生姜NAC3转录因子的克隆及生物信息学分析

目录TOC\o"1-3"\h\u中文9910摘要 生姜ZoNAC3转录因子的克隆及生物信息学分析摘要：为获得生姜ZoNAC3转录因子基因CDS序列，探索其生物学功能。本研究以山东大姜为材料，通过PCR技术克隆ZoNAC3的全长cDNA序列，并利用生物信息学手段系统分析其编码蛋白的理化性质、结构特征及进化关系。结果发现，ZoNAC3的CDS区长1138bp，编码378个氨基酸。其编码的蛋白分子量为43.28kDa，等电点为4.51。蛋白质二级结构为无规则卷曲，是一种亲水性、非分泌性和非跨膜蛋白，不存在信号肽，存在4个潜在的糖基化修饰位点。同时，含有典型的NAC家族保守结构域（A/B/C亚域）。系统进化树表明ZoNAC3与天冬门科的假海葱蛋白亲缘关系最近。本研究揭示了ZoNAC3的分子特性，为解析生姜NAC基因功能提供了理论依据，同时为生姜定向遗传改造奠定基础。关键词：生姜；ZoNAC3；基因克隆；生物信息学分析CloningandBioinformaticsAnalysisofZoNAC3TranscriptionFactorinGingerAbstract:ToobtaintheCDSsequenceoftheZoNAC3transcriptionfactorgeneingingerandexploreitsbiologicalfunction.ThisstudyusedShandonggingerasthematerial,clonedthefull-lengthcDNAsequenceofZoNAC3throughPCRtechnology,andsystematicallyanalyzedthephysicochemicalproperties,structuralcharacteristics,andevolutionaryrelationshipsofitsencodedproteinusingbioinformaticsmethods.ItwasfoundthattheCDSregionofZoNAC3is1138bplong,encoding378aminoacids.Theencodedproteinhasamolecularweightof43.28kDaandanisoelectricpointof4.51.Thesecondarystructureoftheproteinisirregularlycoiledandisahydrophilic,nonsecretory,andnontransmembraneprotein.Therearenosignalpeptidesandfourpotentialglycosylationmodificationsites.Meanwhile,itcontainstypicalconserveddomainsoftheNACfamily(A/B/Csubdomains).ThephylogenetictreeindicatesthatZoNAC3ismostcloselyrelatedtothepseudoonionproteinoftheAsparagaceaefamily.ThisstudyrevealsthemolecularcharacteristicsofZoNAC3,providingatheoreticalbasisforanalyzingthefunctionofgingerNACgeneandlayingthefoundationfortargetedgeneticmodificationofginger.Keywords:Ginger;ZoNAC3;Genecloning;Bioinformaticsanalysis引言生姜（ZingiberofficinaleRoscoe）属于姜科姜属多年生宿根草本植物，作为重要的药食同源物种，其根茎因富含姜辣素等活性成分而著称，具有独特的辛辣风味与温中散寒的药用特性，在调味品领域占据重要地位[1]。此外，其药用价值也不可低估，能有效促进血液循环，还具有提升免疫力、抗肿瘤、延缓衰老等功效[2]。因此，生姜作为我国传统的乡土特色蔬菜和中药材，已发展成为乡村振兴特色高效产业的优势作物[3]。