丝网印刷电极在生物检测中的研究进展

1丝网印刷电极在生物检测中的研究进展摘要丝网印刷电极是一种新兴的集成电极，凭借其成本低廉、易于批量制作以及方便修饰等显著优势，在众多领域展现出较高的应用价值。在修饰材料方面，碳基材料如石墨烯、碳纳米管，以及其他多种材料被广泛用于对丝网印刷电极进行修饰，以提升其性能；在检测对象上，从生物领域的酶、抗体、适体，到其他各类物质，丝网印刷电极均发挥着重要作用。本文系统地从丝网印刷电极的修饰材料、检测对象这两个关键维度出发，深入其制备工艺的原理、流程及发展现状。并从创新的角度出发对丝网印刷电极进行改进，试图从一定程度上降低成本，提高质量水平，为便携式生物检测的开展做出贡献。关键词丝网印刷电极，生物检测，电化学传感器，生物传感器，电极修饰2Applicationoftwo-dimensionalmaterialsinbiosensingAbstractScreen-printedelectrodesareemergingintegratedelectrodes.Withtheirremarkableadvantagessuchaslowcost,easymassproduction,andconvenientmodification,SPEshavedemonstratedhighapplicationvalueinnumerousfields.Intermsofmodificationmaterials,carbon-basedmaterialslikegrapheneandcarbonnanotubes,alongwithavarietyofothersubstances,arewidelyemployedtomodifySPEs,aimingtoenhancetheirperformance.Regardingdetectiontargets,SPEsplayacrucialroleindetectingsubstancesrangingfromenzymes,antibodies,andaptamersinthebiologicalfieldtovariousothermaterials.ThispapersystematicallyexplorestheSPEsfromtwokeyaspects:modificationmaterialsanddetectiontargets,delvingintotheprinciples,processes,andcurrentdevelopmentstatusoftheirpreparationtechniques.Moreover,fromaninnovativeperspective,improvementsaremadetoSPEs,attemptingtoreducecostsandimprovequalitytoacertainextent,thuscontributingtothedevelopmentofportablebiologicaldetection.KeywordsScreen-printedElectrode,BiologicalDetection,ElectrochemicalSensor,Biosensor,ElectrodeModification绪论丝网印刷电极工作原理丝网印刷电极（SPE）是极具产业化前景的电化学传感平台，凭借低成本、易规模化生产的优势，在传感领域崭露头角REF_Ref4943\r\h[1]。它的工作原理如REF_Ref6618\h图1所示，基于经典的电化学检测机制，通过电极表面发生的特异性氧化还原反应，将目标分析物的化学信号转换为可定量测量的电信号REF_Ref3707\r\h[2]。图SEQ图\*ARABIC1丝网印刷电极工作原理这一转换过程涉及到了三个关键环节。第一是界面识别反应的起始阶段：待测的目标分析物，比如葡萄糖分子，会逐渐扩散至工作电极表面，与提前修饰好的识别元件——葡萄糖氧化酶，发生特异性结合反应。以葡萄糖检测REF_Ref5618\r\h[3]。过程来说，葡萄糖氧化酶会发挥催化作用，促使葡萄糖发生氧化反应，生成过氧化氢；在这个关键的生化反应过程当中，会伴随着电子的转移，为电信号转换奠定了基础。第二个是信号转换环节：在反应过程中产生过氧化氢，在工作电极表面发生电化学氧化，反应过程中释放出的电子通过电极材料导入外电路，最终形成电流信号；在此过程中，电子的转移效率和检测的灵敏度有着直接关系，影响着检测结果的准确性；另外，电极表面设计有特殊的纳米结构，如多孔碳材料有着非常丰富的孔隙，这样就大大增加了有效反应面积，极大的提高了电子转移效率REF_Ref6255\r\h[4]，从而也使传感器对目标分析物的响应更加敏感。第三个是信号输出环节：外电路对过程中产生的电流信号进行准确检测，其强度是和目标物浓度呈稳定的比例关系，为获得更加精准的检测数据，通常会采用差分脉冲伏安法REF_Ref6690\r\h[5]和计时安培法REF_Ref6977\r\h[6]等专业技术手段，就像一双“电子眼睛”一样能够捕捉到非常微弱的变化，实现精准信号的采集，在这种情况下，运用相关先进检测技术SPE传感器就可以对目标物进行检测，即使是极其微量的目标物质也能够被精准的识别和检测到。