天冬氨酸对猴头和珊珊状猴头菌丝生长的影响

目录摘要： 天冬氨酸对猴头和珊珊状猴头菌丝生长的影响摘要：以三种不同种类猴头菌“猴头911”、“猴头6号”、“猴头玉珊瑚”为供试菌株，通过添加不同浓度（0mg/L，60mg/L，100mg/L，140mg/L，160mg/L，180mg/L，200mg/L，400mg/L，800mg/L，1500mg/L共10个浓度）的天冬氨酸，对猴头菌丝的生长状况记录并观察，研究天冬氨酸对猴头菌丝生长发育及代谢活性的调控作用。结果表明：“猴头911”添加160mg/L、“猴头6号”添加140mg/L、“猴头玉珊瑚”添加160mg/L时生长速度最快。通过对三种猴头菌添加最适生长浓度的天冬氨酸进行液体发酵培养，冻干后，检测猴头菌丝蛋白以及多糖含量，与空白组进行对比。结果发现，天冬氨酸对“猴头911”、“猴头玉珊瑚”菌丝蛋白质、多糖含量具有一定提高作用，且能显著提高“猴头6号”多糖含量，但抑制了其蛋白质含量。这说明蛋白质、多糖含量不仅与天冬氨酸浓度有关，与菌种也息息相关。本次实验可以为天冬氨酸对猴头菌的产品开发提供一定的参考价值。关键词：天冬氨酸；猴头菌丝；固体培养；液体发酵培养

1引言猴头菌（学名：Hericiumerinaceus）又称花菜菇，是齿菌科、猴头菇属真菌，营养丰富[1]。其主要分布在北温带的阔叶林或针阔混交林中，在日本、北美、俄罗斯、西欧等地以及中国的大部分省份均有分布。猴头菌的蛋白质含量高达20%-25%，含多种必需氨基酸，因其独特的鲜美风味和丰富的营养成分，被列为四大名菜之一[2]。猴头菌既是食用菌，也同样是一种珍稀的药食同源食用菌，具有抗胃溃疡、抗肿瘤[3]、降血糖和降血脂等方面的药用价值[4]。猴头菌的生长发育受外界营养物质影响较大，所以研究营养物质对其生长的影响具有很大的意义[5]。天冬氨酸是一种非必需氨基酸，属于酸性氨基酸，化学式为C₄H₇NO₄。它是生物体内重要的代谢中间体，广泛存在于蛋白质、多肽及某些植物和微生物中[6]。其主要作用包括参与尿素循环和嘌呤及嘧啶合成，协助氨的解毒和核苷酸生成；在三羧酸循环中，作为草酰乙酸的前体，推动能量的产生；在神经递质作用中，作为兴奋性神经递质，参与中枢神经系统的信号传递，影响学习和记忆功能，同时，还可以影响酶的活性[7]。天冬氨酸对食用菌的影响同样很大，其是食用菌生长所需氮源的来源之一，可被菌丝直接吸收利用，促进菌丝体扩展和子实体形成，还可作为调节培养基碳氮平衡的调节剂，优化培养基配方，提升食用菌的产量和营养价值[8]。本试验以三种猴头菌为供试菌种，通过控制不同浓度天冬氨酸，观察菌丝生长状况，测定最佳天冬氨酸浓度，并在此基础上进行液体发酵培养，探究菌丝蛋白质、多糖含量的变化。解析这一机制有助于提高猴头菌的产量和质量，同时，可以为真菌培养提供新的策略和方法，这有助于改进现有的真菌培养技术，提高生产效率。2材料与方法2.1试验材料2.1.1供试菌种“猴头911”、“猴头6号”、“猴头玉珊瑚”，由安徽科技学院食用菌研究中心提供。2.1.2试验试剂所使用的主要试验试剂如表2.1。表2.1试验试剂Table2.1Experimentalinstruments试剂名称厂家天冬氨酸上海麦克林生化科技有限公司葡萄糖国药集团化学试剂有限公司蛋白胨酵母粉七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）磷酸二氢钾（KH2PO4）琼脂2.2试验仪器所使用的主要试验仪器如表2.2。表2.2主要实验仪器Table2.2Importantapparatususedinthiswork仪器名称仪器型号生产厂商电热鼓风干燥箱DHG-9245A上海一恒科学仪器有限公司超净工作台SJ-CJ-2FD*苏州苏洁净化设备有限公司高压蒸汽灭菌锅GI80DS致微厦门仪器有限公司电子天平AR2140梅特勒-托利多仪器有限公司恒温培养摇床HZ500L武汉瑞华仪器设备有限公司紫外分光光度计U-T6PV屹谱仪器有限公司离心机DT5-4*北京时代北利离心机有限公司2.3试验设计本试验采用梯度浓度实验设计，通过外源添加天冬氨酸溶液（设置10个浓度梯度），探究其对猴头菌菌丝生长发育的影响，旨在筛选最适生长浓度并解析其剂量效应机制，同时选取三个猴头菌种进行本次试验。2.4试验流程PDA培养基配方：葡萄糖：22g，蛋白胨：16.5g，酵母粉：11g，MgSO₄•7H₂O：1.1g，KH₂PO₄：1.65g，蒸馏水：1000mL，pH：自然[9]。