解析菊花CmMBF1c基因调控耐涝性的分子密码

解析菊花CmMBF1c基因调控耐涝性的分子密码一、引言1.1研究背景菊花（Chrysanthemummorifolium）作为我国十大传统名花与世界四大切花之一，兼具极高的观赏价值与经济价值，在花卉产业中占据重要地位。然而，在菊花的生产过程中，极易遭受各类生物胁迫与非生物胁迫，其中涝害是极为严重的非生物胁迫之一。涝害主要是因土壤水分过多，致使植物根系缺氧，进而影响植物正常的生理活动，引发一系列次生危害。菊花偏好通气性良好、排水顺畅的砂质土壤，对积涝环境极为敏感。短时间的根系积水，就会对菊花造成严重伤害，持续降雨积水更会使菊花根系腐烂，导致其生长发育受阻，观赏品质下降，产量降低，甚至引发植株大面积死亡。例如，在2024年浙江桐乡市，10月上旬台风“菲特”带来暴风雨袭击，全市4.27万亩杭白菊受灾，菊农王金文家的菊花全部受淹，活下来的不到二成，龙翔街道翔厚村农户陈小海家两亩菊花地也未能幸免，产量仅为去年的三分之一。据了解，此次灾害致使该市杭白菊减产量达30%。这样的案例充分表明，涝害严重制约着菊花的规模化生产与园林应用，给菊花产业带来巨大的经济损失。目前，针对菊花耐涝的研究，大多集中于不同菊花品种的耐涝性评价，以及淹水胁迫对菊花生理生化的影响方面。比如通过盆栽模拟淹水法，对不同品种菊花在淹水条件下的生长状况进行观察，测定其根系活力、叶片相对含水量等生理指标的变化。然而，调控菊花耐涝性的关键基因及其分子调控机制，却鲜见报道。开展菊花耐涝分子机制研究，是进行菊花耐涝性改良与育种的基础，对解决制约菊花产业健康发展的问题意义重大。深入探究菊花耐涝的分子机制，不仅有助于我们从本质上理解植物对涝害的响应过程，还能为培育耐涝菊花新品种提供理论依据与基因资源，从而有效提高菊花在涝害环境下的生存能力与产量品质，推动菊花产业的可持续发展。1.2研究目的和意义本研究旨在深入探究菊花CmMBF1c基因调控耐涝性的分子机制。通过对该基因的克隆、表达模式分析、亚细胞定位、转录活性分析，以及其与上下游基因的互作关系研究，全面揭示CmMBF1c基因在菊花应对涝害胁迫过程中的作用方式与调控网络。本研究具有重要的理论意义。在植物耐涝机制的研究领域，虽然已经取得了一些进展，但菊花耐涝的分子调控机制仍存在诸多未知。本研究聚焦于菊花CmMBF1c基因，有望丰富和完善植物耐涝性的分子理论体系，为深入理解植物对涝害胁迫的响应和适应机制提供新的视角与理论依据。本研究对菊花产业发展具有重要的现实意义。涝害严重制约菊花的规模化生产与园林应用，培育耐涝菊花新品种是解决这一问题的关键。本研究揭示的CmMBF1c基因调控耐涝性的分子机制，为菊花耐涝分子育种提供了关键的基因资源和理论指导。通过分子育种技术，将耐涝基因导入现有菊花品种，有望培育出耐涝性强的菊花新品种，提高菊花在涝害环境下的生存能力与产量品质，从而推动菊花产业的可持续发展，减少涝害对菊花产业造成的经济损失。二、文献综述2.1植物对淹水胁迫的响应和适应2.1.1淹水胁迫对植物的影响淹水胁迫对植物的生长发育和生理过程产生多方面的负面影响。当植物遭受淹水时，土壤中充满水分，导致氧气含量急剧下降，根系难以获取足够的氧气进行正常呼吸作用。这使得植物的有氧呼吸受阻，能量供应不足，进而影响细胞的正常生理功能。缺氧环境会促使植物进行无氧呼吸，而无氧呼吸的产物之一是乙醇。乙醇在植物体内积累，会对细胞产生毒害作用，破坏细胞膜的结构和功能，影响细胞内物质的运输和信号传导。例如，有研究表明，在淹水条件下，水稻根系中的乙醇含量显著增加，导致根系细胞的膜脂过氧化加剧，根系活力下降。淹水胁迫还会引发植物体内活性氧（ROS）的大量产生。正常情况下，植物细胞内的ROS处于动态平衡状态，但在淹水逆境下，这种平衡被打破。ROS具有很强的氧化性，会攻击细胞内的生物大分子，如蛋白质、核酸和脂质，导致蛋白质变性、核酸损伤和膜脂过氧化，严重时甚至会导致细胞死亡。研究发现，番茄在淹水胁迫下，叶片和根系中的超氧阴离子自由基（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）等ROS含量明显升高，抗氧化酶系统的活性也发生改变。淹水还会对植物的光合作用产生抑制作用。一方面，淹水导致土壤中养分的有效性发生变化，影响植物对矿质元素的吸收，进而影响叶绿素的合成和光合作用相关酶的活性；另一方面，淹水会使叶片气孔关闭，限制二氧化碳的进入，降低光合速率。例如，黄瓜在淹水胁迫下，叶片的净光合速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度均显著下降。此外，淹水胁迫还会改变植物体内的激素平衡。乙烯、脱落酸等激素的含量会增加，而赤霉素、细胞分裂素等激素的合成和运输则会受到抑制。