在SPE检测体系内整体过程存在分子识别—电子转移—信号输出级联放大现象，在分子层面分子识别发生后，会诱发电子转移行为产生小的电信号经由导线等途径传递至整个电路，最后经简单变换形成明显的电信号。另外，电极表面特殊修饰结构能大幅提高反应活性和提升电子传导速度(如均匀修饰上纳米金REF_Ref9527\r\h[7])，能大幅度提升检测灵敏度，实际证明该类修饰后的SPE电极检测灵敏度较传统电极REF_Ref9883\r\h[8]提高了2～3个数量级。高效精准的信号转化方式正是SPE能实现高精、高灵敏度检测的原因所在，并且还有很好的适应性、分析能力强等优点。丝网印刷电极的设计与制造丝网印刷技术被视为厚膜技术的一个分支，其历史可追溯至中国宋代REF_Ref10367\r\h[9]，并在中国长城的建造以及古埃及布料REF_Ref15137\r\h[10]中有所体现。近几年，采用丝网印刷技术来生产“厚膜”印刷电子电路得到发展，除丝网印刷以外，印刷传感器也可以用其他方法来制造，比如：光刻、喷墨打印。最近，胡竟志等人REF_Ref20130\r\h[11]利用三维（3D）打印技术（快速原型制作）制备电极代替传统电极，以及凹版印刷REF_Ref10788\r\h[12]的方法已被应用到印刷传感器的生产中。此种方法可以满足传感器大批量生产的需要，并有利于降低检测装置的成本，有利于检测新兴污染物REF_Ref11180\r\h[13]。从20世纪90年代以来，源于微电子行业的丝网印刷技术使得SPE可以用来作为批量生产的、低成本、高重复性、可靠的传感器信号转换元件REF_Ref11372\r\h[14]。采用丝网印刷技术不仅可以印制不同的几何形状REF_Ref11830\r\h[15]的工作电极，而且还可以同时制备出对电极和参比电极，并且可以用含有各种不同催化剂、介质或者其他物质的油墨对其进行改性。该技术促进了低成本电化学传感器的制造，可以一次性使用，带来了经济和实际的好处。一般的SPE丝网印刷制备方法是把浆状的特种墨水通过一定的尺寸和形状的图案化的模板或者丝网的网孔印在平面上基底材料REF_Ref12411\r\h[16]上，而墨水浆料主要成分有石墨、碳、金、银或铂等导电物质，以及辅以粘合剂、聚合物、增塑剂、溶剂等辅助物质，有时还会加入一些像金属、金属氧化物、酶、离子交换树脂等具有功能性的添加剂REF_Ref26125\r\h[17]。在印刷的过程中油墨通过刮刀被挤压穿出网版的开口并在基底表面上形成预先设定的图形，随后将网版从基底表面拿开，油墨就会留下一个只存在于选定区域内的完整版型，其电极层的厚度一般处于10～20μm之间；在印刷后需要在适当的温度(例如：60℃)下干燥30～60min后才能成为电极REF_Ref13439\r\h[18]，在适宜的应用条件下这些电极可用于上述两种方式制备传感器，而且能在已获得的基底上反复进行该种方式的印刷来完成更多的传感器，或是形成更多的可重复使用的器件。目前，几乎所有类型的碳材料，如炭黑（包括活化炭黑）、碳纳米管、石墨烯及富勒烯等，均已成功应用于丝网印刷工艺。丝网印刷技术之所以备受青睐，主要归因于三大特性：(1)可精确控制电极面积、厚度及成分；(2)实验结果具有高度重复性，并可通过统计验证；(3)适用材料广泛，生物相容性材料（如碳材料、金属纳米颗粒、聚合物等）均可纳入印刷体系。SPE的结构演变经历了从简单到复杂的发展过程。最初的SPE采用单层碳浆印刷结构，功能是相对单一的。随着应用需求不断地提高，逐渐发展成为包含工作电极（WE）、参比电极（RE）和辅助电极（AE）的体系，各电极与对应的引线相连，以此组成经典的电化学三电极体系结构REF_Ref28950\r\h[19]，如下REF_Ref10364\h图2所示。图SEQ图\*ARABIC2电化学三电极体系通常，在电化学测量（电分析）中，会测量电位(E)、电流(i)、电荷(Q)及时间(t)的一个或几个。常用的伏安法和安培法就是电分析的一种手段，通过测量电活性物质(氧化态或还原态)的氧化状态的变化(电流)来检测不同的分析物，该变化量与分析物的浓度REF_Ref29616\r\h[20]呈正比。上述参数的不同组合方式绘图分析可以获得多种有用的信息。SPE具有广泛的功能性，SPE可作为各种类型的电化学分析系统的元件之一：(1)采用安培法REF_Ref21057\r\h[21],通过检测输出电流的变化实现电化学检测;(2)采用伏安法：①采用差分脉冲伏安法（DPV）REF_Ref30694\r\h[22];②采用方波伏安法（SWV）REF_Ref30529\r\h[23];③采用循环伏安法（CV）;④采用线性扫描伏安法（LSV）REF_Ref30568\r\h[24];⑤采用电位法REF_Ref31948\r\h[25]；(3)阻抗谱法REF_Ref31971\r\h[26]。待测分析物本身就是一个可以接受电子或者释放电子的主体，可以在工作电极上发生氧化或者还原反应，这些方法都可以根据待测分析物和工作电极的氧化还原电位来确定工作电位，通过生成与样品化合物浓度成正比的可读信号REF_Ref30676\r\h[27]来进一步探究他们的电化学行为。