基因治疗产品杂质研究技术指南（试行）

基因治疗产品杂质研究技术指南（试行）1总则1.1本指南旨在规范基因治疗产品的杂质研究，明确杂质研究的技术要求，保障产品的安全性、有效性和质量可控性，为基因治疗产品的研发、注册和生产提供技术指导。1.2本指南适用于各类基因治疗产品，包括病毒载体类基因治疗产品、非病毒载体类核酸产品、基因修饰细胞治疗产品、基因编辑工具产品等，涵盖体内给药和体外基因修饰的各类产品。溶瘤病毒、DNA疫苗、mRNA疫苗也可参考本指南要求。1.3杂质研究应遵循风险可控、全生命周期覆盖的原则，根据产品研发阶段、给药途径、给药剂量、适应症合理确定研究深度，优先控制高安全性风险杂质。杂质研究应符合《中华人民共和国药品管理法》、ICHQ3A、ICHQ5A、ICHQ6B等相关指导原则的要求。2杂质分类与识别基因治疗产品的杂质按来源和性质分为产品相关杂质、工艺相关杂质、外源因子与环境污染物三类，所有杂质都应进行系统识别，明确其风险等级。2.1产品相关杂质产品相关杂质指来源于目标产品，结构、组成或功能与合格产品不一致的杂质，通常与核酸复制、载体组装、细胞修饰过程中的偏差有关，是基因治疗产品特有的高风险杂质，需重点控制，主要包括：2.1.1核酸类杂质（1）序列变异杂质：指目的基因、调控序列、载体骨架序列发生的点突变、插入缺失、同源重组、重排等变异。质粒生产中大肠杆菌的复制重组、病毒载体生产中的聚合酶错配、基因编辑过程中的非同源末端连接都可能引入序列变异。若变异发生在目的基因编码区或调控核心区，可能导致异常蛋白表达、插入突变、致癌等严重风险，要求目标序列整体一致性不低于99.9%，总变异频率不高于0.1%，位于功能核心区的变异频率不高于0.05%。（2）片段与构型杂质：包括游离的核酸片段、不完整的基因组序列、质粒开环/线性化异构体、聚合质粒等。开环、线性化质粒的免疫原性更高，体内稳定性差，因此临床级注射质粒要求超螺旋构型比例不低于90%，开环、线性杂质总占比不高于10%。mRNA产品中存在的截断型mRNA、未正确加帽加尾的mRNA，属于此类杂质，要求mRNA完整率不低于90%，加帽效率不低于95%。2.1.2颗粒组装相关杂质主要见于病毒载体产品：（1）空衣壳/空心颗粒：指仅含有衣壳蛋白、未包装目标基因组的颗粒，是AAV、腺病毒生产中最常见的杂质，占比可达30%~70%。空衣壳不具有治疗活性，还会激活机体先天免疫反应，诱发肝毒性等不良反应，需严格控制。（2）伪型颗粒：指衣壳包装了非目标核酸的颗粒，常见的包装内容包括宿主细胞DNA、质粒骨架片段、辅助病毒序列等，伪型颗粒可能带来插入突变等风险，需识别并控制。（3）异常组装颗粒：包括衣壳蛋白聚集体、错配衣壳颗粒等，会增加产品免疫原性。2.1.3细胞相关杂质（基因修饰细胞产品）包括未成功基因修饰的宿主细胞、发生恶性转化的异常增殖细胞、染色体数目异常的细胞等，其中恶性转化细胞具有成瘤风险，是基因修饰细胞产品的核心控制杂质。此外，未整合的游离外源核酸、随机整合的修饰细胞也属于此类杂质。2.2工艺相关杂质工艺相关杂质指生产过程中由原材料、工艺操作引入的杂质，主要包括：2.2.1宿主细胞来源杂质指生产宿主细胞来源的宿主细胞蛋白（HCP）和宿主细胞基因组DNA（HCD），是工艺相关杂质的核心控制对象：（1）宿主细胞蛋白（HCP）：不同生产宿主（大肠杆菌、HEK293、Sf9昆虫细胞、Vero细胞等）产生的HCP组分不同，部分HCP具有免疫原性、促炎活性或酶活性，可诱发不良反应，大剂量全身给药产品中HCP残留是导致严重毒性的主要原因之一。（2）宿主细胞DNA（HCD）：残留的宿主细胞DNA存在插入突变、致癌的潜在风险，对DNA的残留量和片段大小都需要控制。