姜瘟病是由青枯雷尔氏菌引发的植物病害，其典型病理特征表现为：叶片迅速黄化枯萎，根茎发生组织坏死并伴随恶臭性腐败，最终仅残存维管束组织构成的中空表皮。目前农业生产中针对该病原菌的防治手段收效甚微，常规措施难以有效阻断其扩散蔓延[4]。故姜瘟病频发严重阻碍生姜产业的可持续发展，成为亟待攻克的难题。NAC转录因子是植物特有的一类调控蛋白，其名称源于矮牵牛（NAM）、拟南芥（ATAF1/2）和（CUC2）三个奠基基因的首字母缩写[5-6]。NAC转录因子家族作为植物特有的调控因子，其编码基因广泛存在于苔藓植物至双子叶植物的基因组序列中。近期研究进一步揭示，NAC转录因子通过激活病程相关蛋白基因表达、调控木质素生物合成等机制，在植物先天免疫系统中发挥核心防御功能。系统进化分析显示其功能分化与植物抗病机制的进化密切相关，例如：NAC家族成员OsNAC6展现出多效性调控特征，其过表达不仅能显著增强植株对高盐、干旱等非生物胁迫的耐受能力，还可通过激活抗病相关信号通路提升对枯萎病的抗性[7]。在小麦抗病体系中，TaNAC4[8]与TaNAC8[9]作为转录调控因子，通过特异性结合条纹病菌诱导的启动子元件，在宿主抵御大麦条纹花叶病毒侵染过程中发挥核心调控功能。值得注意的是，部分NAC基因呈现抗病负调控特性，如拟南芥ATAF2的过量表达会抑制病程相关蛋白的合成，削弱植株对土传病原菌的免疫识别能力，导致感病率显著升高[10-12]。本研究以山东大姜为材料，通过PCR技术克隆ZoNAC3基因全长序列，结合生物信息学方法分析其编码蛋白的理化性质、结构域特征及系统进化关系，为进一步解析生姜NAC转录因子的功能及其在抗病方面的作用提供理论依据，为生姜分子育种及抗性改良奠定基础。材料方法试验材料本试验所使用的主要试验材料：山东大姜试验试剂主要试验试剂：液氮；氯仿；琼脂粉；异丙醇；75%乙醇；Trizol试剂；分子Marker；RNA提取试剂盒；RNA逆转录酶试剂盒；植物反转录试剂盒；高保真DNA聚合酶。实验仪器本试验所使用的主要试验仪器如表1所示:表1试验仪器Table1Experimentalinstruments仪器名称仪器型号台式高速冷冻离心机H3-16KR电泳槽Eco-Mini离心机SMC-5000F电热恒温水槽DK-8AX紫外可见分光光度计UPT200梯度PCR仪Veriti96ThermalCycler全自动雪花制冰机IMS-20小型台式摇床ES-60纯水系统Elix5凝胶成像系统UVsolotouch超净工作台SW-CJ-2D型暗箱三用紫外分析仪ZF-20D电子天平LQ-A5003实验方法1、样本裂解处理。取50-100mg植物样本经液氮速冻后快速研磨成粉末（或直接在裂解液中匀浆），立即转移至含1mL总RNA提取试剂的离心管。手动振摇20秒使充分混匀，室温静置裂解5分钟。4℃条件下12000×g离心5分钟，收集上清液至新管。按1:0.2体积比加入氯仿，混匀15秒，常温静置3分钟待分层。2、相分离纯化。低温离心，条件为4℃,12000rpm,10min，离心后体系形成三层结构。精准吸取上层透明水相至洁净离心管，注意避开中间蛋白层与下层有机相。3、核酸沉淀。加入与水相等体积的异丙醇混匀，4℃高速离心（12000rpm）10分钟，可见管壁及底部形成RNA胶状沉淀。4、沉淀洗涤。弃上清后加入预冷75%乙醇（按1mL初始裂解液对应1mL乙醇），轻柔颠倒清洗沉淀。重复4℃高速离心（12000rpm）5分钟。移除液体时保留沉淀，必要时进行瞬时离心以确保完全去除残留液体。5、沉淀干燥。室温空气干燥3-5分钟至半透明状，加入30-100μL无酶水溶解。溶解后样本需立即使用或-80℃冻存。6、质量检测。采用琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，配合紫外分光光度计测定浓度及OD260/280比值评估纯度。注：以上所有操作需在RNase-free环境下进行，转移液体时特别注意避免交叉污染。cDNA合成。将提取的RNA样本与逆转录试剂盒组分反应，合成互补DNA产物作为PCR模板。PCR扩增。配制20μL反应体系：1μLcDNA模板、各1μL上下游引物、10μL2×Taq酶预混液，ddH2O补足体积。