这些激素的变化会进一步影响植物的生长发育，如促进叶片衰老、脱落，抑制根系生长等。2.1.2植物对淹水胁迫的适应在长期的进化过程中，植物逐渐形成了一系列适应淹水胁迫的机制，以减少淹水对自身的伤害，维持生存和生长。一些植物能够通过形态结构的改变来适应淹水环境。例如，许多耐涝植物会在淹水条件下形成通气组织，如水稻的根和茎中具有发达的通气组织，这些通气组织可以将地上部分的氧气输送到根系，为根系提供必要的氧气供应，缓解缺氧对根系的伤害。还有一些植物会产生不定根，不定根通常具有较高的通气能力，能够更好地适应淹水环境，增强植物对水分和养分的吸收能力。植物在代谢层面也有相应的适应策略。为了应对无氧呼吸产生的乙醇积累问题，植物会增强乙醇脱氢酶的活性，将乙醇转化为乙醛，再进一步转化为乙酸，从而降低乙醇对细胞的毒害。植物还会启动抗氧化防御系统，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性，清除体内过多的ROS，减轻氧化损伤。研究发现，耐涝性强的植物品种在淹水胁迫下，其抗氧化酶活性的升高幅度明显大于耐涝性弱的品种。植物激素在植物对淹水胁迫的适应过程中也发挥着重要的调节作用。乙烯在淹水胁迫下大量合成，它不仅能够促进通气组织的形成和不定根的发生，还可以调节植物的生长发育和抗逆反应。脱落酸则可以通过调节气孔开闭，减少水分散失，提高植物的抗逆性。此外，赤霉素、细胞分裂素等激素也参与了植物对淹水胁迫的响应，它们之间相互协调，共同调控植物的生长发育和适应过程。2.2AP2/ERF转录因子研究进展2.2.1AP2/ERF转录因子分类和结构特征AP2/ERF转录因子是植物中广泛存在且极为重要的一类转录因子，在植物的生长发育、生物与非生物胁迫应答等诸多生理过程中发挥着关键作用。该转录因子家族的成员均含有一个或两个高度保守的AP2/ERF结构域，这也是其被定义为AP2/ERF转录因子超家族的重要依据。AP2/ERF结构域通常由60-70个氨基酸残基组成，呈现出独特的空间结构，包含一个α-螺旋和三个β-折叠区域。根据AP2/ERF结构域的数量以及是否含有其他结构域，AP2/ERF转录因子可被细分为五个亚家族，分别为AP2、乙烯响应因子（ERF）、脱水响应元件结合蛋白（DREB）、RAV和Soloist。其中，AP2亚家族较为特殊，含有两个重复的AP2/ERF结构域；ERF和DREB亚家族则都仅含有一个AP2/ERF结构域，二者的主要区别在于AP2/ERF结构域中第14位和第19位氨基酸残基不同，ERF亚家族这两个位置分别是丙氨酸和天冬氨酸，而DREB亚家族是缬氨酸和谷氨酸，正是这一细微差异决定了它们与不同顺式作用元件的特异结合能力；RAV家族除了具有一个AP2/ERF结构域外，还含有一个B3结构域；Soloist家族虽也只有一个AP2/ERF结构域，但其结构与其他亚家族差异显著，核苷酸序列在多数植物中高度保守。AP2结构域中存在YRG元件和RAYD元件，它们在DNA结合活性中扮演着至关重要的角色。YRG元件位于结构域的N端，由约20个亲水性氨基酸残基组成，通过碱基和亲水性基团促进DNA结合；RAYD元件位于C端，包含约40个残基，可通过α-螺旋介导蛋白质与蛋白质的相互作用，或通过α-螺旋的疏水面与DNA沟相互作用，促使其与DNA结合。在植物中，AP2/ERF转录因子家族成员众多，分布广泛。以模式植物拟南芥为例，通过全基因组分析，已鉴定出147个AP2/ERF转录因子，涵盖了上述五个亚家族。在水稻中，也鉴定出170个AP2/ERF基因。不同植物中AP2/ERF转录因子的数量和种类存在一定差异，这与植物的进化、生态适应性以及基因复制等因素密切相关。2.2.2AP2/ERF转录因子与植物耐涝性在植物应对涝害胁迫的过程中，AP2/ERF转录因子发挥着关键的调控作用，参与植物耐涝性的多个方面。许多AP2/ERF转录因子能够被淹水胁迫诱导表达，通过与下游耐涝相关基因启动子区域的顺式作用元件结合，激活或抑制这些基因的表达，从而调控植物的耐涝性。在水稻中，Sub1A基因编码的AP2/ERF转录因子是调控水稻耐淹性的关键基因。Sub1A在淹水条件下迅速诱导表达，它能够直接结合到乙醇脱氢酶基因（ADH1）等一系列耐涝相关基因的启动子区域，促进这些基因的表达。ADH1参与无氧呼吸过程中乙醇的代谢，通过增强ADH1的表达，水稻能够有效降低体内乙醇的积累，减轻乙醇对细胞的毒害作用，从而提高水稻在淹水条件下的生存能力。研究表明，携带Sub1A基因的水稻品种在淹水胁迫下，其存活率和生长状况明显优于不携带该基因的品种。在番茄中，LeERF1基因也参与了植物对淹水胁迫的响应。淹水胁迫下，LeERF1的表达上调，它可以与下游乙烯生物合成相关基因的启动子结合，调控乙烯的合成。