通过添加WPRE和ITRs增加重组杆状病毒载体的表达效果

PAGEII摘要杆状病毒（Baculovirus）是一类节肢动物病毒，因病毒粒子多呈杆状而得名。WPRE来源于土拨鼠肝炎病毒（Woodchuckhepatitisvirus，WHV），是一段位于病毒基因组3'非翻译区（3'UTR）的顺式作用元件，长度约为600-700bp，它有特别的二级结构，有多个茎环结构。ITRs来自转座子，是转座子两头的特殊DNA序列,具有特定长度和碱基排列顺序的DNA序列，一般长度在几十到几百碱基对不等，不同转座子的ITRs序列不同，但通常具有反向重复的特点。本实验首先，设计特异引物PCR扩增目的片段“WPRE”、“ITRs”及“pA”，构建成重组转移载体“pLM”，让WPRE和pA融合成“soe-2”。然后，PCR扩增“ITR-L”和“ITR-R”，构建成重组转移载体“pLM-ITRs”，用酶切法分别去切割载体pLM和片段“ITR-L”、“ITR-R”，最后转移到重组杆状病毒表达载体去表达。已经有研究证明，把这两个元件加入到重组杆状病毒表达载体里可以提高重组杆状病毒的转化效率。关键词杆状病毒；WPRE；ITRs；转化效率AbstractBaculovirusisatypeofarthropodvirusnamedafteritsrod-shapedparticles.WPREoriginatesfromWoodchuckhepatitisvirus(WHV)andisacisactingelementlocatedinthe3'untranslatedregion(3'UTR)ofthevirusgenome.Itisapproximately600-700bpinlengthandhasauniquesecondarystructurewithmultiplestemloopstructures.ITRscomefromtransposonsandarespecialDNAsequencesatbothendsofthetransposon.TheyareDNAsequenceswithspecificlengthsandbasearrangements,generallyrangingfromtenstohundredsofbasepairsinlength.TheITRssequencesofdifferenttransposonsaredifferent,buttheyusuallyhavethecharacteristicofreverseduplication.Inthisexperiment,specificprimersweredesignedforPCRamplificationofthetargetfragments"WPRE","ITRs",and"pA",andarecombinanttransfervector"pLM"wasconstructedtofuseWPREandpAinto"soe-2".Then,PCRamplificationof"ITR-L"and"ITR-R"wasperformedtoconstructtherecombinanttransfervector"pLMITRs".ThevectorpLMandfragments"ITR-L"and"ITR-R"werecleavedusingenzymaticdigestion,andfinallytransferredtotherecombinantbaculovirusexpressionvectorforexpression.Studieshaveshownthataddingthesetwocomponentstoarecombinantbaculovirusexpressionvectorcanimprovetheconversionefficiencyoftherecombinantbaculovirus.Keywordsbaculovirus;WPRE;ITRs;conversionefficiency目录摘要 IAbstract II1.前言 11.1杆状病毒表达载体系统 11.1.1杆状病毒表达载体系统生物学特性 11.1.2杆状病毒表达载体系统工作原理 21.1.3杆状病毒表达载体系统的应用领域 21.2WPRE增强基因表达的机制 31.2.1WPRE的来源与结构 31.2.2WPRE增强基因表达的分子机制 31.3ITRs增强基因表达的机制 41.3.1ITRs的来源和结构 41.3.2ITRs增强基因表达的分子机制 41.4添加WPRE和ITRs增强重组杆状病毒载体表达效果的研究现状 51.4.1单独添加WPRE对重组杆状病毒载体表达的影响 51.4.2单独添加ITRs对重组杆状病毒载体表达的影响 51.4.3同时添加WPRE和ITRs对重组杆状病毒载体表达的协同作用 51.5研究背景、目的和意义 61.5.1研究背景 61.5.2研究目的 61.5.3研究意义 72.材料与方法 82.1实验材料 82.1.1供试菌种 82.1.2扩增引物 82.1.4主要分子生物学及生化试剂 92.1.5主要缓冲液、试剂及培养基的配制 102.2实验方法 112.2.1构建含有片段WPRE的重组载体 112.2.2重组转移载体pLM-ITRs的构建 133.