羊肉和奶源自给率的目标。该规划为我国苜蓿种业发展指明了方向。但目前我国的苜蓿产业仍面临着卡脖子重要问题，急需培育出高抗且高产的苜蓿新品种。杂交育种是培育高产且抗性强苜蓿新品种的主要手段之一。苜蓿是同源四倍体，异花授粉植物，但也存在一定的自交率。同时，人工去雄不彻底等因素，收获的杂交种也可能出现伪杂种的现象。伪杂种会影响到苜蓿杂交种的纯度，影响苜蓿育种的效率，对苜蓿新品种的培育产生不利影响。对苜蓿杂交种进行杂种真伪鉴定，筛选出含有父母本条带的真杂种，是支撑苜蓿杂交育种后续研究的重要基础。因基因组存在着能够世代遗传的简单重复序列，杂交种子具有双亲等位标记互补带型。根据父母本的特征分子标记对应在杂交种中的谱带，可判断该杂交种的真伪性。SSR分子标记技术因其多态性高、重复性好、操作简便等特点，是遗传分析的重要工具。设计特异引物，利用PCR技术进行扩增，扩增产物利用电泳进行分离，分析其多态性，达到杂交苜蓿种子真实性鉴定。通过对苜蓿杂交种进行真伪鉴定，筛选出真杂种，剔除伪杂种。避免伪杂种造成的混杂，影响高产且抗性强苜蓿新品种的培育效率。二、主要工作过程1、2025年2月：根据2025年《北京华夏草业产业技术创新战略联盟团体标准制修订管理办法》中相关要求，内蒙古大学牵头成立了标准起草小组，认真学习了团体标准管理规定等相关文件，讨论标准编写事宜。2、2025年3月：起草小组全部成员，认真总结苜蓿杂交种鉴定已有的研究成果，讨论决定并提交“杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法”团体标准立项申请表至北京华夏草业产业技术创新战略联盟秘书处，申请立项。3、2025年4月：北京华夏草业产业技术创新战略联盟组织进行了团体标准建议评审，并于4月12日发布《北京华夏草业产业技术创新战略联盟关于2025年第一批团体标准立项的通知》，同意立项。4、2025年5月：首先编制组接受团体标准评审专家意见，以SSR分子标记法鉴定杂交苜蓿种子真实性试验结论为基础，查阅大量文献、标准、著作等资料。并对相关资料进行了分析、研究归纳与综合，同时对团体标准的格式、内容、术语表达方式等进行深入学习，完成《杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法》征求意见稿及编制说明的撰写，提交至北京华夏草业产业技术创新战略联盟秘书处。三、标准编制原则和主要技术内容确定的依据1、标准编制原则按照GB/T1.12020《标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写》的要求和规定编写文件内容。本文件编制遵循农业标准制修订原则，即经济上合理、实施中可行等原则。本标准制定以开展的杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法相关的试验数据为依据，同时还学习了国内相关标准的经验和条款。该标准与现行法律法规无冲突。2、主要技术内容确定的论据2.1适用范围本文件规定了SSR分子标记法鉴定杂交苜蓿种子真实性的术语和定义、仪器设备、实验步骤、结果分析等内容。本文件适用于杂交苜蓿种子真实性鉴定、品种的审定、新品种知识产权保护及种子市场监管。2.2规范性引用文件本标准制定时，参照了DB62/T4094《草品种真实性检验规程SSR标记法》、GB/T2930.4《草种子检验规程发芽试验》等标准。2.3术语与定义标准给出了简单重复序列、琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链式反应、引物、聚丙烯酰胺凝胶电泳的术语和定义，这些术语和定义适用于本标准。2.4主要技术指标确定的依据（1）人工杂交获得杂交种在课题组多年对苜蓿育种研究的基础上，以抗性强、高产为目标，选择父母本材料进行杂交，选择晴朗无风的天气进行人工授粉。因人工去雄操作方式较为复杂，为提高苜蓿杂交工作的效率。因此，在杂交过程中，采用不去雄的方式。授粉后，套袋隔离。收获杂交种，用于后续杂交种真伪鉴定。杂交组合信息见表1。表1杂交结果信息统计杂交组合杂交花数结荚数种子数饱满种子数饱满种子率%结荚率%组合11605917515186.2936.88组合21025313610980.1551.96组合3573817215891.8666.67组合4835619811859.6067.47组合5634820119697.5176.19组合8795717314986.1372.15组合9946519713669.0469.15组合10937121815370.1876.34组合111118227922881.7273.87组合121047516914786.9872.12（2）引物通过查阅有关苜蓿的文献等资料，获得引物信息。引物信息见表2。表2引物信息引物名称正向序列（5‘-3’）反向序列（3‘-5’）MTB60AAGAATGACGAAGAGGCGAATCAGAAATTCCCTCCCATTGAFcact60CCTCCCTAACTTTCCAACATGGATCAACGTGTCTTTCAFct32TTTTTGTCCCACCTCATTAGTTGGTTAGATTCAAAGGGTTACMTLEC2ACGGAAAGATTCTTGAATAGATCTGGTTCGCTGTTCTCATGMTB330ATCAACGTGTTGTCACCTCCTTCCATAAGCATTGTCGCTTGB14B03GCTTGTTCTTCTTCAAGCTCACCTGACTTGTGTTTTATGCMTB45TCCTTGAGAGGTTTACAAAGCATCAATGGTACCTCATTTCAACAAMTB340GACTTTGATTGGAAGGCCAAATCCACCACAAATCACAGGAAMTB200ATTAGTGTGCGGGTCACCTCAGTTTCGTACTCCCTCCGGTMMT42CGTCGTTTACTCAAACGACACCGCGTGTTTCTGCTGATTCATMMTB76AAAAAGGGATCGGCACACTTGAGGACACAGTCTCCGTGAGCMTRmiR045ATGACTTCAACCATAACTCCAAAAAGAAAAAGAGGCTGACATMTRmiR054TAGCTAGCAATGAAAACCACTCAAGCACAGAAGAAAAGTTGAMTRmiR072ACTCCAATTGTGGCTATAAAAGGTCCATGAGCTAACAAACT