将配置好的培养基倒入150mL的锥形瓶中，每瓶分装90mL和1.62g的琼脂，封口于高压蒸汽灭菌锅121℃，灭菌20min，同时注意及时使用防止冷凝。液体发酵培养基同以上配方和配比，但不需要加入琼脂，用蒸馏水定容至500mL，再用每个容积为250mL的锥形瓶分装150mL液体发酵培养基，高压蒸汽灭菌121℃，20min，取出后冷却备用。2.4.1氨基酸母液的制备及灭菌称量所需天冬氨酸溶于超纯水中，制备自己所需的天冬氨酸的浓度，然后进行过滤灭菌，保存备用。2.4.2固体培养基培养在超净台上，根据所需的各种不同浓度，分别向培养基中添加不同体积的天冬氨酸溶液，混匀后趁热倒入培养皿中，以此类推，防止冷凝。倒板保持均匀，每培养皿中倒入15mL的培养液，待凝固后做标记，标记出时间，浓度，菌种和编号，放置待用。将准备好的菌种以及剪好的封口膜喷好酒精放入超净台中，然后进行接种：将准备好的猴头911菌株、猴头-6号菌株、玉珊瑚状猴头菌种分别接种到含有不同浓度天冬氨酸的PDA平板中央，每个处理设置3个重复，每个菌种设置三个对照，在（25士1）℃恒温培养箱中培养，菌丝生长8整天为一个周期，周期结束后以十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速度[10]。2.4.3液体发酵培养基培养用上述培养基配方配制液体发酵培养基，待液体培养基冷却后，设置每个品种最佳生长天冬氨酸浓度的液体培养基，用1mL枪头尾部将把各个菌种切出圆形的菌种块，每个培养基里均接15个菌种块，每个品种设置三个重复，每个菌种设置一个对照。将液体培养基放入摇床，培养直至长满。2.5测定方法将抽滤机连接好电源，在抽滤盘内铺好滤水纱布，将长满的菌种液倒在纱布上，然后打开电源，进行抽滤，在锥形瓶内倒入蒸馏水冲洗然后倒入抽滤机，重复2-3次。抽滤完成后收集菌丝体，然后分装到培养皿中并做好标记，区分品种，再置于烘箱中烘干，然后将菌丝体研磨成粉，保存备用。2.5.1蛋白质的测定取干粉0.4g与6mL蒸馏水混合于10mL离心管中。55℃水浴2.5h。取出放凉后放入离心机，4000r/min离心15min。取上清液得待测溶液。取1mL待测样品,加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂并摇匀，放置5min后,在595nm波长下比色记录A595，再从标准曲线上计算蛋白质含量，重复三次，取平均值[11]。2.5.2多糖的测定取7mL蒸馏水与0.1g干粉于10mL离心管中混合均匀，90℃下水浴2.5h。取出放凉后放入离心机，4000r/min离心15min。取上清液得待测溶液。精密移取4L待测液与196L蒸馏水混匀，依次加入5%的苯酚溶液100L、浓硫酸500L，充分摇匀后室温静置6min，然后放入水浴中反应15min。将1至7号管溶液依次置于紫外可见分光光度计中在波长490nm处测定吸光度。每个样品重复三次,取平均值[12]。3结果与分析3.1固体培养基中不同浓度天冬氨酸对猴头菌丝生长的影响3.1.1不同浓度天冬氨酸对“猴头911”菌丝生长的影响观察表3.1和图3.1、3.2，不同天冬氨酸浓度培养基中的“猴头911”经过8天培养后菌丝生长呈现显著差异。最适浓度（即A5）条件下，菌丝生长速率达到峰值，表现为菌落致密、色泽纯白，边缘可见大量排列整齐的绒毛状菌丝，形态特征最优。在低浓度下菌丝扩展速率较慢，菌丝稀疏；而高浓度虽未完全抑制生长，但速率亦有所降低。根据数据可知，添加较低浓度天冬氨酸对“猴头911”有明显的促进作用，当浓度达到A6时，菌丝的生长速度有所下降，高浓度的天冬氨酸对菌丝生长有抑制作用。观察菌丝长势，发现其呈现先减小再增大，随后再减小的趋势。达到A5时菌丝长势最好，随着天冬氨酸浓度增加，又出现菌丝长势抑制的现象。图3.1不同浓度下“猴头911”菌落形态Figure3.1ThecolonymorphologyofHericiumerinaceus911atdifferentconcentrations表3.1不同浓度天冬氨酸对“猴头911”菌丝生长的影响Table3.1EffectsofdifferentconcentrationsofasparticacidonthegrowthofHericiumerinaceus911mycelium编号浓度（mg/L）菌丝直径（mm)菌丝长势菌丝生长速度（mm/d）A1065.85+++8.23A26070.28++8.79A310071.52++8.94A414078.93+++9.87A516079.76++++9.97A618079.29+++9.91A720066.62+8.33A840065.84++8.23A980061.08+7.64A10150065.78++8.22注:+代表菌丝生长密度，+越多代表菌丝生长越浓密。