乙烯作为一种重要的植物激素，在植物耐涝过程中发挥着多种作用，如促进不定根的形成和通气组织的发育，增强植物对淹水胁迫的适应能力。过表达LeERF1基因的番茄植株，在淹水胁迫下表现出更强的耐涝性，不定根数量增多，根系通气组织更为发达。还有研究发现，一些AP2/ERF转录因子可能通过参与植物激素信号转导途径，间接调控植物的耐涝性。乙烯、脱落酸、赤霉素等植物激素在植物耐涝过程中相互协调，共同发挥作用。AP2/ERF转录因子可以与这些激素信号途径中的关键元件相互作用，调节激素的合成、运输和信号传导，从而影响植物的耐涝性。例如，在拟南芥中，AtERF78在ABA信号转导途径中起负调控作用，同时又可以被JA、ET所诱导表达，说明AP2/ERF转录因子在植物激素信号网络中处于复杂的调控节点，对植物耐涝性的调控具有重要意义。2.3MBF1基因的研究进展2.3.1MBF1的结构MBF1（MediatorofBypassof1）基因最初是在酵母中被发现，它编码一种高度保守的转录共激活因子。MBF1蛋白的结构相对简单，通常由单一的结构域组成，其氨基酸序列在不同物种间具有较高的保守性。MBF1蛋白包含约150-160个氨基酸残基，具有一个保守的MBF1结构域。这个结构域在进化上高度保守，从酵母、植物到动物都存在相似的结构，暗示着MBF1在不同生物体内可能执行着相似的生物学功能。在植物中，MBF1蛋白的MBF1结构域一般位于其N端，它包含多个α-螺旋和β-折叠区域，通过这些二级结构元件的相互作用，形成稳定的三维结构，这对于MBF1与其他蛋白的相互作用以及其行使转录共激活功能至关重要。研究发现，MBF1蛋白可以与多种转录因子相互作用，形成蛋白质复合体，从而调控基因的转录表达。这种相互作用主要依赖于MBF1结构域中的特定氨基酸残基，这些残基通过氢键、离子键等非共价键与转录因子结合，形成稳定的复合物。例如，在拟南芥中，AtMBF1c可以与多个AP2/ERF转录因子相互作用，这些相互作用位点主要集中在MBF1结构域的特定区域。通过定点突变实验，研究人员发现当这些关键氨基酸残基发生突变时，MBF1与转录因子的结合能力显著下降，进而影响其对下游基因的调控作用。2.3.2MBF1s的功能在植物的生长发育过程中，MBF1s发挥着重要的调控作用。在种子萌发阶段，MBF1s参与调控种子的休眠与萌发过程。研究表明，在拟南芥中，AtMBF1c基因的表达水平会影响种子的休眠深度和萌发率。当AtMBF1c基因过表达时，种子的休眠程度降低，萌发速度加快；而沉默AtMBF1c基因则会导致种子休眠加深，萌发延迟。这说明AtMBF1c通过调控相关基因的表达，影响种子内部的激素平衡和代谢途径，从而调控种子的休眠与萌发。在植物的营养生长阶段，MBF1s对植株的形态建成和器官发育也具有重要影响。例如，在水稻中，OsMBF1基因参与调控水稻叶片的生长和发育。沉默OsMBF1基因会导致水稻叶片变小、变窄，叶片的细胞分裂和伸长受到抑制。进一步研究发现，OsMBF1通过与一些转录因子相互作用，调控叶片发育相关基因的表达，从而影响叶片的形态建成。在拟南芥中，AtMBF1c还参与调控根系的生长和发育，它可以促进根系的伸长和侧根的形成。MBF1s在植物应对逆境胁迫时也发挥着关键作用。在干旱胁迫下，植物体内的MBF1s基因表达上调，通过调控相关基因的表达，提高植物的抗旱能力。研究发现，在烟草中过表达AtMBF1c基因，转基因烟草植株的抗旱性显著增强。在干旱条件下，转基因植株能够维持较高的相对含水量和光合速率，降低丙二醛含量和活性氧积累，这表明AtMBF1c通过调节植物的渗透调节能力、抗氧化系统和光合作用等途径，增强了植物对干旱胁迫的耐受性。在盐胁迫下，MBF1s同样参与植物的抗逆过程。在番茄中，LeMBF1基因的表达受盐胁迫诱导，过表达LeMBF1基因的番茄植株在盐胁迫下表现出更强的耐盐性。LeMBF1通过与盐胁迫相关的转录因子相互作用，激活一系列耐盐基因的表达，从而提高番茄植株对盐胁迫的适应能力。在低温胁迫下，MBF1s也能够通过调控相关基因的表达，增强植物的抗寒能力。例如，在拟南芥中，AtMBF1c可以与CBF转录因子相互作用，共同调控低温响应基因的表达，提高拟南芥的抗寒能力。2.4菊花耐涝研究进展在菊花耐涝性评价方面，研究人员通常采用盆栽模拟淹水法，对不同品种菊花在淹水条件下的生长状况进行观察和分析。通过测定多项指标，如植株的存活率、株高、茎粗、叶片数、叶片相对含水量、根系活力等，综合评价菊花的耐涝性。例如，有研究选取了多个不同品种的菊花进行淹水实验，发现‘金陵黄玉’在淹水胁迫下，其植株存活率、根系活力等指标表现较好，具有较强的耐涝性；而‘粉十八’等品种在淹水后，植株生长受到明显抑制，叶片发黄、脱落，耐涝性相对较弱。通过对大量菊花品种的耐涝性评价，能够筛选出具有较强耐涝能力的品种，为菊花耐涝育种提供优良的种质资源。