丝网印刷电极的电化学生物传感应用化学传感器是一种独立的设备，能够提供关于测试样品中化学物质浓度的实时分析信息REF_Ref31015\r\h[28]。化学传感器主要由两部分组成：一部分通过与分析物相互作用进行识别，另一部分用于将这种相互作用转化为可读信号REF_Ref31015\r\h[28]，即转导。识别或传感元件必须对目标分析物敏感且具有特异性，它由不同的单元组成，这些单元被称为识别受体。在电化学传感器和生物传感器的各个类别中，已经报道了利用各种换能器和检测技术的多种策略。电化学传感器被视为生物医学、制药和环境应用领域中现场、原位监测和即时检测的理想选择，它无需常规分析测量中的预处理和清洗步骤REF_Ref31045\r\h[29]。电化学生物传感器是一种独立的集成设备，它能够利用与电化学转换元件REF_Ref31015\r\h[28]直接空间接触的生物识别元件（例如蛋白质、细胞、抗体、组织、核酸、酶或受体等）提供特定的定量或半定量分析信息。从电位法、安培法、电导法、阻抗法到场效应法等多种电化学技术已来测定各种类型的分析物REF_Ref31015\r\h[28]，进而得到数据来进行分析，如REF_Ref19109\h图3所示。生物传感器市场正在迅速增长，特别是血糖传感器，2018年其收入达到128亿美元REF_Ref21839\r\h[30]，这表明SPE在电化学设备中的可行性。SPE提供了一种直接测量各种分析物的方法，例如使用伏安法测定重金属REF_Ref1492\r\h[31]、乳酸、葡萄糖REF_Ref1515\r\h[32]等。理想的基于SPE的化学传感器应具有以下特性：（i）价格低廉；（ii）便于携带；（iii）操作简单有良好的选择性，并且可以为所需分析物产生可量化的信号输出。为满足快速现场分析的需求，作为传统电极的替代方案REF_Ref23527\r\h[33]，此类传感器的研发工作仍在持续推进中。图SEQ图\*ARABIC3电化学生物传感器工作流程

丝网印刷电极的修饰材料材料概述不同的SPE，使用各种材料如酶和纳米材料进行了改性。为了对目标分析物有良好的选择性，研究人员通常会用特定的材料来修饰SPE。负载生物受体的纳米材料可以提高传感器的检测灵敏度，也可以改善传感器的选择性，解决信号非特异性的传感问题，常见的修饰材料包括：碳基材料、金属及金属氧化物材料、纳米复合材料等。电化学预处理丝网印刷电极电化学预处理的SPE已被提出，用于提高对多种分析物的灵敏度。SPE预处理采用电化学或其他手段进行，例如用溶液浸泡处理的方法，这些溶液可以在丝网印刷后将残留于表面的副产物如黏结剂及溶剂溶解。一般用内球-外球氧化还原体系来对比进行预处理和非预处理的丝网印刷碳电极的电子转移REF_Ref12288\r\h[34]/电荷电阻转移。这些预处理方法主要是用来改善电极表面REF_Ref1891\r\h[35]，提高电极活性，也就是所谓的活化。但是它们也能改变电极边缘平面上的活性，相比于没有预处理过的电极边缘平面，处理过后的SPE具有边缘平面和基面不同的表现，并且前者对于生物分子更加灵敏。Raymundo-Pereira等人REF_Ref17182\r\h[36]通过循环伏安法在0.5M硫酸中以100mV的电位范围在-2.5V和2.5V进行了丝网印刷碳电极的简单电化学预处理（两次扫描），用于传感器测定新兴污染物；同时检测自来水中的雌二醇（E2）、对苯二酚（HQ）和对乙酰氨基酚（PARA），检测限分别为185、218和888nM，在0.5至10.0mM的线性范围内。该研究结果与HPLC进行了比较，证明了预处理传感器作为经济、快速且灵敏的环境监测方法的有效性REF_Ref14035\r\h[37]。在肿瘤标志物检测方面，通过预处理增强电极与适配体或抗体的结合能力REF_Ref4321\r\h[38]，显著提高了检测的特异性，在复杂生物样本检测中表现出可靠的分辨能力。碳基丝网印刷电极石墨烯丝网印刷电极基于碳的纳米材料已广泛地用于构建各类型传感器的平台工作电极。在该方面，尤其是在生物电化学中，对于将石墨烯、碳纳米管REF_Ref7756\r\h[39]、介孔碳、碳纳米纤维或碳纳米球等材料修饰于SPE上使得电极具有较好的电催化活性及优异的检测性能都进行了相关的研究与探索。石墨烯REF_Ref30174\r\h[40]凭借巨大的比表面积与优异的导电性能，成为理想的电极改性材料，能够显著加快目标分析物与电极间的电子转移速率。在环境与生物样本中重金属离子检测领域，碳基SPE展现出独特优势。科研人员基于碳基纳米材料对SPE进行改性，开发出两类用于重金属离子痕量检测的电化学传感器REF_Ref14450\r\h[41]。具体而言，其一，采用还原氧化石墨烯（rGO）和Nafion溶液修饰，并原位沉积汞膜制得Hg/Nafion/rGO/SPE电极，用于Cu(Ⅱ)痕量检测；其二，将羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH）与rGO复合，结合Nafion溶液修饰并原位沉积铋膜，构建Bi/Nafion/rGO-MWCNTs-COOH/SPE电极，实现Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)的同时检测。