设置程序：94℃预变性3min；35轮循环（94℃15s，61℃15s，72℃15s）；72℃终延伸3min。电泳验证。取PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统比对条带长度与ZoNAC2基因编码区预期大小。目的片段回收。紫外灯下精准切取目标条带对应凝胶，采用DNA胶回收试剂盒纯化扩增产物。11、构建连接体系。取胶回收纯化的PCR产物4μL与pSWE-TopoZero通用载体1μL混合，配制5μL标准连接体系。12、连接反应。将混合液在20-37℃环境静置5-10分钟完成重组连接，随后置于冰上暂存。13、感受态转化。取3μL连接产物与25μL克隆感受态细胞轻柔混匀，冰中孵育30分钟促进DNA吸附。14、热激处理。立即将混合液转移至42℃水浴处理45秒，迅速放回冰上维持2-3分钟。15、复苏培养。向转化体系加入200μL无菌LB液体培养基，37℃摇床（200rpm）复苏培养60分钟。16、平板筛选。取全部复苏菌液均匀涂布于对应抗性平板，倒置培养皿于37℃恒温箱培养12-16小时。17、阳性鉴定。挑取单克隆菌落进行PCR初筛，选取扩增产物条带符合预期的样本送交测序验证。结果与分析3.1ZoNAC3的克隆及其表达分析根据从生姜转录组中筛选得到的ZoNAC3CDS序列，设计特异性引物。以生姜根茎的cDNA为模板，扩增得到全长为1320bp的ZoNAC3cDNA序列，全长扩增的电泳图见图（1-1）。图1-1ZoNAC3全长扩增电泳图Fig.1-1ZoNAC3full-lengthamplifiedelectrophoresis3.2ZoNAC3的生物信息学分析3.2.1ZoNAC3编码蛋白质的理化性质分析基于ProtParam生物信息学平台对生姜ZoNAC3蛋白进行理化特征解析（表2-1）。数据显示该蛋白由1946个碳原子、2934个氢原子、486个氮原子、612个氧原子及11个硫原子构成典型大分子结构（C1946H2934N486O612S11），其理论分子量为43.28kDa等电点为4.51，小于7，说明多生姜NAC3蛋白是一种酸性蛋白质，平均亲水值为-0.572，说明ZoNAC3属于亲水性蛋白。ZoNAC3蛋白内含有20种常见氨基酸，其中谷氨酸（Glu）含量最高，占总量的9.3%，其次为丝氨酸（Ser）和亮氨酸（Leu），含量分别为9.0%和8.5%，含量最低的为半胱氨酸（Cys），占0.8%。表2-1ZoNAC3编码蛋白质的基本理化性质表Tab.2-1basicphysicalandchemicalpropertiesofZoNAC3名称Name分子质量/KDaMolecularweight理论等电点Isoelectricpoint氨基酸数量Numberofaminoacids正电荷残基数/个Positivechargeresiduenumbers负电荷残基数/个Negativechargeresiduenumber不稳定系数Instabilitycoefficient脂肪系数Fatfactor总平均亲水性HydrophilicityZoNAC343.284.51378356543.1369.63-0.5723.2.2ZoNAC3编码蛋白质的二级结构及三级结构分析基于SOPMA生物信息学平台对ZoNAC3蛋白进行的二级结构建模分析（图2-2）表明，该蛋白具有典型转录因子的结构特征：α-螺旋（6.08%）、延伸链（10.05%）及无规则卷曲（83.86%）的组成模式。基于SwissModel生物信息学平台预测其三级结构，结果如图2-3所示，覆盖率为53.9%，GMQE值为0.27，QMEAN为0.63±0.05，预测结构具有明显的折叠层次，可以从蛋的三维模型中清晰地看到螺旋和片层结构。图2-2ZoNAC3编码蛋白质的二级结构预测图Fig.2-2PredictionofsecondarystructureofproteinencodedbyZoNAC3图2-3ZoNAC3编码蛋白质的三级结构预测图Fig.2-3TertiarystructurepredictiondiagramofproteinencodedbyZoNAC33.2.3ZoNAC3编码蛋白质的疏水性分析基于Protscale生物信息学平台对ZoNAC3蛋白进行的疏水性分析（图2-4）显示：其N端形成典型疏水结构域，而C端呈现显著亲水特征。