结果与分析 153.1重组中间质粒pFB/LM-PH的构建 153.1.1片段WPRE和pA的PCR扩增 153.1.2片段WPRE与pA的融合 153.1.3重组子pT-soe2的鉴定 163.1.4片段ITR-L和ITR-R的PCR扩增 163.1.5带有粘性末端的载体pLM和片段ITR-L的制备 173.1.6菌液PCR法筛选含有pLM-ITR-L的阳性菌液 173.1.7重组中间质粒pLM-ITR-L的鉴定 183.1.8带有粘性末端的载体pLM-ITR-L和片段ITR-R的制备 183.1.9菌液PCR法筛选含有pLM-ITRs的阳性菌液 193.1.10重组转移载体pLM-ITRs的鉴定 19结论 21参考文献 22致谢 24PAGE241.前言1.1杆状病毒表达载体系统1.1.1杆状病毒表达载体系统生物学特性杆状病毒（Baculovirus）专门感染节肢动物，是一种DNA病毒，它的遗传物质是大型双链环状结构。因为病毒外形像小杆子，所以叫杆状病毒，它的基因大小一般在80到180kb。这种病毒结构很特别，最里面是核衣壳，外面还裹着一层囊膜。核衣壳由蛋白质组成，把病毒的基因组DNA包裹在里面，囊膜来自宿主细胞膜，上面附着着糖蛋白可以进行病毒编码。表面与病毒衣壳或囊膜蛋白融合表达，可以将外源肽展示在杆状病毒表面,形成刺猬状“伪病毒”REF_Ref28742\r\h[1]，这样的伪病毒与野生杆状病毒比起来，对哺乳动物细胞的嗜性更多，介导的转基因表达效率也更高。杆状病毒在自然界中主要感染节肢动物，尤其是昆虫，具有高度的宿主特异性，能够感染包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目的600多种昆虫。其主要种类有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、家蚕核多角体病毒、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒、棉铃虫核型多角体病毒以及斜纹夜蛾核型多角体病毒等REF_Ref28836\r\h[2]。在昆虫细胞内，杆状病毒经历复杂的复制周期，包括早期基因表达、基因组复制以及晚期基因表达等阶段。杆状病毒或昆虫细胞表达系统具有翻译后加工能力,能够对重组蛋白进行信号肽剪切、糖基化修饰等诸多特点,是当前应用较为广泛的表达系统之一REF_Ref28902\r\h[3REF_Ref28908\r\h,4]。在昆虫细胞中，杆状病毒表达的外源基因产物能够正确折叠及进行各种翻译后修饰，如磷酸化、酰胺化等，同时昆虫杆状病毒表达系统容量较大，杆状病毒表达具有更为独特的优势REF_Ref29036\r\h[5REF_Ref29045\r\h,6]。杆状病毒在哺乳动物细胞中不复制，具有极高的生物安全性，已成为疫苗开发、基因治疗领域理想的转移载体REF_Ref29156\r\h[7REF_Ref29166\r\h,8]。传统构建杆状病毒的方法昆虫细胞内的同源重组率低，在选周期较长，所以这种方法被代替了。Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统革命性地改变了以往重组病毒构建的方法，且能够获得遗传上绝对均一的重组病毒REF_Ref29274\r\h[9]。Bac-to-Bac表达系统成为重组蛋白表达的普遍、有效工具REF_Ref29342\r\h[10]。1.1.2杆状病毒表达载体系统工作原理病毒载体构建：杆状病毒基因组较大，需经改造构建载体。先去除部分非必需基因，为外源基因插入留出空间，并添加合适调控元件，如多角体蛋白基因启动子（polh）然后，把需要研究的外来基因“拼接”到含有polh启动子的载体上，制作出重组载体。接下来，把刚做好的重组载体，和自然界原本的杆状病毒DNA一起，“送进”昆虫细胞里。在细胞内部，这两种DNA会像拼图一样，通过同源重组的方式结合，把外来基因嵌入到杆状病毒的基因序列中，最终形成我们需要的重组杆状病毒。可通过筛选标记，如β-半乳糖苷酶基因，识别含外源基因的重组病毒。感染昆虫细胞及基因表达：重组杆状病毒钻进昆虫细胞后，病毒的基因会跑到细胞核里。在polh启动子的“启动”下，外来基因变成mRNA，再跑到细胞质里，被细胞“翻译”成蛋白质。昆虫细胞还能通过糖基化、磷酸化等方式加工蛋白，让它有正常功能。1.1.3杆状病毒表达载体系统的应用领域应用于蛋白生产、疫苗研发、基因治疗、组织工程REF_Ref29437\r\h[11-REF_Ref29454\r\h13]等方面的领域。蛋白生产是利用昆虫细胞为其提供适宜环境，实现多种蛋白高效表达，产物具备接近天然蛋白的结构与功能，可以生产药用蛋白，如白细胞介素、干扰素；生产工业用酶，如蛋白酶、淀粉酶。杆状病毒仅对无脊椎动物寄主具有感染性，对哺乳动物无感染性，基于这点特性，通过体外培养获得重组蛋白在药物研发和疫苗制备中具有较高的安全性REF_Ref29741\r\h[14]，杆状病毒—昆虫细胞表达系统作为一种VLPs的生产平台，已广泛用于VLPs的生产，并已开发数种许可疫苗，例如流感病毒疫苗和乙型肝炎病毒疫苗等。