两类电极的检测性能数据如REF_Ref30302\h表1所示：表SEQ表\*ARABIC1电极检测数据重金属离子种类用于检测的碳基丝网印刷电极检测限（μg/L）线性范围（μg/L）Cu(Ⅱ)Hg/Nafion/rGO/SPE改性电极0.08210～100Pb(Ⅱ)Bi/Nafion/rGO-MWCNTs-COOH/SPE改性电极0.16310～100Cd(Ⅱ)Bi/Nafion/rGO-MWCNTs-COOH/SPE改性电极0.05610～100从这些实验数据可知，其检测限可以达到μg/L甚至更低，能够对环境以及生物样本中痕量重金属离子进行精确检测；其次，在10-100μg/L范围具有良好的线性关系，保证了重金属离子检测结果的准确性；同时，检测无需复杂前处理与大型设备，操作简便、成本低廉，适合现场快速检测与基层推广；再者，可以根据选择不同的碳基纳米材料和修饰方法来检测特定的重金属离子，也可以针对某种成分复杂样液中的多重重金属离子选择不同的修饰方法来进行选择性的检测，较为灵活。传染性疾病严重威胁人类社会，早期快速检测是防控关键。基于石墨烯修饰的SPE在病毒检测领域REF_Ref19084\r\h[42]取得突破：在新冠病毒检测方面，张欣采用垂直石墨烯丝网刷电极，其工作原理如图所示，通过阴极氧化和滴涂法将碳纳米管与二氧化钛（TiO₂）、水溶性阳离子聚电解质聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)依次修饰，构建双链识别界面。利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增后样本双链核酸的浓度差异，在电极表面PDDA-TiO₂复合物吸附核酸，电活性物质苏木精特异性结合双链引发信号变化，阴性样品不含有核酸链，无法将苏木精固定到电极表面，电化学信号较小。整个过程仅6分钟即可完成2000copies/mL样本检测，信噪比达4.726，有效区分阴阳样本，为病毒快速检测提供高效方案。图SEQ图\*ARABIC4基于双链识别界面传感器检测新冠病毒实际样品示意图碳纳米管基丝网印刷电极作为拥有较好表面修饰性和电学特性的经典电极改性剂，碳纳米管(CNT)可以增加传感设计中多种分析物的电催化活性REF_Ref31278\r\h[43]。CNT的长径比大且具有较好的电学性能和力学性能，将CNT修饰到SPE表面后，会形成导电网络以增强电极导电性，并且其表面缺陷REF_Ref31869\r\h[44]和活性位点REF_Ref32170\r\h[45]较多，易于进行生物分子的修饰和固定；而CNT自身具有对生物分子REF_Ref32170\r\h[45]较强的作用力，可使生物分子保持稳定的活性构象，利于生物传感器性能的提高。​其在生物检测领域应用广泛，从病原微生物快速检测，到食品中有害成分监测、环境微生物污染评估，均展现出巨大的应用潜力REF_Ref18237\r\h[46]。在生物检测方面，Ochiai及其同事利用微流控装置和经CNT修饰的SPE，开发了一种结合低样品用量和快速安培测定的雌三醇REF_Ref15537\r\h[47]测量设备。该设备在1.0-1000μM浓度范围内表现出线性响应,检出限和定量限分别为0.53μM和1.77μM。将该方法应用于商业样品中雌三醇的测定,并与分光光度法提供的结果进行比较,所得结果在95%的置信水平上一致REF_Ref15560\r\h[48]。金属及金属氧化物修饰的丝网印刷电极以金属和金属氧化物修饰电极为载体，已经有很多的研究证明，金（Au）、银（Ag）等贵金属纳米粒子具有较好的电导率和良好的生物相容性。VuQuangKhue等人REF_Ref19141\r\h[49]为了提高SPE在生物检测方面的应用，在无标记大肠杆菌O157检测中，首先制备了纳米金修饰SPE用于无标记检测大肠杆菌O157。从四个不同工作电极直径的碳丝网印刷电极(直径分别为2mm、2.5mm、3mm及3.5mm)开始，对其进行了考察，并选择了其中的一种最适宜型号即直径为3.5mm的工作电极来作为最后的选定电极，接下来用电沉积法将氯金酸(HAuCl4)修饰到碳丝网印刷电极表面。其利用了抗原-抗体间的特异性识别作用，通过该步骤能够实现在无标记情况下直接检测大肠杆菌O157。采用循环伏安法和电化学阻抗谱法表征了该电化学传感器。基于大尺寸工作电极的良好性质与纳米金的独特性质，该免疫分析方法具有非常优秀的检测性能，其检测范围为10-10⁶cfu/mL,在信噪比(S/N)=3的条件下检测下限可达15cfu/mL.除此之外，本方法用于检测大肠杆菌O157时，其特异性强、重复性好、稳定性高，是可用于食品安全领域大肠杆菌O157检测的另一种较好的方法；还可用于肿瘤标志物检测中与特异性抗体结合，通过该种方式大大提高免疫传感器对癌细胞表面抗原的捕获效率以及检测灵敏度。此外，二氧化锰（MnO₂）REF_Ref19350\r\h[50]、氧化锌（ZnO）REF_Ref19680\r\h[51]等金属氧化物具有独特的催化活性与光学性质。如二氧化锰修饰电极可加速过氧化氢的分解反应，在葡萄糖生物传感中，利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生过氧化氢，结合二氧化锰的催化作用，实现对葡萄糖浓度的快速、灵敏检测。