天冬氨酸族氨基酸发酵机制

第八章

天冬氨酸族氨基酸发酵机制重点：天冬氨酸族氨基酸生物合成路径及代谢调整机制；天冬氨酸族氨基酸生物合成代谢调整机制；酵母和霉菌赖氨酸生物合成路径和调整机制；赖氨酸生产菌育种路径；

难点：天冬氨酸族氨基酸生物合成代谢调整机制；第1页氨基酸本身合成在不一样生物体中，有较大差异，然而许多氨基酸合成路径在不一样生物体中也有共同之处。

按照起始物可将氨基酸合成份成几个家族：㈠谷氨酸族（α-酮戊二酸族）包含：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；㈡丙酮酸族包含：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；

第2页㈢天冬氨酸族（草酰乙酸族）包含：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；㈣磷酸甘油酸族包含：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；㈤芳香族包含：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，组氨酸合成为单独一条路径。第3页第一节生物合成路径（天冬氨酸族）及代谢调控机制一、生物合成路径

天冬氨酸族氨基酸合成能够以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，合成苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和赖氨酸。第4页葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸β-半醛

赖氨酸高丝氨酸蛋氨酸

苏氨酸异亮氨酸EMPCO2固定、氧化氨基化反应天冬氨酸激酶天冬氨酸β-半醛脱氢酶二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶高丝氨酸脱氢酶琥珀酰高丝氨酸合成酶高丝氨酸激酶苏氨酸脱氨酶第5页第6页二、天冬氨酸族生物合成代谢调整机制在细菌中，即使天冬氨酸族氨基酸生物合成路径是相同，不过其代谢调整机制是各种多样。1.大肠杆菌K12①天冬氨酸激酶（AK）

AKⅠ:受苏氨酸、异亮氨酸多价抑制和阻遏天冬氨酸激酶AKⅡ：受蛋氨酸专一性抑制和阻遏AKⅢ：受赖氨酸专一性抑制和阻遏第7页②天冬氨酸-β-半醛脱氢酶专一性受赖氨酸不完全抑制③二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶（赖氨酸分支第一个酶）DDP合成酶受赖氨酸反馈抑制。二氨基庚二酸（DAP）脱羧酶受赖氨酸阻遏第8页④高丝氨酸脱氢酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支第一个酶）

HDHDⅠ：受苏氨酸反馈抑制HDⅡ：受蛋氨酸阻遏⑤苏氨酸脱氨酶（异亮氨酸合成路径酶）受异亮氨酸反馈抑制和阻遏第9页第10页2.黄色短杆菌

其赖氨酸生物合成调整机制比大肠杆菌简单，其天冬氨酸激酶只有一个，该酶含有两个变构部位，能够与终产物结合，当只有一个终产物（赖氨酸或苏氨酸）与酶结合，酶活性不受影响。当两种终产物（赖氨酸和苏氨酸）同时过量时，与酶两个变构部位结合，该酶活性受到抑制，这种终产物反馈抑制称为协同反馈抑制。P74图6-3第11页第12页3.乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调整P75，图6-51）存在代谢优先向苏氨酸和蛋氨酸方向进行。2）与黄色短杆菌区分：AK受赖氨酸+苏氨酸反馈抑制存在代谢互锁，DDP合成酶合成受亮氨酸阻遏。DDP还原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。第13页第14页三、酵母和霉菌赖氨酸生物合成路径和调整机制所谓同型TCA循环路径进行，但生物合成酶与TCA循环酶完全两样。第15页第16页第二节赖氨酸生产菌育种路径出发菌株选择：要求代谢比较简单细菌（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等）

1.优先合成转换：渗漏缺点型选育。降低高丝氨酸脱氢酶活性，使代谢流转向优先合成赖氨酸。

高丝氨酸脱氢酶渗漏缺点型。

第17页2.切断支路代谢：营养缺点型选育。黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌，对天冬氨酸激酶反馈抑制是赖氨酸+苏氨酸协同作用，经过诱变使高丝氨酸脱氢酶缺失，切断通向苏氨酸、蛋氨酸代谢流，控制高丝氨酸（或苏氨酸+蛋氨酸）量，降低苏氨酸浓度，解除协同反馈作用，过量积累赖氨酸。第18页3.抗结构类似物突变株选育（代谢调整突变）。优点：突变株遗传性地解除了终产物对本身合成路径酶调整控制，不受培养基中所要求物质浓度影响，生产较稳定。经过诱变使天冬氨酸激酶编码结构基因发生突变，对赖氨酸及结构类似物不敏感，即使有过量苏氨酸存在，该酶也不与赖氨酸或结构类似物结合，但酶活性中心不变。第19页4.解除代谢互锁①选育亮氨酸缺点型菌株，或者以抗AEC赖氨酸生产菌为出发菌株，经诱变得到抗AEC兼抗亮氨酸缺点型菌株。②选育抗亮氨酸结构类似物突变株，从遗传上解除亮氨酸对DDP合成酶阻遏。③选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，这是一个寻找亮氨酸渗漏缺点型菌株有效方法。第20页5.增加前体物生物合成和阻塞产物生成：

方法：①选育丙氨酸缺点型；②选育抗天冬氨酸结构类似物突变株；③选育适宜CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株；1.经过TCA循环

葡萄糖→丙酮酸→草酰乙酸→天冬氨酸赖氨酸2.经过磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应

葡萄糖→磷酸烯醇式丙酮酸→草酰乙酸→天冬氨酸丙酮酸赖氨酸第21页6.改变细胞膜透过性7.选育温度敏感突变株天冬氨酸系分枝代谢路径中，末端产物种类多，调整机制复杂，为高效率生产赖氨酸，能够采取顺次解除各种调整机制诱变育种，取得多重标识突变株。第22页8.应用细胞工程和遗传工程育种9.预防高产菌株回复突变选育遗传性稳定菌株定向赋加生产菌多个遗传标识菌种培养和保藏时，培养基要丰富，尤其有足够要求营养物培养时添加抗生素，抑制恢复突变株生长，到达分纯目标。第23页第三节苏氨酸、蛋氨酸、高丝氨酸和天冬氨酸育种路径一、苏氨酸育种路径第24页第25页苏氨酸高产菌株应具备生化特征DDP合成酶活力极弱或欠缺琥珀酰高丝氨酸合成酶酶活力极弱或欠缺苏氨酸脱氨酶酶活力极弱或欠缺CO2固定能力强天冬氨酸合成能力强天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸协同反馈抑制不敏感高丝氨酸脱氢酶活力强，不受苏氨酸反馈调整。第26页二、高丝氨酸菌种选育路径第27页DDP合成酶活力极弱或欠缺琥珀酰高丝氨酸合成酶酶活力极弱或欠缺高丝氨酸激酶欠缺CO2固定能力强天冬氨酸合成能力强天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸协同反馈抑制不敏感高丝氨酸脱氢酶活力强，不受苏氨酸和蛋氨酸反馈调整。高产高丝氨酸菌株应具备生化特征第28页三、蛋氨酸育种路径第29页高产蛋氨酸应具备生化特征DDP合成酶活力极弱或欠缺S-腺苷蛋氨酸酶活力极弱或欠缺