基因治疗与癌症治疗REF_Ref29813\r\h[15-REF_Ref29829\r\h17]领域也有应用，基因治疗可以作为载体将治疗基因导入靶细胞，治疗囊性纤维化、血友病等单基因遗传病。还可以低免疫原性，在哺乳动物细胞中不复制，免疫原性低，降低免疫反应风险，利于长期治疗。1.2WPRE增强基因表达的机制1.2.1WPRE的来源与结构WPRE来源于土拨鼠肝炎病毒（Woodchuckhepatitisvirus，WHV），是一段位于病毒基因组3'非翻译区（3'UTR）的顺式作用元件，长度约为600-700bp。WPRE作为一种能增强转基因表达的顺式作用元件REF_Ref29943\r\h[18REF_Ref29953\r\h,19]，已经被成功的用于重组载体的增强表达REF_Ref30071\r\h[20]。它有特别的二级结构，有多个茎环结构，这些结构对发挥功能至关重要。功能上可分为这几个区域，包括与RNA结合蛋白相互作用的区域，能招募相关蛋白来调控mRNA的转运、稳定性和翻译；还有一些区域可影响mRNA的折叠和空间构象，进而间接影响其在细胞内的命运。WPRE在研究WHV病毒复制和基因表达调控过程中被发现，被证明能够增强多种基因在不同细胞类型中的表达。1.2.2WPRE增强基因表达的分子机制可通过优化RNA多聚腺苷酸化、出核和翻译来增强基因表达效率REF_Ref30149\r\h[21]。促进mRNA核输出：在真核细胞里，mRNA在细胞核内生成，却要到细胞质里才能“工作”，所以从细胞核跑到细胞质这步特别重要。WPRE能和细胞里负责搬运的蛋白“合作”，帮含有WPRE的mRNA更快、更顺利地从细胞核运到细胞质里。提高mRNA稳定性:mRNA的稳定性是影响基因表达的另一个重要因素。WPRE可以通过多种方式提高mRNA的稳定性。一方面，WPRE形成的茎环结构可以阻碍核酸外切酶对mRNA的降解，保护mRNA的3'末端。另一方面，WPRE可能招募一些与mRNA稳定性相关的蛋白因子，如HuR（人抗原R）等，这些蛋白因子与mRNA结合后，可增强mRNA的稳定性，延长其半衰期，从而使更多的mRNA能够参与翻译过程，提高基因表达效率。增强翻译起始效率:除了影响mRNA的核输出和稳定性外，WPRE可能对翻译起始过程产生影响。有研究推测，WPRE可能改变mRNA的二级结构，使其更有利于核糖体的结合，从而提高翻译起始效率。此外，WPRE可能通过与一些翻译起始因子相互作用，促进翻译起始复合物的形成，进一步增强基因表达。1.3ITRs增强基因表达的机制1.3.1ITRs的来源和结构ITRs来自转座子，是转座子两头的特殊DNA序列。转座子能在生物基因组里“搬家”变位置，而ITRs是它的重要部分。在转座过程中起着重要作用。ITRs置于目的基因表达盒的两侧时能够使表达的时间增长的同时还能够使基因的表达量提高REF_Ref30250\r\h[22-REF_Ref30263\r\h24]，并且有研究表示ITRs的缺失会影响转基因的表达REF_Ref30381\r\h[25]。ITRs是具有特定长度和碱基排列顺序的DNA序列，一般长度在几十到几百碱基对不等，不同转座子的ITRs序列不同，但通常具有反向重复的特点。以Tol2转座子为例，其ITRs是位于转座子两端的反向末端重复序列，转座酶能识别ITRs，将转座区域从载体上切割下来，进而插入到宿主基因组中。1.3.2ITRs增强基因表达的分子机制促进基因整合与稳定表达：在基因治疗和表达载体构建中，外源基因的稳定整合是实现长期、高效表达的关键。一些调查表明，ITRs能够促进外源基因整合到宿主细胞基因组中。以AAV的ITRs为例，它的发夹结构可以与宿主细胞的DNA修复机制相互作用，引导外源基因整合到宿主细胞基因组的特定区域。这种整合方式比游离型的要好一点，可以使外源基因在细胞分裂过程中稳定遗传，实现持续的基因表达。增强转录起始与调控:ITRs能像开关助手一样，帮助控制基因转录的启动。ITRs中的一些固定的序列片段能够与宿主细胞内的转录因子一起形成转录起始复合物，帮助RNA聚合酶更好的找到启动子的位置，让转录启动变得更快、更高效。ITRs还可能使染色质结构变化，使转录因子和RNA聚合酶识别基因启动子区域，提高基因转录水平。提高载体的稳定性与包装效率:在生产病毒载体过程中，ITRs对包装效率和载体的稳定性很重要。添加ITRs可以使载体基因组的稳定性增强，减少病毒复制和传代过程中基因组的突变和缺失。同时，ITRs能够与病毒包装相关的蛋白相互作用，促进病毒粒子的组装和包装，提高病毒载体的生产效率。1.4添加WPRE和ITRs增强重组杆状病毒载体表达效果的研究现状1.4.1单独添加WPRE对重组杆状病毒载体表达的影响已有多项研究报道了在重组杆状病毒载体中单独添加WPRE对基因表达的增强作用。例如，在一项研究中，将绿色荧光蛋白（GFP）基因克隆到重组杆状病毒载体中，分别构建含有和不含有WPRE的载体，转染昆虫细胞后发现，含有WPRE的载体组GFP蛋白的表达量显著高于对照组，通过Westernblot检测和荧光定量分析，发现表达量可提高2-3倍。