其他材料修饰的丝网印刷电极导电聚合物修饰电极同样具有出色的生物检测性能。使用电化学聚合方法，将分子印迹聚吡咯REF_Ref19804\r\h[52]修饰于SPE表面，经由功能单体、模板分子(多巴胺)、交联剂和引发剂的协同作用在电极表面形成了能与模板分子结构互补的特异性识别位点。当采用差分脉冲伏安法检测时，多巴胺能够准确结合到该特异性识别位点处，并改变电极界面处的电子传递行为，从而引起差分脉冲伏安曲线上产生相应的特征电流响应信号，根据此特征信号的大小变化实现多巴胺含量的定量分析。以该方法构建得到的用于检测多巴胺的传感器，实现了基于多巴胺和患神经系统疾病相关疾病的检测手段的开发，促进了导电聚合物修饰电极在生物分子检测方面的应用发展。此外，纳米复合材料可以集合不同的材料优势。如：Gazze等人REF_Ref19983\r\h[53]制备的丝网印刷石墨烯纳米传感器是由聚苯胺表面沉积制成石墨烯丝网印刷电极，并与CA125抗体修饰而成，可在0.92pg／μL～15.20ng／μL浓度范围之内检测，检出下限达到0.923ng／μL,在此之前是灵敏度最高的检测方法。Du等人REF_Ref20578\r\h[54]使用量子点（QD）-纳米复合材料和碳纳米管（CNT-AuNP共轭GCE作为电化学纳米传感器，能够检测作为卵巢癌生物标记物的E-钙黏蛋白的显著变化。夏勇等人REF_Ref12587\r\h[55]开发了一种集成便携式电化学传感器（ip-ECS），将金纳米颗粒（AuNPs）与MXene修饰的SPE结合，搭载低功耗电子系统用于血清生物标志物的临床监测。AuNPs-MXene纳米复合材料通过提供高密度活性位点、增强导电性和催化活性，显著提升了SPE的电化学性能，对模型分子尿酸和多巴胺检测限分别为1.12μM和1.11μM，检测人血清胱抑素C（CysC）在50−5000ng/mL呈线性响应，与常规方法强相关（ρ=0.9556），对妊娠期糖尿病患者进行检测，血清CysC水平显著升高，显示有早期风险预测潜力。各种材料协同作用，在检测复杂生物样本中的小分子物质时展现出卓越性能。

生物检测的丝网印刷生物传感器酶修饰的丝网印刷电极酶电极工作原理电化学酶生物传感器（又称酶电极）由于自身优势突出，在传感器中属于较为成熟且应用较多的类型之一。目前电化学酶生物传感器可以应用于健康监测、环境检测及食品分析等领域，并具有重要的影响。技术上讲，利用重组DNA技术可获得新的酶或改进已有酶的特性，使酶更容易连接到电极上，是一种极为有效的方法。随着电化学酶技术的发展，利用此法制备酶生物传感器，尤其是SPE酶生物传感器越来越方便快捷REF_Ref24035\r\h[56]。酶修饰的SPE作为酶生物传感器的重要组成部分，其核心工作原理基于酶所具备的特异性催化功能REF_Ref13365\r\h[57]。酶电极的传感元件以固定化的酶膜作为基础，把其浸没在酶传感器的测定液中，酶具有高度的专一性REF_Ref18433\r\h[58]，这种独特的性质使得它能够像“精准的钥匙”一样，选择性地识别并催化特定的底物发生化学反应，当含有目标底物的样品与酶修饰的电极表面相互接触时，在酶的催化作用下，底物会发生氧化还原反应或其他类型的化学反应，生成或者消耗电活性物质，产生电子转移现象REF_Ref19149\r\h[59]，或者导致反应产物的浓度发生变化，而这些变化都能够通过电化学检测方法进行捕捉和分析，进而实现对目标物选择性的检测。在这个基础上，通过电化学电极（金属电极、碳电极及其改性电极等），将电活性物种浓度的变化转换成电学信号（电容、电流、电势等），从而实现对于待测物的准确检测。酶电极开发历程在电化学酶生物传感器的开发历程中，大致经历如图4所示，分为三个阶段：图SEQ图\*ARABIC5电化学酶生物传感器的开发历程早期探索与第一代传感器（1960s-1980s）。20世纪60年代至80年代，电化学酶生物传感器的探索进入起步阶段。第一代传感器以氧气作为电子传递的桥梁，借助检测反应过程中氧气消耗量或过氧化氢生成量，实现电催化反应。具体而言，在有氧环境下，葡萄糖氧化酶会促使葡萄糖发生氧化反应，生成葡萄酸内酯和过氧化氢REF_Ref19596\r\h[60]，通过监测氧气减少、过氧化氢增多或酸度改变等指标，便能间接推算出葡萄糖的含量。不过，第一代传感器存在明显短板。其工作时需要较高的电势，导致抗坏血酸、尿酸等REF_Ref20412\r\h[61]具有电活性的物质容易干扰检测结果；传感器的响应信号与氧气分压、溶解氧浓度紧密相关，一旦溶解氧出现波动，电极响应就会不稳定REF_Ref20883\r\h[62]；此外，由于氧气溶解度存在上限，在缺氧环境中，传感器难以准确测定高浓度底物，而过氧化氢浓度过高时，还可能致使酶活性降低REF_Ref21160\r\h[63]。​技术改进与第二代传感器（1980s-2000s）。为弥补第一代传感器的缺陷，从20世纪80年代起，第二代介体型酶生物传感器逐步发展起来REF_Ref21608\r\h[64]。科研人员尝试用氧化还原电子媒介体替代氧气，以此搭建起酶的氧化还原活性中心与电极之间的电子传输通路，加速电子迁移，产生稳定的响应电流。