全序列分析发现，A175残基具有最大亲水性（指数-4.5），A229残基则具有最强疏水性（指数+4.5）。值得注意的是，全序列中大部分氨基酸残基亲水指数≤-1.0，证实其属于典型亲水性可溶蛋白。图2-4ZoNAC3编码蛋白质的疏水性预测图Fig.2-4HydrophobicitypredictiondiagramofproteinencodedbyZoNAC33.2.4ZoNAC3编码蛋白质的磷酸化位点分析基于NetPhos3.1生物信息学平台对ZoNAC3蛋白进行磷酸化位点分析（图2-5），结果发现ZoNAC3共有57个磷酸化位点，其中丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点分别为29、18和10个，这些位点具有与磷酸基团结合并传递磷酸基团的作用。图2-5ZoNAC3编码蛋白质的磷酸化位点预测图Fig.2-5PredictionmapofphosphorylationsitesofZoNAC3-encodedprotein3.2.5ZoNAC3编码蛋白质的糖基化位点分析基于NetNGlyc1.0生物信息学平台对ZoNAC3蛋白进行的糖基化修饰位点预测分析（图2-6）显示，该蛋白在进化过程中保留了4个潜在的糖基化修饰位点，分别位于：A76、A101、A259和A287。图2-6ZoNAC3编码蛋白质的糖基化位点预测图Fig.2-6PredictionmapofglycosylationsitesofproteinencodedbyZoNAC33.2.6ZoNAC3编码蛋白质的信号肽预测分析基于SignalP-5.0生物信息学平台对ZoNAC3蛋白进行信号肽预测分析（图2-7）显示：ZoNAC3为非分泌性蛋白，不存在信号肽。图2-7ZoNAC3编码蛋白质的信号肽预测图Fig.2-7PredictionmapofsignalpeptideofproteinencodedbyZoNAC33.2.7ZoNAC3编码蛋白质的跨膜结构预测分析基于TMHMM生物信息学平台对ZoNAC3蛋白进行跨膜结构预测分析（图2-8）显示：ZoNAC3蛋白属于非跨膜蛋白。图2-8ZoNAC3编码蛋白质的跨膜结构域预测图Fig.2-8PredictiondiagramoftransmembranedomainofproteinencodedbyZoNAC33.2.8ZoNAC3编码蛋白质的保守基序分析生姜与其他物种拥有同样的17个保守基序（图2-9），表明较为保守。图2-9ZoNAC3编码蛋白质的保守基序分析图Fig.2-9ConservativemotifanalysisofproteinencodedbyZoNAC33.2.9ZoNAC3编码蛋白质的氨基酸比对分析为了研究ZoNAC3及其编码蛋白与其他植物的进化关系，在NCBI上查找相关序列并用DNAMAN8.0进行比对（图2-10），发现其与天冬门科的假海葱（Albucabracteata）相似性达到77.33%。图2-10生姜和其他植物NAC编码蛋白质的氨基酸序列比较Fig.2-10ComparisonofaminoacidsequencesofNAC-encodedproteinsingingerandotherplants3.2.10ZoNAC3编码蛋白质的基因进化树分析利用MEGAX10.1软件与生姜与芦苇（Phragmitesaustralis）、芦笋（Asparagusofficinalis）、假海葱（Albucabracteata）等17个物种进行进化树分析（图2-11），表明ZoNAC3蛋白与假海葱（Albucabracteata）的亲缘关系较近。图2-11不同植物来源NAC编码蛋白质的氨基酸序列的系统进化树Fig.2-11PhylogenetictreeofANCaminoacidsequencesfromdifferentplantsources4讨论与结论4.1讨论NAC转录因子作为一类高度多样化且结构复杂的转录因子家族成员，广泛分布于高等植物基因组中。