进一步研究表明，WPRE的存在使GFPmRNA在细胞质中的含量增加，半衰期延长，证明了WPRE通过促进mRNA核输出和提高稳定性来增强基因表达。有研究在慢病毒载体骨架上加入了WPRE，它增强mRNA转录的稳定性，提高第三代载体的表达REF_Ref30508\r\h[26-REF_Ref30518\r\h28]。在生产药用蛋白方面，如重组人胰岛素样生长因子-1（rhIGF-1），利用添加WPRE的重组杆状病毒载体在昆虫细胞中表达，rhIGF-1的产量和活性有明显提升，这为生产具有生物活性的药用蛋白提供了有效策略。1.4.2单独添加ITRs对重组杆状病毒载体表达的影响单独添加ITRs也被证明能够改善重组杆状病毒载体的性能。研究发现，将AAV的ITRs引入重组杆状病毒载体中，可促进外源基因在昆虫细胞中的稳定整合。以报告基因Luciferase为例，含有ITRs的重组杆状病毒载体感染昆虫细胞后，Luciferase的表达持续时间更长，且表达水平在后期明显高于对照组。这是由于ITRs促进了Luciferase基因整合到昆虫细胞基因组中，使其在细胞分裂过程中稳定遗传，从而实现持续表达。此外，添加ITRs还可提高杆状病毒载体的包装效率，在病毒生产过程中，含有ITRs的载体可获得更高滴度的病毒液，有利于大规模生产重组杆状病毒载体。1.4.3同时添加WPRE和ITRs对重组杆状病毒载体表达的协同作用近年来，一些研究尝试同时在重组杆状病毒载体中添加WPRE和ITRs，探索二者的协同作用。研究表明，与单独添加WPRE或ITRs相比，同时添加WPRE和ITRs能够更显著地增强外源基因表达。例如，在一项关于重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）表达的研究中，构建了分别单独添加WPRE、ITRs以及同时添加WPRE和ITRs的重组杆状病毒载体。结果显示，同时添加WPRE和ITRs的载体组rhIFN-γ的表达量相较于单独添加WPRE组提高了约1.5倍，相较于单独添加ITRs组提高了约2倍。通过分析发现，WPRE和ITRs分别从转录后水平和转录水平以及基因整合等方面协同作用，促进了rhIFN-γ基因的高效表达。这种协同作用为进一步优化重组杆状病毒载体的性能提供了新的思路和方法。1.5研究背景、目的和意义1.5.1研究背景现有杆状病毒表达系统的局限性：尽管杆状病毒表达系统优势显著，但重组蛋白表达水平有限，限制其大规模应用。生产过程中，常需投入大量资源提升表达量，增加成本与时间。其原因包括转录后调控机制不完善，mRNA稳定性、转运及翻译效率等影响重组蛋白表达。如某些重组蛋白在昆虫细胞中mRNA半衰期短，导致蛋白合成量少。为解决该问题，科研人员尝试多种策略，如优化启动子、选择合适宿主细胞等，但效果有待提高。WPRE的研究现状：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件可增强mRNA稳定性与转运效率，提高基因表达。在哺乳动物细胞研究中，WPRE能显著提升目的基因表达水平，促进mRNA从细胞核转运至细胞质，增加mRNA翻译模板量。但在杆状病毒表达系统中应用研究较少，其作用机制与效果有待深入探索。ITRs的研究现状：反向末端重复序列存在于多种病毒基因组末端，对病毒复制、转录及基因表达调控起重要作用。在腺相关病毒（AAV）中，ITRs引导病毒基因组整合与复制，增强基因表达。在杆状病毒表达系统中，ITRs对重组蛋白表达影响研究处于起步阶段，能否像在AAV中发挥作用，需进一步研究验证。1.5.2研究目的想探究WPRE和ITRs这两个元件，对重组杆状病毒载体的效果有没有帮助。所以把WPRE和ITRs单独或一起加到重组杆状病毒载体里，做出不同的重组病毒。接着让这些病毒在昆虫细胞里生产目标蛋白，再测量蛋白产量。通过这样的实验，弄清楚WPRE和ITRs单独用、一起用，分别会对重组杆状病毒载体产生什么影响，以及它们能不能让重组蛋白产出更多。优化重组杆状病毒表达系统，提高重组蛋白生产效率:基于上述研究，确定WPRE和ITRs最佳应用方式，优化重组杆状病毒表达系统，提高重组蛋白表达水平与生产效率。为重组蛋白大规模生产提供经济、高效技术方案，推动相关生物技术产业发展。1.5.3研究意义提升重组蛋白生产效率，降低成本：提高重组杆状病毒载体表达效果，可增加重组蛋白产量，减少生产过程中细胞培养规模、培养时间及原材料消耗，降低生产成本。对于生物制药产业，高效生产重组蛋白药物可提高企业经济效益，推动产业发展。促进新型疫苗及生物制品研发：在疫苗研发中，提高重组蛋白表达量可获得更多高质量抗原，提升疫苗免疫效果。本研究成果有助于加快新型疫苗研发进程，为疾病预防控制提供更有效手段。同时，对其他生物制品如诊断试剂、酶制剂等研发生产也具有积极推动作用。2.材料与方法2.1实验材料2.1.1供试菌种1.E.coliDH5α：用途是质粒转化宿主菌株，菌株来源于黑龙江大学微生物重点实验室2.1.2扩增引物用DNAstar软件设计了用来扩增目标基因片段的引物。设计时，特意把引物和模板配对部分的解链温度（Tm值）控制在58℃-62℃之间。这些引物由金思特科技有限公司合成。