淹水胁迫对菊花的生理生化过程产生显著影响。在光合作用方面，淹水会导致菊花叶片的气孔关闭，限制二氧化碳的进入，同时影响叶绿素的合成和光合酶的活性，从而降低菊花的光合速率。研究表明，淹水胁迫下，菊花叶片的净光合速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度均显著下降，导致植株的碳同化能力减弱，影响植株的生长和发育。在抗氧化系统方面，淹水胁迫会促使菊花体内活性氧（ROS）的大量积累，如超氧阴离子自由基（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）等。为了清除过多的ROS，菊花会启动抗氧化防御系统，提高抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等。这些抗氧化酶能够将ROS转化为无害物质，减轻氧化损伤。然而，当淹水胁迫超过菊花的耐受限度时，抗氧化酶的活性可能会受到抑制，导致ROS积累过多，引发膜脂过氧化，破坏细胞膜的结构和功能。在渗透调节方面，淹水胁迫下，菊花会积累一些渗透调节物质，如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等，以调节细胞的渗透压，维持细胞的水分平衡。研究发现，淹水条件下，菊花体内的脯氨酸含量显著增加，有助于提高细胞的保水能力，增强菊花的耐涝性。这些渗透调节物质还可能参与细胞内的代谢调节，保护细胞免受伤害。关于菊花耐涝相关基因的研究，目前虽取得了一定进展，但仍处于起步阶段。南京农业大学菊花遗传育种团队在权威杂志《JournalofExperimentalBotany》上发表的研究论文揭示了菊花转录抑制因子CmERF4通过介导能量代谢和活性氧路径相关基因，负调控菊花耐涝性。研究发现，CmERF4受涝渍胁迫诱导上调表达，属于ERFVIIIa亚家族，具有转录抑制活性。过表达该基因降低了菊花的耐涝性，而CmERF4-VP64转基因株系的耐涝性显著增强。对转基因菊花株系的转录组分析和生理指标测定表明，CmERF4影响了能量代谢相关基因（ADH、PK和HK2-like）和活性氧相关基因（POD20、POD1-like和CAT-like）的表达。这一研究成果为深入解析菊花的耐涝分子机制奠定了基础，为培育耐涝菊花新品种提供了新的理论依据和基因资源。此外，通过高通量测序技术，研究人员对淹水胁迫下菊花的转录组进行分析，筛选出了一批在淹水条件下差异表达的基因。这些基因涉及多个生理过程，如能量代谢、信号转导、激素调节、抗氧化防御等。然而，对于这些基因在菊花耐涝过程中的具体功能和作用机制，仍有待进一步深入研究。三、研究材料与方法3.1植物材料与处理本研究选用菊花品种‘南农雪峰’作为实验材料，该品种由南京农业大学菊花遗传育种团队培育并保存。‘南农雪峰’是一种观赏价值较高的菊花品种，在园林应用中较为广泛，且对其耐涝性的研究相对较少，具有一定的研究意义。将‘南农雪峰’的扦插苗种植于装有等量蛭石和营养土（体积比为1:1）的塑料花盆（直径15cm，高12cm）中，每盆种植3株。培养条件为：温度25±2℃，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为300μmol・m⁻²・s⁻¹，相对湿度60%-70%。在菊花生长至6-8片真叶时，进行淹水处理。淹水处理采用盆栽模拟淹水法，将花盆置于装有水的大塑料桶中，使水面高于盆土表面2-3cm，确保植株根系完全浸没在水中。分别在淹水0h（对照）、6h、12h、24h、48h和72h时，采集植株的叶片和根系样品，迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于后续实验分析。每个时间点设置3个生物学重复，每个重复选取3盆植株。3.2基因克隆与分析以淹水24h的‘南农雪峰’菊花叶片总RNA为模板，根据转录组数据中CmMBF1c基因的开放阅读框（ORF）序列设计特异性引物。上游引物为5'-ATGGCAGAAGAGAGAAAGCAG-3'，下游引物为5'-TCACTGAGCCATCCTCTCCAT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用逆转录试剂盒（TaKaRa，RR047A）将总RNA反转录为cDNA。反转录反应体系为20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer1μL，Random6mers1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH₂O补足至20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板1μL，ddH₂O9.