新冠病毒核酸筛查稀释混样检测标准操作程序SOP

一、前言为规范新冠病毒核酸筛查中稀释混样检测的操作流程，确保检测结果的准确性、可靠性和及时性，最大限度提高检测效率，同时保证实验室生物安全，特制定本标准操作程序（SOP）。本程序依据国家相关技术指南和标准，并结合实验室实际情况制定，适用于新冠病毒核酸大规模人群筛查工作。所有相关操作人员必须经过严格培训，熟练掌握本程序后方可上岗。二、适用范围本SOP适用于采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法，对人群新冠病毒核酸筛查样本进行稀释混样检测的全过程。主要应用于低风险地区大规模人群筛查，或特定场景下的快速排查。对于混样检测结果为阳性的样本，需按规定进行单样本追溯复核。三、术语与定义1.混样检测：将多个（通常为N个）个体的鼻咽拭子等呼吸道样本，按照一定比例分别取出，混合在一起形成一个混合样本，再进行核酸提取和扩增检测的方法。2.稀释混样检测：在混样前，先将每个个体的原始样本用指定的稀释液按一定比例进行稀释，然后再从稀释后的样本中取出等量体积混合成一个混合样本进行检测的方法。此方法可降低原始样本中可能存在的抑制物浓度，并在一定程度上减少因个别强阳性样本对混合样本检测结果的潜在干扰。3.单采样本：采集自单个个体的呼吸道样本，通常保存于含病毒保存液的采样管中。4.混样稀释液：用于对单采样本进行预稀释的特定液体，通常为无RNA酶的生理盐水、PBS缓冲液或试剂盒配套的样本释放剂等。5.阴性质控品：已知不含新冠病毒核酸的样本或稀释液，用于监控整个检测过程是否受到污染。6.阳性质控品：已知含有新冠病毒核酸（或其特定片段）的样本，用于监控整个检测过程的有效性。7.内标：加入到反应体系中的已知序列，用于监控核酸提取和扩增过程是否成功，排除假阴性结果。四、操作步骤4.1检测前准备4.1.1人员准备操作人员应具备相应的专业资质，熟悉本SOP及相关生物安全知识。进入实验室前，按规定穿戴个人防护装备（PPE），包括医用防护口罩、护目镜/防护面屏、一次性工作帽、防护服、一次性乳胶手套或丁腈手套。操作过程中如手套破损或污染，应立即更换。4.1.2环境与设备准备1.实验室环境：确保实验室各功能分区（如试剂准备区、样本制备区、扩增区）符合生物安全要求，各区之间严格物理隔离，避免交叉污染。实验前对各区域进行清洁和消毒。2.生物安全柜：样本稀释、混样操作必须在Ⅱ级及以上生物安全柜内进行。操作前检查生物安全柜运行状态是否正常（气流、负压等），并用75%乙醇或含氯消毒剂（如有效氯含量为某浓度的次氯酸钠溶液）擦拭工作台面及内壁。3.仪器设备：检查移液器（不同量程）、离心机、核酸提取仪、实时荧光定量PCR仪等设备是否在校准有效期内，运行是否正常。对离心机转头、仪器表面等进行清洁消毒。4.1.3试剂与耗材准备1.主要试剂：根据检测需求，准备新冠病毒核酸提取试剂、RT-PCR扩增试剂、混样稀释液（如无特殊规定，可使用0.9%氯化钠注射液或试剂盒推荐的稀释液）。2.耗材：无菌无RNA酶的离心管（用于混样）、带滤芯的无菌吸头（不同规格）、样本架等。3.试剂核查：核对所有试剂的名称、批号、有效期，确保在有效期内使用。检查试剂是否有漏液、浑浊、沉淀等异常情况。核酸提取试剂和扩增试剂按照说明书要求的条件储存和复苏。4.混样稀释液准备：如需自行配制或分装混样稀释液，应在试剂准备区进行，使用无菌容器和无RNA酶操作。根据拟混样份数和稀释比例，计算所需稀释液总量，确保足量供应。4.2样本接收与核对1.接收样本时，核对样本采集管标签信息（如条形码、姓名、编号等）与送检清单是否一致，检查样本管是否完好、无渗漏，样本量是否符合要求。2.对于不合格样本（如标签不清、管盖松动、渗漏、样本量不足等），应按规定流程处理并记录。3.样本暂时储存于规定温度条件下，并尽快进行检测。4.3样本稀释与混样操作（以下操作均在样本制备区的生物安全柜内进行）4.3.1方案设定根据实验室采用的混样策略（如N合1，常见有5合1、10合1等，具体N值根据试剂性能、疫情风险等级及上级要求确定），确定稀释比例和混样体积。例如，采用“1:M稀释后N合1混样”，即先将每份单采样本按1:M比例稀释，再取N份稀释后的样本各1份混合。4.3.2单样本稀释（如采用先稀释后混样策略）1.取出N个待混样的单采样本，在生物安全柜内排列于样本架上。2.取N个无菌离心管（或深孔板对应孔位），标记混样编号，并在每个管（孔）中加入预设体积的混样稀释液（例如，若计划取10μL原始样本进行1:M稀释，则加入90μL稀释液，即实现1:10稀释）。3.更换新的无菌带滤芯吸头，吸取单采样本管中样本上清液（注意避免吸到拭子头），按预设体积（如10μL）加入到对应编号的含稀释液的离心管（孔）中。每处理一份样本，更换一个新的吸头。4.加样完成后，将该离心管（孔）盖紧，轻轻涡旋或移液器吹打（注意避免产生气溶胶）进行充分混匀，作为该单样本的稀释液。4.3.3混合样本制备1.