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，科研人员已成功鉴定并分离出大量NAC转录因子成员。它们对于植物的生长发育、代谢、信号传递以及对病原物的防御反应都有重要的作用[13]，但是关于生姜NAC转录因子的研究仍处于初步水平。本研究发现，ZoNAC3蛋白与天门冬科假海葱的亲缘关系较近，NAC蛋白相似性高达77.33%。基于最大似然法（ML）构建的跨物种系统发育树（含生姜72个NAC成员及拟南芥全家族代表序列）显示，姜科NAC转录因子可划分为13个亚族，其分类格局与双子叶植物葡萄(16个亚族)、番茄（12亚族）及单子叶作物水稻（18亚族）的亚家族分布模式呈现显著保守性，说明NAC转录因子在不同的物种中具有相似的进化过程[14]。对生姜ZoNAC3转录因子的理化性质、二级结构、三级结构以及保守基序进行预测分析,结果显示其理化特性、二级结构中的无规则卷曲、三级结构中蛋白质折叠的三维空间构象均具有较高的保守性,说明NAC类转录因子的结构具有保守性。深入研究NAC转录因子的功能机制，不仅有助于阐明生姜抗病分子机理，还可为开发新型抗病育种策略提供理论依据。通过基因编辑等技术手段调控NAC转录因子的表达，有望培育出抗姜瘟病的优质生姜品种，这对实现生姜产业的可持续发展具有重要意义。4.2结论本研究成功克隆ZoNAC3转录因子CDS序列，片段长度为1138bp，由20种氨基酸组成，编码378个氨基酸。疏水性分析表明，ZoNAC3蛋白属于弱酸性亲水性蛋白，还属于非分泌性蛋白，不存在信号肽和跨膜结构，二级结构以无规则卷曲为主，包含α-螺旋和延伸链，三级结构具有明显的折叠层次，可以从蛋白质的三维模型中清晰地看到螺旋和片层结构。ZoNAC3蛋白具有典型的NAC家族保守结构域，利用MEGAX10.1软件制作的系统进化树显示ZoNAC3及其编码蛋白与天冬门科的假海葱（Albucabracteata）相似性达到77.33%。本研究结果丰富了ZoNAC3转录因子生物信息学资料，为进一步研究解决姜瘟病提供参考。参考文献吴嘉斓,王笑园,王坤立,等.生姜营养价值及药理作用研究进展[J].食品工业,2019,40(2):237-240.刘小岑,吴艳碧,田野,等.干旱胁迫对不同品种生姜苗期生长发育的影响[J].南京农业大学学报,2024,47(5):843-853.周弦,杨培华,马慧慧,等.SiNPs处理对凤头姜仔姜贮藏保鲜品质的影响[J].西南大学学报(自然科学版),2024,46(9):65-73.邱正明,矫振彪,郭凤领,等.姜瘟病研究进展和防治策略探讨[J].中国果菜,2015,35(10):70-74.SouerE,vanHouwelingenA,KloosD,etal.ThenoapicalmeristemgeneofPetuniaisrequiredforpatternformationinembryosandflowersandisexpressedatmeristemandprimordiaboundaries[J].Cell,1996,85(2):159-170.OlsenAN,ErnstHA,LeggioLL,etal.NACtranscriptionfactors:structurallydistinct,functionallydiverse[J].TrendsPlantSci,2005,10(2):79-87.ZhengX,ChenB,LuG,HanB.OverexpressionofaNACtranscriptionfactorenhancesricedroughtandsalttolerance[J].BiochemBiophysRESCommun,2009,379(4):985-989.NakashimaK,TakasakiH,MizoiJ,ShinozakiK,Yamaguchi-ShinozakiK.NACtranscriptionfactorsinplantabioticstressresponses[J].PlantGeneRegulationinResponsetoAbioticStress,2012,1819(2):9