DB5301T 26-2019 马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定 DNA分子标记

ICS65.020.01B05DB5301代替DG5301/T26-2017昆明市市场监督管理局发布DB5301/T26—2019I本标准起草单位：云南师范大学马铃薯科学研究院、DB5301/T26—20191马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA分子标记2规范性引用文件本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修GB/T28660马铃薯种薯真实性和纯度鉴定3术语和定义3.1简单序列重复基因组中由1～6个核苷酸残基组成的基本单位串联多次重复构成的DNA序列。[GB/T28660，定义3.1]3.2聚合酶链式反应在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。[GB/T28660，定义3.2]3.3毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。3.4DNA分子标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。3.5标准品种按国家农作物品种审定标准认定的品种。4仪器用具、试剂和软件4.1仪器及用具2DB5301/26—2019——PCR仪（96孔，梯度）；——低温高速离心机（4℃,16000rpm/min）；——制冰机(200kg/天～300kg/天)；——高压灭菌器（121℃,0.15MPa）；——微量移液器（0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL）及配套的枪头；——凝胶成像仪；——电泳仪；——水平电泳槽；——基因分析仪（GeneticAnalyzer,ABI3500/3730xl系列）；——紫外可见分光光度计（190nm～1100nm）；——0.2mLPCR管；——96孔测序板；——石英比色皿。4.2试剂——常用贮备液（制备方法见附录A）；——DNA提取试剂（制备方法见附录B）；——DNA分子标记引物（见附录C）；——TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）和配套的PCR缓冲液；——1000bpDNAMarker；——无DNA酶的RNA酶A（DNase-freeRNaseA）（10mg/mL）；——异丙醇；——乙醇（70%）；——灭菌双蒸水（ddH2O）；——甲酰胺（HIDI）；——分子量内标（GeneScan500LIZ）；——EB染液（100mL1×TAE+5μLEB染料）。4.3软件——DataCollection4.0（ABI）；——GeneMarker2.09(ABI)；——GeneMapper4.0(ABI)；——MicrosoftExcel2013(Microsoftcorporation)。5供试材料5.1取样：按照GB18133取样所述方法进行，采集大田植株叶片或块茎作为检测样品。5.2样品保存：选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置冰箱（-80℃以下）中保存备用（有效保存期小于等于6个月）。DB5301/T26—201936鉴定程序6.1总DNA提取a)称取100mg待测样品，置于预冷2.0mL离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。b)依次加入700μL的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（CTAB缓冲液见附录B表B.1）和2μL的β-巯基乙醇涡旋混匀。置65℃水浴1h，期间每隔10min摇动混匀一次。c)冰上冷却约10min后，加入700μL的氯仿：异戊醇（24:1）混合液（见附录B表B.2），涡旋混合,轻缓颠倒混匀数次。d)12000rpm离心5min。吸取上层水相至新1.5mL离心管中，加入等体积（400μL～500μL）的预冷异丙醇。轻缓颠倒混匀。e)4℃冰箱静置30min后，12000rpm离心15min。弃上清液。f)向离心管中加入70%乙醇1.0mL，静置3min后，12000rpm离心20min。g)小心倒出70%乙醇，再加入90%乙醇1.0mL，静置5min后，12000rpm离心10min，小心倒去乙醇。h)在干净的吸水纸上倒置离心管，自然干燥15min。i)晾干的DNA，应为透明状。加入100μL的1×TE缓冲液，将十倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（EDTA缓冲液见附录B表B.3）稀释10倍并灭菌]溶解DNA，再加入2μL的无DNA酶的RNA酶A（10mg/mL）。37℃温浴1h去除RNA。4℃冰箱放置备用。6.2总DNA质量鉴定6.2.1取DNA提取液1.0μL～5.0μL于新的1.5mL离心管中，加入1×TE缓冲液稀释至1.0mL，混匀后转入石英比色皿中，用紫外分光光度计测定OD260和OD280下的光密度值（OD260：紫外光260nm下的光密度值；OD280：紫外光280nm下的光密度值）。用OD260/OD280比值判断DNA纯度，比值在1.8～1.9之间表明DNA纯度较高。按公式（1）计算提取液中DNA浓度。）；OD260——紫外光260nm下的光密度值；6.2.2总DNA浓度确定后，用1×TE缓冲液将所提取的总DNA稀释为终浓度50ng/μL，根据每次用量分装，置-20℃冰箱保存备用。