其中，二茂铁REF_Ref3693\r\h[65]及其衍生物等物质，凭借良好的电化学性能，成为常用的电子媒介体。相较于第一代，第二代传感器不再依赖氧气，工作电位大幅降低，有效拓宽了响应范围，同时减少了噪声、背景电流以及外界干扰，延长了传感器的使用寿命。实践表明，使用电子媒介体后，传感器检测的准确性显著提升，对目标物质的检测下限也进一步降低。直接电子传递与第三代传感器（2000s-至今）。21世纪以来，第三代直接电化学酶传感器成为科研焦点REF_Ref23152\r\h[66]。这类传感器试图让酶与电极直接“对话”，省去氧气或人工媒介体的中转，从原理上看，这样能加快电子传递速度，让电信号更强，从而提高检测的灵敏度和精准度。但实际研发困难重重,酶分子的电活性中心藏在深处，一旦吸附到电极表面，结构容易变形，这使得电子直接转移难以达成。目前，只有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等少数几种物质REF_Ref23430\r\h[67]，能在特定电极上实现直接电催化。为解决这个问题，科学家们把精力集中在研发新型电极材料上，希望找到既通用又稳定，还能保持蛋白质活性的载体。其中，碳纳米材料因为导电性好、生物兼容性佳脱颖而出，基于它开展的功能化研究，正为第三代传感器的发展开辟新路径。丝网印刷电极在酶检测中的应用​在酶修饰的SPE用于生物检测的研究中，芳香化酶自首次提出REF_Ref32653\r\h[68]后，其修饰的SPE已广泛应用于各类生物传感分析，同时其他种类的酶也在生物检测领域发挥作用。赵芳REF_Ref172\r\h[69]采用顺序注射分析法（SIA）与丝网印刷型酶传感器联用技术，通过研究牛血清白蛋白（BSA）和戊二醛交联，结合锇聚合物（Os-PVP）将以辣根过氧化物酶（HRP）和漆酶修饰SPE酶固定于电极表面，用于环境中苯酚类有机污染物检测。实验发现，经优化条件后，漆酶修饰电极对邻苯二酚检测呈现良好线性关系，Os-PVP修饰进一步提升检测灵敏度；构建的四位点酶电极（交替固定HRP和漆酶）同样具备高灵敏度与重复性，成功应用于垃圾滤液中邻苯二酚浓度测定。该研究表明，酶修饰的SPE可实现环境污染物的快速、精准检测，展现出在生物检测领域的显著应用潜力。同时，漆酶也被用于雌激素雌二醇的检测，在检测过程中，漆酶通过催化雌二醇反应REF_Ref31541\r\h[70]，产生可检测的信号变化，为雌激素含量测定提供了一种可靠且高效的方法。抗体修饰的丝网印刷电极在各类生物传感器中，免疫传感器是目前研究报道最为广泛的一类，其核心检测机制是利用针对目标物的抗原或抗体进行特异性识别REF_Ref24769\r\h[71]。检测时，将特异性抗体固定在SPE表面REF_Ref25458\r\h[72]，当含有目标抗原的样品与电极接触时，抗原与抗体结合形成抗原-抗体复合物，导致电极表面的电化学性质发生变化，传感器主要通过标记或无标记这两种检测方法，精准测量样品中互补目标物与生物受体的结合程度。抗原-抗体结合作用具有高度特异性和选择性，而这种特异性交互过程REF_Ref25987\r\h[72]，可借助电化学、光学和质谱等分析技术实现有效测定。如电极表面电阻、电容的改变，通过检测这些参数的变化，即可实现对抗原的定性和定量分析。当前，免疫测定试剂盒已在环境污染物检测中得到大量应用，将丝网印刷生产工艺与免疫测定技术相结合REF_Ref26506\r\h[74]，能满足环境分析对于低成本、规模化生产的需求。在抗体修饰的SPE应用于生物检测的实践中，甲型H1N1流感病毒REF_Ref26692\r\h[75]的检测是极具代表性的案例。面对传统流感检测方法在时效、操作等方面的局限，林睿以一次性丝网印刷碳电极为基础，构建了电化学免疫生物传感器REF_Ref26692\r\h[75]。研究首先筛选并验证病毒样本与抗体材料，确认两者能形成稳定结合。通过对比不同修饰技术，选择了简单经济的物理吸附法固定抗体，降低成本的同时保证检测信号质量。随后，对检测条件进行优化，显著缩短了检测时间，较传统方法效率大幅提升。经测试，该传感器不仅特异性强，能准确区分不同病毒，而且检测结果可靠、稳定性好，在实际检测效果上与传统方法相当甚至更优。此外，基于该传感器开发的便携式设备，还实现了多种流感病毒的同时检测，为病原体现场快速筛查提供了新方案，充分展现了抗体修饰SPE在生物检测领域的应用潜力与价值。病毒性传染病的快速检测也是其极具价值的应用方向。以禽流感病毒REF_Ref959\r\h[76]检测为例，面对传统检测方法如病毒分离鉴定、酶联免疫吸附法操作繁琐，以及聚合酶链式反应依赖专业设备等难题，周川华REF_Ref959\r\h[76]创新开发了基于免疫磁分离与电化学检测结合的新技术。通过将高效免疫磁分离、酶催化放大和生物素-链霉亲和素系统相结合，以SPE为基础构建了新型电化学免疫传感器。通过制作可重复使用的磁性电极，免疫反应后的磁性复合物能便捷地被捕获到电极表面，获取检测信号，且经简单冲洗即可继续用于下一个样品，大大提升了检测效率。与传统金电极构建的传感器相比，这种新方法在鸡粪等复杂样品中，也能精准检测到极微量的H9N2禽流感病毒，展现出简单、快速、灵敏且特异性强的优势。为病毒性传染病的快速诊断与防控提供了强有力的技术支撑，也充分体现了该技术在生物检测领域的巨大应用潜力。