图3.2不同浓度下“猴头911”菌丝生长速度折线图Figure3.2LinegraphofmycelialgrowthrateofHericiumerinaceus911atdifferentconcentrations3.1.2不同浓度天冬氨酸对“猴头6号”菌丝生长的影响观察表3.2和图3.3、3.4。可以看出，当天冬氨酸浓度达到B4时，“猴头6号”生长速度最快，菌落直径最大，菌丝浓密整齐。超过B4之后，其生长速度略有下降。因此，低浓度天冬氨酸浓度会促进“猴头6号”菌丝生长，高浓度则出现抑制作用，但其抑制效果与“猴头911”在天冬氨酸高浓度时有较大不同，即抑制效果较轻。观察菌丝长势，发现其呈现不断增加的趋势。达到B10时菌丝长势最好，随着天冬氨酸浓度增加，菌丝生长速度不断趋向平稳，在较低偏差中浮动。图3.3不同浓度下“猴头6号”菌落形态Figure3.3HericiumerinaceusNo.6ConlyMorphologyUnderDifferentConcentrations表3.2不同浓度天冬氨酸对“猴头6号”菌丝生长的影响Table3.2EffectsofdifferentconcentrationsofasparticacidonthegrowthofmyceliumofHericiumerinaceusNo.6编号浓度（mg/L）菌丝直径（mm)菌丝长势菌丝生长速度（mm/d）B1048.82+6.10B26058.11+7.26B310055.88++6.99B414061.42++7.68B516059.75++7.47B618058.57++7.32B720056.57++7.07B840057.96++7.25B980056.17++7.02B10150058.16+++7.35注:+代表菌丝生长密度，+越多代表菌丝生长越浓密。图3.4不同浓度下“猴头6号”菌丝生长速度折线图Figure3.4LinegraphofmycelialgrowthrateofHericiumerinaceusNo.6atdifferentconcentrations3.1.3不同浓度天冬氨酸对“猴头玉珊瑚”菌丝生长的影响观察表3.3和图3.5、3.6。可以看出在低浓度条件下，天冬氨酸对菌丝生长影响较小，略有促进作用，当浓度达到C5时，菌丝生长速率和菌丝直径均达到峰值。然而，超过C5后，随着天冬氨酸浓度升高，菌丝生长受到较为显著的抑制，表现为生长速率下降和菌丝直径减小。该结果表明，天冬氨酸对“猴头玉珊瑚”菌丝生长具有“低促高抑”的剂量效应。观察菌丝长势，发现其呈现先增大再减小的趋势。达到C5时菌丝长势最好，C6、C7仅次之，随着天冬氨酸浓度增加，则又出现菌丝长势抑制的现象。图3.5不同浓度下“猴头玉珊瑚”菌落形态Figure3.5ThemorphologyofHericiumerinaceuscoralcolonyatdifferentconcentrations表3.3不同浓度天冬氨酸对“猴头玉珊瑚”菌丝生长的影响Table3.3TheeffectofdifferentconcentrationsofasparticacidonthegrowthofHericiumerinaceuscoralmycelium编号浓度（mg/L）菌丝直径（mm)菌丝长势菌丝生长速度（mm/d）C1064.89++8.11C26069.94++8.74C310066.12++8.27C414073.54++9.19C516075.59+++9.45C618074.50+++9.31C720065.22+++8.15C840058.06++7.26C980063.17++7.90C10150054.34++6.79注:+代表菌丝生长密度，+越多代表菌丝生长越浓密。