配好的引物先以100μM浓度存进零下70℃超低温冰箱，要用的时候稀释成10μM，放在零下20℃冰箱备用。表2-1引物序列引物方向序列酶切位点/附加序列LM-8fCGGAATTCACGCATGCTTGTCGACGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAEcoRI-SphI-SalILM-10brTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTAAAACAGGCGGGGAGGCGG5′端添加pA的3′序列（无义链）LM-11fTGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTXbaILM-12rTGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCGXbaILM-13fATGTCTGGATCTCCGGACACGTG--LM-14rATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCGRsrII2.1.3主要仪器设备表2-2实验室设备信息表设备名称型号制造商PCR仪-EppendorfGAGermany凝胶成像分体系统OMega10美国Ultralum公司高速离心机X-15R贝尔曼库尔特公司超纯水纯化系统MILLIQ-AMILLIPORE密理博中国有限公司蒸汽压力灭菌锅-日本三洋电子有限公司生物安全柜HFsafe1500/C上海力新实业有限公司摇床HZQ-QX哈东联电子技术开发公司电子天平PL1501梅特勒－托利多公司PH计Mettler梅特勒－托利多公司快速混匀器SK-1常州国华电器有限公司恒温电磁搅拌器FEB-85常州国华电器有限公司冰箱BCD-235E青岛海尔股份有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140上海精宏实验设备有限公司2.1.4主要分子生物学及生化试剂2.1.4.1工具酶限制性内切酶XbaI、EcoRI、RsrII、PstI，PrimerSTARTMHSDNA聚合酶、PrimerSTARTMHSDNA聚合酶（GCbuffer）、TaqDNA聚合酶，CIAP去磷酸化酶购自宝生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自Fermentas公司。2.1.4.2试剂盒从华舜生物试剂公司买的质粒抽提纯化、小量胶回收等试剂盒。2.1.4.3生化试剂表2-3生物实验试剂购买信息表试剂名称用途供应商异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）-宝生物工程有限公司5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal）-氨苄青霉素抗生素饱和酚-氯仿-Tris-Base-琼脂糖-葡萄糖-琼脂粉-低熔点琼脂糖-Sigma公司酵母提取物-OXOID公司胰蛋白胨-2.1.5主要缓冲液、试剂及培养基的配制2.1.5.1常用试剂或贮存液的配制表2-4实验室常用溶液配制表序号溶液名称配制方法保存条件1酚/异戊醇（25/1,V/V）按体积比配制保存于棕色试剂瓶2氯仿/异戊醇（24/1,V/V）按体积比配制保存于棕色试剂瓶33mol/LNaAc溶液（pH5.2）20.405gNaAc·3H2O，加ddH2O40mL溶解，冰醋酸调pH至5.2，补足水至50mL121℃高压灭菌15min475%乙醇75mL乙醇，补足水至100mL-5TB溶液10mMHepes，55mMMnCl2，15mMCaCl2，250mMKCl。除了MnCl2，将所有的成分混合，用KOH调pH至6.7，然后再将MnCl2溶解，0.45μm细菌滤器过滤除菌于4℃保存620mg/mLX-gal储存液取5mLDMF充分溶解100mgX-gal粉末锡箔包裹，-20℃避光保存17200mg/mLIPTG溶液取5mL灭菌ddH2O充分溶解1gIPTG0.22μm细菌滤器过滤除菌，分装于EP管，-20℃保存1820×SSCNaCl175.30g，柠檬酸钠88.20g，加ddH2O800mL，NaOH调pH至7.0，补水至1000mL121℃高压灭菌15min2.1.5.2质粒抽提相关溶液（1）溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-Cl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0），121℃高压灭菌15min，4℃保存备用；（2）溶液Ⅱ：0.2mol/L氢氧化钠，1%SDS，使用前再配制；（3）溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾60mL，冰醋酸11.5mL，ddH2O28.5mL，混匀后4℃保存备用。