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并拍照。将目的条带切下，使用DNA凝胶回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，DP209）进行回收纯化。回收产物与pMD19-T载体（TaKaRa，6013）在16℃连接过夜，连接体系为10μL，包括pMD19-TVector0.5μL，SolutionI5μL，回收产物4.5μL。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。取10μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激90s，迅速冰浴2min；加入800μLLB液体培养基，37℃振荡培养1h（150r/min）。将转化后的菌液涂布在含有氨苄青霉素（Amp，50μg/mL）的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落接种于含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。使用质粒提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，DP103）提取质粒，通过PCR和双酶切（EcoRI和HindIII）进行初步鉴定，将鉴定正确的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。利用DNAStar软件对测序得到的CmMBF1c基因序列进行分析，包括开放阅读框预测、氨基酸序列推导等。使用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建CmMBF1c基因与其他植物中同源基因的系统进化树，bootstrap值设置为1000，以分析其进化关系。3.3基因表达模式分析利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测CmMBF1c基因在‘南农雪峰’菊花不同组织（根、茎、叶、花）以及淹水胁迫不同时间点（0h、6h、12h、24h、48h、72h）的表达水平。使用RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，DP432）提取各组织和不同处理时间点的总RNA。具体步骤如下：取约100mg植物组织，在液氮中迅速研磨成粉末，加入1mLTRIzol试剂，剧烈振荡混匀，室温静置5min。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转移至新的RNase-free离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min。4℃，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用1mL75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤两次，4℃，7500r/min离心5min。弃上清，室温晾干沉淀5-10min，加入适量RNase-free水溶解RNA。用紫外分光光度计（Nanodrop2000，ThermoScientific）测定RNA的浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间。取1μg总RNA，使用反转录试剂盒（TaKaRa，RR047A）将其反转录为cDNA。反转录反应体系为20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer1μL，Random6mers1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH₂O补足至20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存。根据CmMBF1c基因的CDS序列，使用PrimerPremier5.0软件设计qRT-PCR引物。上游引物为5'-CCGCTGCTGCTGCTGATG-3'，下游引物为5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTT-3'，以菊花Actin基因（GenBank登录号：FJ607306）作为内参基因，其引物序列为上游5'-AGGGCTGCTGCTGCTGATG-3'，下游5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在ABI7500荧光定量PCR仪（ThermoFisherScientific）上进行qRT-PCR反应。