​在抗体修饰的SPE用于生物检测的实际案例中，食品病原菌检测是重要的应用场景。Viswanathan等人REF_Ref29504\r\h[77]开展了相关研究，他们将抗大肠杆菌、抗弧菌和抗沙门氏菌抗体，按照1:1:1的生物效价比例，布置在经多壁碳纳米管-聚烯丙基胺修饰的SPE表面，制作出一次性电化学免疫传感器。这种传感器能同时检测牛奶中的大肠杆菌O157:H7、弯曲杆菌和沙门氏菌。检测时，电极表面的抗体就像“侦察兵”，分别特异性识别对应病原菌。一旦结合，就能转化为电信号被检测到。该传感器对沙门氏菌、弯曲杆菌的检出限均为400cells/mL，对大肠杆菌的检出限为800cells/mL，检测过程简捷快速，为食品污染因子的多重检测提供了新方案，在保障食品安全方面展现出潜在应用价值。基于适体修饰的丝网印刷电极适体是一种替代生物识别元件，通过化学方法与目标合成，因此相对于抗体、肽和酶等其他生物识别元件具有稳定性高、易于修饰、可批量生产等优势REF_Ref30095\r\h[78]。对于生物识别元件，如抗体，电化学生物传感器中的短保质期、稳定性问题和非特异性分析响应是使用适体作为替代品的一些原因REF_Ref30467\r\h[79]。适体是通过指数富集配体系统REF_Ref31032\r\h[80]进化技术（SELEX）筛选得到的单链DNA或RNA片段，能够与靶标分子发生特异性、高亲和力的结合。基于适体修饰的SPE，将适体固定在电极表面，当目标靶标分子存在时，适体与靶标分子结合，引起电极表面的构象变化或电子传递过程改变，进而导致电极的电化学信号发生变化，通过检测这些信号变化，可实现对靶标分子的检测。​​为了实现急性心肌梗死（AMI）REF_Ref3588\r\h[81]的早期临床诊断与改善患者预后，研发简单快速的现场检测器件用于心肌肌钙蛋白I（cTnI）即时检测（POCT）,具体过程如图所示。冯琳以SPE为核心，发挥其体积小、成本低、便携性强、重复性高且易功能化的特点，融合核酸适体和电化学分析技术，打造出一款便捷式电化学适体传感器。制作时，先用电沉积技术在SPE表面生成均匀的三维花状金纳米结构（AuNFs），增大电极比表面积，提升电导率与化学稳定性；再将末端标记亚甲基蓝（MB）的cTnI适体，通过Au-S键固定在电极上。检测时，若样本存在cTnI，核酸适体与之结合后构象改变，阻碍MB信号分子与电极的电子转移，使电化学信号降低。通过监测信号变化，该传感器能对10pg/mL–100ng/mL浓度的cTnI进行高灵敏检测，检测限低至8.46pg/mL，还能精准区分cTnI与其他蛋白。搭配便携式智能手机和U盘式电化学工作站，无需冲洗，10μ人血清样本就能完成检测，在POCT领域极具应用潜力。图SEQ图\*ARABIC6基于丝网印刷电极的电化学适体传感器即时检测cTnI示意图MIP型改性丝网印刷电极合成受体作为生物受体的替代品REF_Ref31032\r\h[80]已成为研究热点。其研发的核心驱动力在于降低成本、延长传感器保质期，并解决变性难题，从而使传感器能在复杂环境基质中稳定测量。分子印迹聚合物（MIP）是极具潜力的天然受体替代品之一REF_Ref4052\r\h[82]。分子印迹是一种在聚合物网络中创建具有与目标（模板）相同的形状、大小和功能基团的结合位点的技术。分子印迹技术（MIT）最早由波利亚科夫在80多年前报道REF_Ref8818\r\h[83]，如今在免疫测定、亲和分离和传感器等领域持续发挥重要作用。MIP的合成过程中，模板（目标分析物）、单体、引发剂和交联剂在溶剂里聚合，形成聚合物复合物，之后去除模板，在材料中留下特定空位，赋予聚合物类似天然受体的分子识别能力，实现对目标分析物的选择性识别。​根据分析物性质的不同，聚合反应可选择体相印迹或表面印迹等方式REF_Ref9743\r\h[84]。其中，改进的背面表面印迹技术也受到关注REF_Ref4473\r\h[85]，它能让聚合混合物在聚合物基质中均匀形成结合位点，避免模板聚集，为合成受体在生物检测中的应用提供了更优的技术路径。MIP与电化学结合生产“分子印迹电化学传感器（MIECS）”已显示出传感器性能的提升，使用不同的分析方法，如安培法、电位法、导电法和伏安法。REF_Ref12539\h图7显示了报道的各种用于分子印迹电化学传感器（MIECS）的分析方法。它允许直接和间接的氧化还原探针方法作为检测的基础。图SEQ图\*ARABIC7分子印迹电化学传感器（MIECS）的机制刘晓芳及其同事REF_Ref10863\r\h[86]开发了一种基于MIP修饰的SPE检测地西泮方法，为了检测动物源性产品中的地西泮的残留。实验装置如REF_Ref28646\h图8所示，检测时，通过USB插口将SPE与电化学分析仪相连接，将碘化钾（KI）溶于H2SO4溶液中，配成PH=2的背景溶液，加入一定量的地西泮标准溶液；接着，将组装好的SPE插入待测液中，使电极条的工作区域全部浸入检测液中；最后，搅拌，静置，采用差示脉冲法记录检测信号，分析峰电流与地西泮浓度的关系，从而实现对待测样品中地西泮含量的测定。该方法在SPE上制备和洗脱印迹膜简单易行，通过更换修饰有印迹膜的丝网印刷电极条，可实现多个样品的快速检测；且该传感器已初步应用于实际样品分析，取得了较满意的结果，在相关检测领域颇具应用潜力。图SEQ图\*ARABIC8检测装置示意图a.电化学工作站b.点击插槽c.电极条d.参比电极e.辅助电极f.分子印迹膜g.记录器h.测试池i.磁力搅拌器MIP修饰的SPE，通过创新单体选择、聚合方式和比率型检测设计，显著提升了传感器的特异性、抗干扰能力和检测准确性，在生物检测领域展现出独特优势和应用价值。