6.3PCR反应6.3.1PCR反应体系在冰盘中或4℃条件下，按表1所列成分及其用量，顺序依次加入PCR管，准备25.0μLPCRDB5301/26—20194表1PCR反应体系6.3.2反应程序:表2PCR反应程序PCR产物放置在4℃冰箱中保存备用6.4细胞质标记检测用琼脂糖凝胶电泳6.4.1器具清洗6.4.2配胶制备好的凝胶需平整、不漏孔，方可用于电泳检测。制a)量取20mL的电泳缓冲液1×TAE至锥形瓶中；b)再称取0.4g的琼脂糖倒入锥形瓶中，摇匀并用保鲜膜封口；c)放入微波炉中以40%火力加热60s，取出摇匀，再次放入微波炉中以40%火力加热至凝胶完全溶解。制备好的凝胶应为色泽均匀、无气泡；d)将制备好的凝胶放入65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，及时将凝胶倒入装配好的干净胶槽中；e)待凝胶完全凝固后，将胶槽小心转移至4℃冰箱，冷藏30min后拔出梳子；DB5301/T26—20195f)把制备好的凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入电泳缓冲液（1×TAE）至刚好将凝胶淹没。6.4.3上样取5μLPCR产物，加入1μL6×溴酚蓝（见附录A表A.4）混匀，按胶孔顺序上样并做好记录；以5μL的DNALadder为分子量标准。6.4.4电泳在电压120V或400mA电流条件下，电泳30min或溴酚蓝条带迁移距至胶板底部1cm时停止。6.4.5染色电泳结束之后，把凝胶转移到EB染胶盘中，盖上盖子避光染色30min。6.4.6凝胶成像将凝胶放入凝胶成像系统中，按照凝胶成像系统操作规程进行操作，拍照保存检测结果。6.5细胞核标记检测用毛细管电泳分析6.5.1内标配置25mLHi-Di和193μLGeneScan500liz混合（130:1），混合后震荡15s，根据每次使用量分装至1.5mL的灭菌管中，-20℃冻存，使用前4℃解冻。6.5.2分内标将解冻后的内标震荡混匀，分别加入96孔板，每孔9.0μL。若每批次检测样品不足96个时，空白的孔加入ddH2O10.0μL，用封口膜封闭内标板，瞬时离心。6.5.3加样小心揭去内标板的封口膜，吸取0.5μL-1.0μL的待检测样品PCR产物，按顺序分别加样，再次用封口膜封闭已加样的内标板，并用吸水纸压紧。6.5.4变性震荡10s混匀，3900rpm离心5min后，放入PCR仪中96℃变性处理5min，再迅速冷冻(-20℃)2min，瞬时离心。6.5.5电泳与分析按照基因分析仪（ABI3500/3730xl）操作流程进行电泳、数据收集。用软件GeneMarker和GeneMapper进行数据分析，最后用软件Excel进行数据统计。7数据记录和分析7.1细胞质DNA标记检测结果7.1.1叶绿体DNA标记检测：T标记检测结果分为两种带型（446bp或205bp），以区分普通栽培亚种（T,带型205bp）和野生种（W，446bp）的叶绿体DNA类型。DB5301/26—201967.1.2线粒体DNA标记检测：D标记检测结果分为有或无527bp条带，有条带表示携带六倍体野生种Solanumdemissum（D）的线粒体DNA类型。ALM4/5标记检测结果为2400bp、1600bp或无特异性扩增产物，可将线粒体DNA类型分别分为α、β或γ三种。7.2细胞核DNA标记检测结果7.2.1SSR引物(STI0003)标记检测：在137bp～188bp分子量大小范围内有无扩增峰，根据峰值的位置和个数进行判断。7.2.2SSR引物(STI0033)标记检测：在131bp～155bp分子量大小范围内有无扩增峰，根据峰值的位置和个数进行判断。7.2.3SSR引物(STM0030)标记检测：在122bp～168bp分子量大小范围内有无扩增峰，根据峰值的位置和个数进行判断。8结果判定8.1品种真实性鉴定8.1.1直接比较待测品种与标准品种样品的标记检测结果，在本标准要求的细胞质基因组3个分子标记位点及核基因组3个SSR分子标记位点检测结果基础上进行判定。8.1.2首先判定叶绿体DNA标记类型，如电泳带型与标准样品不一致，则判定和待测品种不一致，不进入检测。8.1.3如叶绿体DNA标记检测带型一致，则根据线粒体D标记、ALM4/5标记及3个核基因组SSR标记检测结果进行判定。若待测品种样品与标准品种样品之间所有条带数目和峰位完全吻合，则判定待测品种和标准品种为同一品种；如存在不一致条带和峰值，则判定为不是同一品种。8.2种薯纯度检测根据待检测样品数量，在逐一提取样品基因组DNA后，可采取混合样品（5～10个样品DP）；8.3鉴定结果报告样式DB5301/T26—20197（规范性附录）常用贮备液表A.l～表A.4给出了常用贮备液的配制方法。表A.1为1.0mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸贮备液（Tris-HCl贮备液pH8.0，1000mL）。表A.1Tris-HCl贮备液用约42mL浓盐酸调节pH值至8.0表A.2为0.5mol/L乙二胺四乙酸贮备液(EDTA贮备液pH8.0，1000mL)。表A.2EDTA贮备液用约50mL氢氧化钠调节pH值至8.0表A.3为十倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液（50×TAE缓冲液pH8.0，1000mL）。表A.350×TAE缓冲液表A.4为电泳上样缓冲液（50mL）。表A.4上样缓冲液DB5301/26—20198（规范性附录）DNA提取试剂表B.1为2X十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（2×CTAB缓冲液）(pH8.0，1000mL)。表B.12×CTAB缓冲液表B.2为氯仿：异戊醇混合液(24：1，100mL)。表B.2氯仿：异戊醇混合液表B.3为十倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（10×TE缓冲液pH8.0，1000mL）。表B.310×TE缓冲液DB5301/T2