2.1.5.3琼脂糖凝胶电泳试剂（1）50×TAE缓冲液：57.1mL冰乙酸加入到800mL水中，242gTris-Base，18.622gEDTA（pH8.0），利用磁力搅拌器剧烈搅拌，加水至至1L，121℃高压灭菌15min；（2）10mg/mL溴化乙锭EB：100mgEB加入到10mLddH2O中，充分搅拌到完全溶解，放在棕色瓶中，室温保存；（3）1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖溶解于100mL1×TAE中，微波炉加热，温度降至60℃左右时加入5μLEB贮液（10mg/mL），混匀。2.1.5.4抗生素类氨苄青霉素(Amp):配置浓度为100mg/ml，要称量1g氨苄青霉素，加到10ml灭菌过的ddH2O中溶解，再用0.22微米的细菌滤器过滤分装到EP管中，零下二十度保存。2.1.5.5培养基表2-6细菌培养基配方及用途表培养基名称成分用途LB液体培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶在800mLddH2O中，用10mol/mLNaOH调pH至7.0，补足水至1000mL大肠杆菌的摇菌培养LB固体培养基1000mLLB液体培养基中加入琼脂粉12~15g大肠杆菌的平板涂布培养SOB培养基胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl0.5g，溶在950mLddH2O中，加入250mmol/LKCl溶液10mL，用5mol/mLNaOH调节pH至7.0，补足水至1000mL感受态细胞制备过程中的摇菌培养SOC培养基SOB培养基经高压灭菌后，加入20mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液，按每100mLSOB加入1mL2mol/LMg2+的比例加入适量的Mg2+贮存液质粒转化过程中感受态细胞的复苏培养2.2实验方法2.2.1构建含有片段WPRE的重组载体2.2.1.1片段WPRE的PCR扩增以质粒pWHV8为模板，以LM-8和LM-10b为引物，进行PCR反应，PCR反应体系和PCR反应程序设置条件如下。表2-7PCR反应体系PCR反应体系组分加入体积终浓度5×PrimerSTARTMBuffer（Mg2+plus）10μL1×dNTPMixture（各2.5mM）4μL各0.2mmol/μLUpstreamprimer（10μM）1μL0.2pmol/μLDownstreamprimer（10μM）1μL0.2pmol/μLTemplate（重组Bacmid）2μL--PrimerSTARTMDNAPolymerase（2.5U/μL）0.5μL0.5U/μLddH2OUpto50μL--表2-8PCR反应程序步骤时间温度循环数预变性5min94°C1变性10sec94°C30退火5sec55°C延伸1min/kbp72°C终延伸10min72°C1取4.5μL反应产物，加入0.5μL10×loadingbuffer混合均匀，于1％琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.1.2片段WPREPCR产物的胶回收纯化应用上海华舜生物工程有限公司的柱式小量胶回收试剂盒（GelExtractionMiniKit）进行回收。回收步骤如下：（1）

把剩下的45微升PCR反应产物和5微升10倍浓缩的上样缓冲液充分混合，然后把混合液加到1%的大孔琼脂糖凝胶上，准备做电泳。（2）在紫外灯下面，把含有目标DNA的琼脂糖凝胶块切下来，尽量把它弄碎，然后放到1.5毫升的离心管里。（3）往离心管里加S1液，按照每100毫克琼脂糖加300微升S1液的比例加。加完后，把离心管放在50摄氏度的水浴里加热10分钟，每2分钟把离心管倒过来晃一晃，让琼脂糖块完全融化。（4）把融化后的琼脂糖溶液转移到吸附柱里，放到离心机里，用9000转每分离心30秒，把上面液体倒掉，再把吸附柱放回收集管。（5）500微升W1液加在吸附柱里，让它静置1分钟，接着把吸附柱放在离心机里，用9000转每分离心30秒，把上面液体倒掉，再把吸附柱放回收集管。（6）500微升W1液再加在吸附柱里，还是静置1分钟，再用9000转每分离心30秒，上面液体倒掉，把吸附柱放回收集管。（7）9000转每分离心1分钟。2.2.1.3片段pA的PCR扩增以质粒peGFP-C3为模板，以LM-10a和LM-9为引物，进行PCR反应，PCR反应体系和PCR反应程序设置条件同2.2.1.1。2.2.1.4片段pAPCR产物的胶回收纯化方法同2.2.1.2。2.2.1.5片段WPRE与pA的融合以LM-8和LM-9为两端的终引物，应用SOE-PCR将WPRE与pA两个片段连接在一起，连接后产物命名为“soe2”。表2-9SOE-PCR反应体系SOE-PCR反应体系组分加入体积终浓度5×PrimerSTARTMBuffer（Mg2+plus）10μL1×dNTPMixture（各2.5mM）4μL各0.2mmol/μLUpstreamprimer（LM-3,10μM）1μL0.2pmol/μLDownstreamprimer（LM-2,10μM）1μL0.2pmol/μLTemplate11.5μL（37ng）Template24μL（266ng）PrimerSTARTMDNAPolymerase0.5μL0.5U/μLddH2OUpto50μL--（2）PCR反应程序设置同2.2.1.1的（2）。