图3.6不同浓度下“猴头玉珊瑚”菌丝生长速度折线图Figure3.6LinegraphofmycelialgrowthrateofHericiumerinaceuscoralatdifferentconcentrations3.2三种猴头菌的生长对比以及分析图3.7通过对三个猴头菇品种（“猴头911”、“猴头6号”、“猴头玉珊瑚”）的天冬氨酸浓度梯度培养实验观察，其生长响应呈现出显著的品种特异性与浓度依赖性差异。总体而言，在相同培养条件下，品种之间大致的生长表现由优至劣依次为：“猴头911”＞“猴头玉珊瑚”＞“猴头6号”。这一排序的形成与各品种对天冬氨酸浓度的差异性响应密切相关。实验数据显示，所有供试品种均表现出典型的“低促高抑”生理特征。当培养基中天冬氨酸浓度处于较低水平时，三种菌株均呈现显著的生长促进效应，其中“猴头911”和“猴头玉珊瑚”在160mg/L浓度下表现出最大的菌丝生长效果，“猴头6号”菌株的初期响应相对较大，有较好的促进生长现象，但其在达到140mg/L的最适浓度后，出现较弱的抑制现象。值得注意的是，当浓度梯度超过160mg/L后，各品种均出现生长抑制现象，但抑制程度存在明显分化：“猴头911”与“猴头玉珊瑚”菌株抑制显著高于“猴头6号”菌株。同时，还需要注意“猴头6号”菌株添加天冬氨酸后生长效果始终高于空白组。进一步分析表明，“猴头911”菌株和“猴头玉珊瑚”菌株对天冬氨酸的敏感性呈现双相特征，其最适生长浓度区间较窄，超出该范围可能会触发强烈的反馈抑制机制。这种特性可能与其高效的营养吸收系统相关，当遭遇过量氨基酸时易引发代谢失衡。相较而言，“猴头6号”菌株展现出更强的环境适应性，且在高浓度胁迫下仍能通过调节天冬氨酸水解酶活性维持基本生长。这种差异化的代谢调控策略，最终导致三个品种在梯度浓度培养中的差异化表现。图3.7三种猴头菌在不同天冬氨酸浓度下的生长速度对比Figure3.7ComparisonofthegrowthratesofthreetypesofHericiumerinaceusunderdifferentasparticacidconcentrations3.3液体发酵后对猴头菌丝体蛋白含量和多糖含量的测定3.3.1蛋白质含量的分析猴头菇属的三个不同品种（“猴头911”、“猴头6号”、“猴头玉珊瑚”），在各自优化的天冬氨酸培养条件下开展蛋白质合成能力对比分析，并设置未添加外源天冬氨酸的空白对照组进行系统性比较。图3.8结果显示：“猴头911”在最佳天冬氨酸浓度下表现出显著的蛋白质合成促进效应，其蛋白质含量较空白组提升达统计学显著水平，表明该品种对天冬氨酸的代谢转化具有高效性；“猴头玉珊瑚”品种虽亦呈现蛋白质含量正向增长趋势，但其增幅相对有限，统计显著性弱于“猴头911”品种；值得注意的是，“猴头6号”在同等培养条件下呈现出微弱的抑制效应，其蛋白质含量较对照组的生物学差异虽未达显著阈值，但已显示出该品种对外源天冬氨酸的代谢耐受性缺陷。这种品种间差异化的生理响应机制，可能与其细胞膜转运机制相关[13]。蛋白质标准曲线方程为y=4.215x+0.003，该方程线性关系良好图3.8菌丝体蛋白含量Figure3.8Myceliumproteincontent3.3.2多糖含量的分析三个猴头菇品种（“猴头911”、“猴头6号”、“猴头玉珊瑚”）分别采用其各自最优天冬氨酸浓度进行定向培养，系统比较了外源天冬氨酸对菌丝体多糖合成的调控效应。实验通过设置天冬氨酸最适浓度培养基，并以未添加外源天冬氨酸的空白组为基准进行比较。图3.9结果表明：“猴头6号”在特定天冬氨酸浓度条件下展现出显著的多糖合成优势，其多糖含量较空白组提升幅度达到统计学显著水平，提示该品种可能具备高效的天冬氨酸依赖型多糖合成通路[14]；“猴头玉珊瑚”品种在同等培养条件下亦表现出较为突出的多糖增长量，反映其天冬氨酸利用效率也同样较高；相比之下，“猴头911”品种虽然在天冬氨酸培养中呈现多糖含量的温和增长，但增长效率较弱，暗示该品种的碳代谢可能更偏向于蛋白质合成途径的优先分配[15]。这种品种间功能分化的现象，可能与菌株特有的基因表达调控相关。多糖标准曲线方程为y=0.7763x+0.2085，该方程线性关系良好。图3.9菌丝体多糖含量Figure3.9Myceliumpolysaccharidecontent4结论与讨论4.1讨论本次试验通过设置十种不同浓度梯度的天冬氨酸进行固体培养，然后筛选出适合菌丝体生长的天冬氨酸最佳浓度进行液体发酵培养。实验研究显示在固体培养基中添加不同浓度天冬氨酸培养三种猴头菌菌（“猴头911”、“猴头6