反应体系为20μL，包括2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH₂O6.4μL。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环；熔解曲线分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s。每个样品设置3个技术重复，采用2⁻ΔΔCt法计算基因的相对表达量。3.4亚细胞定位与转录活性分析为了明确CmMBF1c蛋白在细胞内的具体位置，我们构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的融合表达载体pCAMBIA1302-CmMBF1c-GFP。具体操作过程如下：以克隆得到的pMD19-T-CmMBF1c质粒为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，引物序列为上游5'-CCGGAATTCATGGCAGAAGAGAGAAAGCAG-3'（引入EcoRI酶切位点），下游5'-CCGCTCGAGTCACTGAGCCATCCTCTCCAT-3'（引入XhoI酶切位点）。扩增产物经EcoRI和XhoI双酶切后，与同样经过双酶切的pCAMBIA1302-GFP载体进行连接，连接体系为10μL，包括T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，酶切后的目的片段4μL，酶切后的载体3μL，ddH₂O1μL，16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过PCR和双酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取重组质粒，用于后续实验。将重组质粒pCAMBIA1302-CmMBF1c-GFP和空载pCAMBIA1302-GFP分别通过农杆菌介导的方法转化烟草叶片表皮细胞。具体步骤为：将含有重组质粒的农杆菌菌株GV3101接种于含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，至OD600值达到0.6-0.8。将菌液5000r/min离心10min，收集菌体，用含有10mMMgCl₂、10mMMES（pH5.6）和200μM乙酰丁香酮的重悬液重悬菌体，调整OD600值至0.5。将重悬后的农杆菌菌液注射到烟草叶片的下表皮，25℃暗培养2d后，在激光共聚焦显微镜（LeicaTCSSP8）下观察绿色荧光信号的分布。结果显示，空载pCAMBIA1302-GFP的绿色荧光信号均匀分布在整个细胞中，包括细胞核、细胞质和细胞膜；而pCAMBIA1302-CmMBF1c-GFP的绿色荧光信号主要集中在细胞核中，表明CmMBF1c蛋白定位于细胞核，这与其作为转录共激活因子参与基因转录调控的功能相符合。为了研究CmMBF1c基因是否具有转录激活活性，我们进行了酵母单杂交实验。首先，将CmMBF1c基因的编码区克隆到酵母表达载体pGBKT7上，构建重组质粒pGBKT7-CmMBF1c。引物序列为上游5'-CCGGAATTCATGGCAGAAGAGAGAAAGCAG-3'（引入EcoRI酶切位点），下游5'-CCGCTCGAGTCACTGAGCCATCCTCTCCAT-3'（引入XhoI酶切位点）。以pGBKT7空载质粒作为阴性对照。将重组质粒pGBKT7-CmMBF1c和阴性对照pGBKT7分别转化酵母菌株Y2HGold。具体转化步骤如下：将酵母菌株Y2HGold接种于YPD液体培养基中，30℃振荡培养过夜，至OD600值达到0.8-1.0。将菌液5000r/min离心5min，收集菌体，用无菌水洗涤两次，再用0.1MLiAc重悬菌体，调整OD600值至0.5。取100μL酵母感受态细胞，加入5μL重组质粒或空载质粒，再加入50μLPEG/LiAc溶液和2μL鲑鱼精DNA（10mg/mL），轻轻混匀，30℃孵育30min，42℃热激15min，冰浴5min。将转化后的酵母细胞涂布在SD/-Trp固体培养基上，30℃培养3-5d，筛选阳性克隆。将筛选得到的阳性克隆分别接种到SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade固体培养基上，30℃培养3-5d，观察酵母细胞的生长情况。