2.2.2原材料与工艺添加物杂质包括生产过程中使用的工具酶（限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶、Cas9蛋白酶等）、转染试剂（PEI、脂质体、阳离子聚合物等）、筛选试剂（嘌呤霉素、G418、抗生素等）、裂解试剂（TritonX-100、NP-40等去污剂）、有机溶剂（乙醇、异丙醇、氯仿等）、色谱填料浸出物、细胞培养用添加剂、分选磁珠残留、冻存保护剂等。2.3外源因子与污染物包括生产过程中引入的外源病毒、支原体、细菌、真菌、细菌内毒素、重金属残留、清洁剂残留等，其中成瘤性生产宿主的残留完整细胞、外源逆转录病毒属于高风险杂质。3不同研发阶段杂质研究要求杂质研究应与研发阶段相匹配，逐步深入，优先控制高风险杂质：3.1早期临床研究阶段（I期）以安全性控制为核心，需完成以下研究：①识别主要安全性风险杂质，完成HCP、HCD、细菌内毒素、支原体、外源因子、复制型病毒（病毒载体产品）等关键杂质的检测与控制；②对产品相关杂质完成初步识别，初步确定杂质范围；③建立关键杂质的分析方法，拟定初步限度。对于小样本量的早期临床试验，可适当简化低风险杂质的研究深度，但核心安全杂质不得缺失。3.2确证性临床研究阶段（II~III期）需完成全面的杂质识别与研究：①完成所有潜在杂质的系统分析，建立完整的产品杂质谱；②完成所有分析方法的方法学验证，确认方法的灵敏度、特异性符合要求；③结合工艺稳定性研究，确定产品的常规杂质范围，基于安全性数据确定杂质的可控限度；④将关键杂质纳入质量标准。生产工艺放大后需重新评估杂质谱，确认工艺放大未引入新的杂质或改变现有杂质的含量。3.3上市生产阶段需维持杂质控制的稳定性，上市后工艺变更（生产场地变更、工艺优化、规模放大）应重新评估杂质谱变化：①若变更后杂质种类无新增，现有杂质含量在原限度范围内，可无需额外研究；②若引入新杂质或现有杂质含量升高超过原限度，需补充进行杂质的安全性评估，必要时调整工艺或修订限度。4杂质分析方法开发与验证4.1方法选择原则根据杂质的性质、风险等级选择合适的分析方法，高风险低含量杂质需选择高灵敏度、高特异性的方法，常见杂质的分析方法选择如下：（1）核酸类杂质：序列变异检测优先选择二代测序（NGS），NGS灵敏度可达0.01%，可检测低频率变异，必要时结合数字PCR（dPCR）对特定变异进行准确定量；质粒构型、核酸片段大小检测可采用毛细管电泳、阴离子交换色谱、脉冲场凝胶电泳；残留HCD定量可采用qPCR、PicoGreen荧光法，qPCR灵敏度可达pg级别，适用于低残留量样品。（2）病毒颗粒杂质：空衣壳定量可采用分析型超速离心（AUC）、阴离子交换色谱、沉降速率超速离心，AUC是目前空衣壳定量的金标准，准确度可达95%以上；伪型颗粒检测可采用NGS结合dPCR，分析包装核酸的序列与含量；复制型病毒检测采用细胞培养法结合qPCR，检测灵敏度需达到1个复制型颗粒/剂量。（3）工艺相关杂质：HCP定量优先采用宿主特异性ELISA试剂盒，对于高风险HCP组分可采用LC-MS/MS进行定性和定量；残留工艺添加物（去污剂、有机溶剂、抗生素等）可采用LC-MS、气相色谱进行定量；磁珠残留可采用电镜扫描或铁含量测定定量。（4）外源因子：支原体检测采用培养法或qPCR法，内毒素采用鲎试验，外源病毒筛查采用全基因组NGS结合细胞培养法。4.2方法学验证所有用于质量控制的杂质分析方法需按照《药品质量标准分析方法验证指导原则》完成验证，确认方法的特异性、精密度、准确度、线性、范围、检测限、定量限符合要求。对于高风险杂质，方法的定量限应不高于拟定限度的30%，保证准确定量，例如拟定HCD限度为5ng/剂，方法定量限应不高于1.5ng/剂。