取一个新的无菌离心管作为混合样本管，标记清晰的混样编号，并记录该混样编号对应的所有单采样本信息。2.依次从上述N个已完成稀释的单样本稀释液中，准确吸取预设体积的稀释样本（例如，每个稀释样本吸取50μL），加入到混合样本管中。每吸取一个稀释样本，更换一个新的无菌带滤芯吸头。3.所有N份稀释样本均加入后，盖紧混合样本管盖，轻轻颠倒混匀或使用振荡器混匀，确保混合均匀。4.3.4直接混样操作（如采用直接取原始样本混样策略，需确认试剂兼容性）1.取一个新的无菌离心管作为混合样本管，标记混样编号。2.依次从N个单采样本管中，准确吸取极小体积（如5μL-20μL，根据试剂要求和N值确定）的原始样本上清液，加入到混合样本管中。每吸取一个样本，更换一个新的无菌带滤芯吸头。3.所有N份样本均加入后，盖紧混合样本管盖，轻轻颠倒混匀或使用振荡器混匀。4.3.5注意事项1.严格执行无菌操作和无RNA酶操作，避免样本间交叉污染和外源核酸污染。2.移液操作应准确、规范，避免气泡产生。吸头应一次性使用，严禁重复使用。3.混样过程中，样本管和混样管的标记必须清晰唯一，防止混淆。4.操作完成后，将混合样本管短暂离心（如3000rpm，离心10-30秒），去除管盖内壁液滴。4.4混合样本核酸提取1.将制备好的混合样本，按照所选用的核酸提取试剂盒说明书的操作步骤，在生物安全柜内进行核酸提取。2.提取过程中，严格按照试剂说明书设置参数，确保提取效率。3.同时设置阴性质控品（如以混样稀释液作为阴性对照，与样本一同进行稀释、混样和提取）和阳性质控品（如已知浓度的假病毒颗粒，按说明书要求加入或单独提取）。4.提取完成后，核酸产物应立即进行扩增或按规定条件短暂保存。4.5核酸扩增与产物分析1.在试剂准备区，按照RT-PCR扩增试剂盒说明书的要求，配制扩增反应体系。注意区分不同靶基因引物探针（如ORF1ab、N基因、E基因等）。2.将配制好的反应混合液（除模板外）转移至样本制备区（或扩增区，根据实验室分区和流程），在生物安全柜内（如在样本制备区加样）向每个反应管中加入预设体积的核酸提取产物（包括混合样本、阴性质控、阳性质控）。3.盖紧管盖，短暂离心后，转移至扩增区的实时荧光定量PCR仪中。4.按照仪器和试剂说明书设置扩增程序（如逆转录温度和时间、预变性温度和时间、循环数、退火延伸温度和时间等），启动扩增反应。5.扩增结束后，根据试剂盒说明书提供的判读标准，分析结果。一般包括：*阴性质控：各靶基因Ct值应无明显扩增或大于等于检测限。*阳性质控：各靶基因Ct值应在预期范围内，扩增曲线正常。*内标（如存在）：应正常扩增，Ct值在合理范围。*混合样本：根据各靶基因Ct值判断阴阳性。4.6结果报告与反馈1.阴性结果：混合样本检测结果为阴性，则提示该混合样本中所有N个个体样本均可能为阴性（存在一定假阴性风险，与试剂灵敏度、病毒载量、操作等有关）。按规定格式和途径报告。2.阳性/可疑阳性结果：混合样本检测结果为阳性或可疑阳性时，立即启动复核程序。*首先对该混合样本的原始核酸提取物进行重复扩增，确认结果。*若重复结果仍为阳性/可疑阳性，则需将该混合样本所包含的N个原始单采样本逐一进行单独核酸提取和扩增检测（即单样本追溯），以确定具体哪个或哪些个体为阳性。*根据单样本追溯结果，按规定流程上报和反馈。3.所有检测结果（包括混样和单样本追溯）均需详细记录，并妥善保存原始数据和扩增曲线。4.7实验后处理1.废弃物处理：实验过程中产生的所有废弃物（包括使用过的吸头、离心管、样本管、防护服等）均按医疗废弃物和生物安全要求分类处理，高压灭菌后交由有资质的单位处置。2.实验区域清洁消毒：实验结束后，对生物安全柜、实验台面、仪器表面等使用75%乙醇或含氯消毒剂进行彻底清洁和消毒。生物安全柜应运行足够时间进行空气净化。3.设备维护：使用后的仪器设备进行清洁和日常维护。4.实验记录：及时、准确、完整地填写实验记录，包括样本信息、试剂信息、操作步骤、仪器参数、质控结果、检测结果、操作人员、日期等。五、质量控制1.人员培训与考核：定期对操作人员进行培训和考核，确保其熟练掌握操作技能和质量控制要求。2.试剂与耗材质控：每批新试剂、新耗材到货后，应进行性能验证。3.室内质控：每次实验必须设置阴性质控、阳性质控和内标（如适用），确保实验过程的有效性。定期进行精密度、检出限等验证。4.室间质评：积极参加国家或省级临床检验中心组织的新冠病毒核酸检测室间质评活动，确保检测结果的准确性和可比性。5.过程记录与追溯：所有操作过程均应有详细记录，确保可追溯。对异常结果和实验偏差进行调查和记录。六、生物安全与注意事项1.严格遵守实验室生物安全管理规定，防止样本泄露和人员感染。2.所有样本均应视为潜在感染性物质，操作时严格执行生物安全防护措施。3.禁止在实验区内饮食、吸烟、喝水等。4.移液操作时避免产生气溶胶。使用带滤芯的吸头，操作结束后及时更换手套。5.如发生样本泄露、锐器伤等意外事件，应立即按照实验室应急预案进行处理，并上报