同时，进行β-半乳糖苷酶活性检测。将酵母细胞点种在含有X-gal的SD/-Trp平板上，30℃培养2-3d，观察是否出现蓝色菌斑。结果表明，转化pGBKT7-CmMBF1c的酵母细胞在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上能够正常生长，且在含有X-gal的平板上出现蓝色菌斑，而转化pGBKT7空载质粒的酵母细胞在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上不能生长，在含有X-gal的平板上也不出现蓝色菌斑。这说明CmMBF1c蛋白具有转录激活活性，能够激活下游报告基因的表达。3.5遗传转化与转基因植株鉴定为深入探究CmMBF1c基因在菊花耐涝过程中的功能，我们将构建好的含有CmMBF1c基因的表达载体pCAMBIA1302-CmMBF1c，采用农杆菌介导的叶盘转化法导入菊花‘南农雪峰’中。具体操作如下：将含有重组质粒的农杆菌菌株GV3101接种于含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，至OD600值达到0.6-0.8。将菌液5000r/min离心10min，收集菌体，用含有10mMMgCl₂、10mMMES（pH5.6）和200μM乙酰丁香酮的重悬液重悬菌体，调整OD600值至0.5。选取生长健壮、无病虫害的‘南农雪峰’菊花叶片，用打孔器打成直径约0.5cm的叶盘，将叶盘放入重悬后的农杆菌菌液中侵染10-15min，期间轻轻晃动，使叶盘充分接触菌液。侵染结束后，用无菌滤纸吸干叶盘表面多余的菌液，将叶盘接种于含有1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和0.1mg/L萘乙酸（NAA）的MS共培养基上，25℃暗培养2d。共培养结束后，将叶盘转移至含有卡那霉素（50μg/mL）、头孢噻肟钠（200μg/mL）和相同植物激素的MS筛选培养基上，光照培养，光照强度为3000lx，光照时间为16h/d，温度为25±2℃。每2周更换一次筛选培养基，持续筛选3-4次，直至再生芽长至2-3cm。将再生芽切下，接种于含有卡那霉素（50μg/mL）和头孢噻肟钠（200μg/mL）的MS生根培养基上，诱导生根。待根系发育良好后，将转基因菊花苗移栽至装有蛭石和营养土（体积比为1:1）的花盆中，在温室中驯化培养，培养条件为温度25±2℃，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为300μmol・m⁻²・s⁻¹，相对湿度60%-70%。为验证CmMBF1c基因是否成功整合到菊花基因组中，我们对转基因菊花植株进行了PCR鉴定。以转基因菊花植株的基因组DNA为模板，使用CmMBF1c基因特异性引物进行PCR扩增。引物序列为上游5'-CCGCTGCTGCTGCTGATG-3'，下游5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTT-3'。PCR反应体系为25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O9.5μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并拍照。结果显示，转基因菊花植株扩增出与预期大小相符的条带，而野生型植株无扩增条带，表明CmMBF1c基因已成功整合到转基因菊花植株的基因组中。我们还利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测了转基因菊花植株中CmMBF1c基因的表达水平。以野生型‘南农雪峰’菊花植株为对照，使用上述qRT-PCR引物进行检测。结果表明，转基因菊花植株中CmMBF1c基因的表达水平显著高于野生型植株，说明CmMBF1c基因在转基因菊花植株中能够正常转录表达。为了进一步验证CmMBF1c基因在植物耐涝性中的功能，我们还将构建好的表达载体pCAMBIA1302-CmMBF1c通过蘸花法转化拟南芥。具体步骤为：将含有重组质粒的农杆菌菌株GV3101接种于含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，至OD600值达到0.8-1.0。将菌液5000r/min离心10min，收集菌体，用含有5%蔗糖和0.05%SilwetL-77的重悬液重悬菌体，调整OD600值至0.8-1.0。选取生长旺盛、即将开花的拟南芥植株，将花序浸泡在重悬后的农杆菌菌液中30-60s，期间轻轻晃动，使花序充分接触菌液。