5杂质限度确定原则与要求杂质限度应基于安全性风险，结合产品特性、给药剂量、工艺能力、临床数据确定，核心要求如下：5.1宿主来源杂质（1）宿主细胞DNA（HCD）：注射用基因治疗产品要求HCD残留不高于5ng/剂，DNA片段长度不高于200bp；对于全身给药的大剂量产品（如剂量≥1×10¹³vg/kg的AAV产品），HCD残留要求不高于1ng/剂，进一步降低致癌风险。（2）宿主细胞蛋白（HCP）：常规剂量产品要求HCP残留不高于100ng/剂，大剂量全身给药产品要求HCP残留不高于10ng/剂；对于已知具有促炎、免疫原性的高风险HCP组分，需单独控制限度，要求单个高风险HCP残留不高于1ng/剂。5.2产品相关杂质（1）序列变异：总变异频率不高于0.1%，功能核心区变异频率不高于0.05%；基因编辑产品的脱靶突变要求总脱靶频率不高于0.1%，位于癌基因/抑癌基因区域的脱靶突变单个位点频率不高于0.01%。（2）病毒颗粒杂质：AAV等病毒载体产品要求空衣壳比例不高于20%，高纯度产品要求不高于10%；复制型病毒要求每剂不得检出，检测限不高于1个复制型颗粒/剂；伪型颗粒要求占比不高于5%。（3）核酸构型与完整率：注射用质粒要求超螺旋比例≥90%；mRNA要求完整率≥90%，加帽效率≥95%；基因修饰细胞产品中恶性转化细胞要求每1×10⁶个细胞中转化细胞比例不高于1个。5.3工艺相关杂质残留有机溶剂按照ICHQ3C要求控制，一类溶剂禁止使用，二类溶剂根据每日给药量控制限度；非离子去污剂（如TritonX-100）残留不高于0.01%（w/v）；筛选用抗生素残留不高于1μg/剂；DMSO（细胞冻存液）残留不高于1%（v/v）；脂质体杂质中总杂质脂质含量不高于5%，脂质过氧化物含量不高于0.1meq/kg；磁珠残留不高于1μg/剂。5.4其他杂质内毒素要求不高于0.5EU/mL或不高于5EU/剂，符合注射剂要求；支原体、外源病毒要求阴性；重金属残留符合中国药典通则要求。6不同类型产品杂质研究特殊关注点6.1病毒载体类基因治疗产品除常规杂质控制外，需重点关注：①复制型病毒（RC/RCL）杂质的检测与控制，所有携带复制相关同源序列的病毒载体必须每批检测复制型病毒，不得漏检；②整合型病毒载体的插入位点变异分析，批量评估插入突变的分布特征，评估致癌风险；③空衣壳和伪型颗粒的定量控制，大剂量全身给药产品需通过工艺优化将空衣壳占比降低至20%以下，减少免疫不良反应。6.2非病毒载体类核酸产品质粒DNA重点控制构型杂质、序列变异、内毒素残留，由于大肠杆菌生产的质粒内毒素水平通常较高，需加强内毒素去除和质控；mRNA-LNP产品重点控制截断mRNA、加帽效率、杂质脂质、脂质过氧化物残留，脂质过氧化物会诱发全身炎症反应，即使低水平也会导致不良反应，必须严格控制限度。6.3基因修饰细胞治疗产品重点控制：①脱靶编辑杂质（基因编辑产品），需采用全基因组测序识别潜在脱靶位点，对高风险脱靶位点进行定量，控制脱靶频率符合要求；②残留复制型载体杂质，控制转染用病毒载体的残留量，避免载体在体内扩散；③恶性转化细胞杂质，采用软琼脂克隆形成试验、流式细胞术或全基因组测序检测异常细胞，控制转化细胞比例在安全范围内；④生产过程添加物残留，如分选磁珠、激活抗体、筛选抗生素、DMSO等，根据给药剂量控制残留限度。6.4基因编辑工具产品重点控制Cas9等编辑蛋白的聚集体、降解杂质，gRNA的序列变异、截断杂质，大肠杆菌来源的HCP、HCD残留，严格控制内毒素含量，避免注射后发生严重不良反应。7全生命周期杂质管理7.1杂质研究应贯穿产品研发、生产、上市后全生命周期，申报注册时需提交完整的杂质谱研究资料，包括杂质识别、分析方法验证、限度确定依据、安全性评估数据。生产过程中应建立产品杂质谱档案，记录每批生产的杂质种类和含量，开展年度趋势分析，监控工艺稳定性，若杂质水平出现持续升高趋势，需及时排查工艺偏差，调整生产工艺。7.2上市后若工艺发生重大变更