（3）取4.5μL反应产物，加入0.5μL10×loadingbuffer混合均匀，于1％琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.1.6片段soe2的测序测序结果理想的重组子命名为“pT-soe2”。2.2.2重组转移载体pLM-ITRs的构建2.2.2.1片段ITRs的PCR扩增用LM-11和LM-12这两个引物，拿质粒pAAV-LacZ当作模板，通过PCR技术去扩增左侧的ITR（也就是ITR-L）。再用LM-13和LM-14这两个引物，同样通过PCR技术，去扩增右侧的ITR（即ITL-R）。PCR反应体系和反应程序的设置，跟之前2.2.1.1部分的条件是一样的。最后把PCR扩增得到的产物，放到1％的琼脂糖凝胶里，用电泳的方法检测。2.2.2.2片段ITRsPCR产物的胶回收纯化方法同2.2.1.2。2.2.2.3重组中间质粒pLM-ITR-L的构建（1）制备带粘性末端的载体和片段：要准备带有粘性末端的载体pLM（XbaI）和片段ITR-L（XbaI）。具体做法是，分别用XbaI这种酶去切割载体pLM和片段ITR-L。切割完得到的产物pLM（XbaI）和ITR-L（XbaI），放到1%的琼脂糖凝胶里进行电泳，看看切得对不对。鉴定完后，把我们想要的条带回收起来，放在4摄氏度的环境下保存，留着后面用。（2）去磷酸化处理：在离心管中加入反应组分，如表2-15，37℃反应30分钟，抽提2次酚/异戊醇（25/1,V/V）；抽提1次氯仿/异戊醇（24/1，V/V）；添加5μL3MNaOAC混匀；加入125μL冰乙醇，零下20℃下保存1小时；离心收集沉淀，用200μL的70%冰乙醇洗涤一次，放室温下充分干燥；用20μLddH2O溶解沉淀。表2-10单酶切产物去磷酸化反应体系去磷酸化反应体系组分体积单酶切产物1-20pmol10×AlkalinePhosphataseBuffer5μLCIAP（10U/μL）2μLddH2OUpto50μL（3）拼载体片段：把pLM（XbaI）载体和ITR-L（XbaI）片段“粘”到一起。（4）转化：把连好的产物“送进”细胞。（5）找阳性菌：挑白色单菌落，加氨苄青霉素的LB培养液里，37℃摇一整晚。（6）提重组质粒：用试剂盒从阳性菌液里提出重组质粒。（7）验质粒：用PstI和EcoRI两种酶切开质粒，检查是不是要的重组质粒。2.2.2.4重组转移载体pLM-ITRs的构建（1）切载体和片段：用RsrII酶分别切开pLM载体和ITR-R片段，切完跑1%琼脂糖凝胶电泳检查，再回收需要的条带，放4℃冰箱存着。（2）去磷酸化：按之前的操作步骤处理。（3）拼载体和片段：把切好的pLM-ITR-L（RsrII）和ITR-R（RsrII）连起来。（4）转化：按之前的方法把连好的产物导入细胞。（5）筛阳性菌：拿菌液当原料，用LM-8和LM-14引物做PCR，按之前的方法找出有重组质粒的菌液。（6）提质粒：用碱裂解法从阳性菌液里提取重组质粒，步骤和之前一样。（7）验质粒：用双酶切的老办法，检查重组质粒是不是对的。3.结果与分析3.1重组中间质粒pFB/LM-PH的构建3.1.1片段WPRE和pA的PCR扩增片段WPRE和pA进行PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物分别在650bp、250bp左右有明显条带，与预期大小相符，结果如图3-1。图3-1片段WPRE和PA的PCR结果MDNAMarkerDL2000;1片段WPRE的PCR产物;2片段PA的PCR产物.3.1.2片段WPRE与pA的融合片段WPRE与pA进行SOE-PCR扩增后获得片段soe2，1%琼脂糖凝胶电泳显示：soe2在850bp左右有明显条带，与预期大小相符，结果如图3-2。图3-2SOE-PCR结果MDNAMarkerDL2000;1片段WPRE和PA的SOE-PCR结果.3.1.3重组子pT-soe2的鉴定将胶回收产物做加“A”处理，与pMD18-T载体连接，再转入E.coliDH5α感受态细胞，提取出12个质粒。经1%琼脂糖凝胶电泳后，挑出6个电泳慢的质粒，用RsrII和EcoRI两种酶切割。酶切后，泳道1、2、4、5、6出现两条条带，大小分别对应T载体（2692bp）和soe2（850bp）。测序确认泳道5的质粒是“pT-soe2”，存放在零下20℃备用。图3-3pT-soe2的双酶切鉴定结果1~6pT-soe2的RsrII和EcoRI双酶切产物;MDNAMarkerDL2000plus.3.1.4片段ITR-L和ITR-R的PCR扩增片段ITR-L和ITR-R进行PCR扩增后，3%琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物分别在222bp、214bp左右有明显条带，与各个片段预期大小相符，结果如图3-4。