结论与未来趋势当前生物检测领域对SPE的研究十分火热REF_Ref12587\r\h[55]，从大量学术期刊和会议论文发表的创新成果就能看出。不过，通过全面检索数据库分析发现，虽然研究成果不少，但SPE在实际应用场景中覆盖范围还比较有限，目前距离大规模产业化生产和广泛推广应用，还有很长的路要走。在提高丝网印刷电化学传感器性能的研究过程中，纳米材料是重要突破口，碳纳米管REF_Ref7756\r\h[39]、金属纳米颗粒REF_Ref14696\r\h[87]、金属氧化物纳米片、离子液体等纳米材料具有独特的理化性能和优良特性，并且可以作为电极改性材料使用，同传统的丝网印刷电化学传感器相比，可以大幅度提高传感器的检测灵敏度和选择性，且提高了检测结果的稳定性、重现性，甚至部分传感器可以在某几个条件下同时检测几种分析物，极大地拓宽了检测技术的应用范围。但是Raymundo-Pereira等REF_Ref13472\r\h[87]的实验表明：经过合适预处理后的SPE，其检测灵敏度与其他采用纳米材料改性的电极并无差异。这也启示我们：对于丝网印刷电极材料配方及处理工艺需要进一步摸索。研究人员不应盲目地向电极表面填加纳米材料以期获得好的性能，而应更多考虑电极预处理的方法、注重组合材料的比例配比问题，研究电极预处理与材料搭配所起的相互配合与协同作用，从多个角度提升SPE的整体水平，更好地应用于生物检测上。为了突破SPE在生物检测方面的性能极限，急需扩大在电极修饰材料方面所使用的材料类型。由于单一材料很难达到提高电极性能的要求，所以要尝试新的多元复合材料作为电极的修饰材料。像合金材料一样，他们能将复合材料中各成分良好的组合在一起REF_Ref17100\r\h[89]，有自己独特的物理化学性质，是将单一材料无法达到的电导率、稳定性和生物相容性等问题结合起来的有效手段，拓宽提高电极灵敏度、选择性的思路。同时SPE的制作工艺也是不可或缺的，通过对材料涂覆、电极成型等核心工艺环节的优化，能有效提高电极的均匀性和检测重复性，最大限度发挥电极的性能。但是，如何改进工艺则是一个重大难题。传统电极通常用的滴涂技术不能直接用来制作SPE,SPE本身就有孔状结构，同时电极表面特性不同于一般电极，若简单地使用滴涂可能会使电极存在材料分布不均的情况，从而导致影响检测的稳定性。此外，SPE中存在的参比电极也有一定缺陷，在测量前，就出现了参比电极降解REF_Ref19278\r\h[90]的问题，使得参比电极电位发生偏移，从而影响到样品电化学氧化电位的测定。这些都会对电极性能造成一定的影响，并且对检测结果的准确性产生一定的影响。可以着眼于复合材料设计和制备工艺的创新突破，尽早建立起适合于SPE的专用技术体系，促进SPE实现高质量发展，为生物检测领域的实际应用做好准备。将纳米材料直接混入油墨制备SPE，因操作简便、实用性突出而成为热门研究方向。但这一方法想要成功，关键在于深入研究油墨配方的调整REF_Ref20535\r\h[91]，特别是精确优化各组分的比例。纳米材料和油墨混合可不是简单搅拌在一起，材料的表面特性、颗粒大小，以及和油墨基质能不能很好融合，都会极大影响电极性能。在实际使用中，就算用了这种方法，纳米材料或其他功能材料在油墨里也常常分散不均匀。这样一来，很多材料藏在内部，没法在电极表面发挥作用参与反应，最终导致传感器的灵敏度变差，选择性也跟着降低，难以达到理想的检测效果REF_Ref21257\r\h[92]。一个典型的例子是碳质纳米材料，其中边缘平面和基面对于在工作电极上形成均匀的膜至关重要REF_Ref256\r\h[93]。表面改性似乎更容易、更直接，但再现性至关重要。另一种选择是采用自动分配系统，例如Biodot，该系统可以高精度重复地精确分散等体积的材料。如果SPE要取代传统方法，需要考虑很多因素。从概念化的角度来看，就应考虑从实验室研究到现场研究的转换方案。正如梅茨等人REF_Ref22498\r\h[94]提到的，在构建SPE时，应适当考虑连续印刷工作电极的问题。真实样品很复杂，考虑到这一点，未来研究必然会聚焦于针对相关应用进行优化，并确保开发的丝网印刷电化学（生物）传感器兼具检测快速、便携和灵敏的优势。所以，基于各种纳米材料的丝网印刷电化学传感器面临着巨大的挑战。未来需要开发新型纳米材料用于制造丝网印刷电化学传感器，为生物检测提供更方便有效的工具。如果我们要看到使用SPE的“电分析的真正复兴”，则必须在数据分析过程中嵌入化学计量学等附加工具。最后，市场需求现在不仅转向设计具有良好灵敏度和特异性的传感器，而且转向设计连续、实时、免清洗、防污和免校准的传感平台REF_Ref216\r\h[95]。

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