图3-4片段ITR-L和ITR-R的PCR结果1片段ITR-L的PCR产物;2片段ITR-R的PCR产物;MDNAMarkerDL2000.3.1.5带有粘性末端的载体pLM和片段ITR-L的制备用XbaI这种酶分别切割载体pLM和片段ITR-L。切割后，载体pLM放到1%琼脂糖凝胶里电泳，只出现一条条带，大小和线性化的pLM（6.6kb）一致；ITR-L电泳后出现一条约220bp的条带，和预想的大小一样，结果如图3-5所示。最后把6.6kb和220bp这两条条带回收，留着后续使用。图3-5pLM和ITR-L单酶切结果MDNAMarkerDL15000;1pLM的XbaI单酶切产物;2ITR-L的XbaI单酶切产物.3.1.6菌液PCR法筛选含有pLM-ITR-L的阳性菌液拿11份转化后的菌液当模板做菌液PCR。要是菌液里有重组质粒pLM-ITR-L，而且ITR-L插入方向正确，PCR产物会出现一条大概750bp大小的条带。把PCR产物放到1%琼脂糖凝胶里电泳后发现，泳道2、4、8、10、11都出现了约750bp的条带，跟预想的结果一样，如图3-6所示。最后选取泳道8对应的菌液（pLM-ITR-L#8），提取里面的质粒，再用双酶切的方法进一步验证ITR-L的插入方向。图3-6菌液PCR结果MDNAMarkerDL2000;1~11pLM-ITR-L菌液PCR产物.3.1.7重组中间质粒pLM-ITR-L的鉴定用PstI和EcoRI两种酶切割质粒pLM-ITR-L#8。如果酶切后电泳出现6.0kb和800bp的条带，说明ITR-L是正方向插入载体；要是出现6.15kb和650bp的条带，就意味着ITR-L是反方向插入。酶切产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，果然出现两条条带，大小跟ITR-L正向连接时一致，这就证明ITR-L是正向插入到pLM载体里的，结果见图3-7。最后把这个验证好的重组质粒存到零下20℃冰箱，留着以后用。图3-7pLM-ITR-L的双酶切鉴定结果1pLM-ITR-L的PstI和EcoRI双酶切产物;MDNAMarkerDL2000+DL15000.3.1.8带有粘性末端的载体pLM-ITR-L和片段ITR-R的制备用RsrII这种酶分别切割载体pLM-ITR-L和片段ITR-R。切割后，把载体pLM-ITR-L放在1%琼脂糖凝胶里电泳，只出现一条条带，大小和线性化的pLM（6.8kb）一致；ITR-R电泳后出现一条约214bp的条带，和预想的大小相符，结果见图3-8。最后把6.8kb和214bp这两条条带回收，留着后续用。图3-8pLM-ITR-L和ITR-R单酶切结果1pLM的RsrII单酶切产物;2ITR-R的RsrII单酶切产物;M1DNAMarkerDL15000.3.1.9菌液PCR法筛选含有pLM-ITRs的阳性菌液拿6管转化后的菌液做PCR，要是菌液里有重组质粒pLM-ITR，而且ITR-R插对了方向，PCR产物会有条1000bp左右的条带。跑1%琼脂糖凝胶电泳后，每管都出现了这条带，见图3-9。挑出泳道1、2、3对应的菌液（pLM-ITRs#1、2、3），提取质粒，再用双酶切检查ITR-R是不是插对了。图3-9菌液PCR结果1~6pLM-ITRs菌液PCR产物;MDNAMarkerDL2000.3.1.10重组转移载体pLM-ITRs的鉴定拿PstI和EcoRI两种酶，去切pLM-ITRs#1、2、3这三个质粒。切完用电泳检测，如果看到5.1kb、988bp和803bp这三条条带，就说明ITR-L是正着插进载体里的；要是看到5.2kb、870bp和803bp这三条条带，那就是ITR-R反着插进载体了。实际电泳后，正好出现三条条带，大小和ITR-L正向插入时一样，说明确实是ITR-L正插在pLM载体里。结果见图3-10。最后把这些验证好的质粒，放在零下20℃冰箱存起来，留着后面用。图3-10pLM-ITRs的双酶切鉴定结果MDNAMarkerDL2000plus;1876bpDNA片段2~4pLM-ITRs的PstI和EcoRI双酶切产物.结论先扩增了WPRE元件和ITRs元件及pA片段，然后构建了重组中间质粒和重组转移载体“pLM”和“pLM-ITRs”，最后构建了重组杆状病毒表达载体，把扩增后的两个元件插入到重组杆状病毒中表达。获得了添加两个元件的重组杆状病毒表达载体，每个步骤电泳之后跑出来的结果和预想的一样，所以有望增加重组杆状病毒表达载体表达效果。参考文献沈佳,吕正兵,陈健等.杆状病毒表面展示系统研究进展[J].微生物学通报,2008,35(3):421-425.曹建斌,范晓军,梁爱华.杆状病毒及其应用[J].科技情报开发与经济,2007,17(18):131-132.占鹏飞,李家磊,易咏竹,等.基于合成生物学设计的家蚕和昆虫细胞杆状病毒表达系统研究进展[J]．蚕业科学,2022,48(２):170-177．张逸驰,李媛媛．昆虫细胞Ｇ杆状病毒表达系统的研究进展[J]．中国生物制品学杂志,2020,33(12):1454-1459．PIDR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