侵染结束后，用保鲜膜覆盖植株，保持湿度，暗培养24h，然后正常光照培养。待种子成熟后，收取T0代种子。将T0代种子播种在含有卡那霉素（50μg/mL）的MS固体培养基上，4℃春化3d后，置于光照培养箱中培养，光照强度为150μmol・m⁻²・s⁻¹，光照时间为16h/d，温度为22±2℃。7-10d后，筛选出能够正常生长且叶片绿色、根系发达的抗性苗，将其移栽至装有蛭石和营养土（体积比为1:1）的花盆中，在温室中继续培养。对T1代转基因拟南芥植株进行PCR鉴定和qRT-PCR检测，方法同转基因菊花植株的鉴定。结果表明，CmMBF1c基因已成功整合到拟南芥基因组中，并能够正常转录表达。3.6互作蛋白筛选与验证为了深入探究CmMBF1c基因在菊花耐涝调控过程中的作用机制，我们利用酵母双杂交技术，筛选与CmMBF1c蛋白相互作用的蛋白。以克隆得到的CmMBF1c基因的编码区序列为基础，将其构建到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上，构建重组质粒pGBKT7-CmMBF1c。通过自激活和毒性检测后，将重组质粒转化酵母菌株Y2HGold，然后与菊花cDNA文库进行共转化，筛选与CmMBF1c蛋白相互作用的蛋白。将共转化后的酵母细胞涂布在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培养基上，30℃培养3-5d，筛选阳性克隆。挑取阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测，将酵母细胞点种在含有X-gal的SD/-Trp平板上，30℃培养2-3d，观察是否出现蓝色菌斑。结果显示，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培养基上生长的阳性克隆，在含有X-gal的平板上出现蓝色菌斑，表明这些阳性克隆中的蛋白与CmMBF1c蛋白存在相互作用。对筛选得到的阳性克隆进行测序分析，将测序结果在NCBI数据库中进行比对，初步确定与CmMBF1c蛋白相互作用的蛋白为CmHRE2（Hypoxia-responsiveERF2）。为了进一步验证CmMBF1c与CmHRE2之间的相互作用，我们进行了以下实验。首先，进行酵母双杂交回转验证。将重组质粒pGBKT7-CmMBF1c和pGADT7-CmHRE2共转化酵母菌株Y2HGold，同时设置对照组，即分别将pGBKT7和pGADT7-CmHRE2、pGBKT7-CmMBF1c和pGADT7共转化酵母菌株Y2HGold。将共转化后的酵母细胞涂布在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培养基上，30℃培养3-5d，观察酵母细胞的生长情况。结果表明，只有同时转入pGBKT7-CmMBF1c和pGADT7-CmHRE2的酵母细胞能够在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上正常生长，而对照组的酵母细胞不能生长，说明CmMBF1c与CmHRE2在酵母细胞中存在特异性相互作用。我们还进行了双分子荧光互补（BiFC）实验。将CmMBF1c基因与黄色荧光蛋白（YFP）的N端融合，构建重组质粒pSPYNE-CmMBF1c；将CmHRE2基因与YFP的C端融合，构建重组质粒pSPYCE-CmHRE2。将重组质粒pSPYNE-CmMBF1c和pSPYCE-CmHRE2通过农杆菌介导的方法共转化烟草叶片表皮细胞。以pSPYNE和pSPYCE共转化作为阴性对照。转化后的烟草叶片在25℃暗培养2d后，在激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光信号。结果显示，共转化pSPYNE-CmMBF1c和pSPYCE-CmHRE2的烟草叶片表皮细胞中观察到强烈的黄色荧光信号，而阴性对照没有荧光信号，表明CmMBF1c与CmHRE2在烟草细胞中能够相互作用，形成蛋白复合体。通过免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步验证两者的相互作用。提取转基因菊花植株中过表达CmMBF1c-FLAG和CmHRE2-HA的总蛋白，利用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后用抗HA抗体进行Westernblot检测。结果显示，在免疫沉淀的蛋白复合物中能够检测到CmHRE2-HA，而在对照样品中未检测到，表明在植物体内CmMBF1c与CmHRE2能够相互结合，形成蛋白复合物。四、结果与分析4.1菊花淹水及复氧条件下转录组分析4.1.1植株表型与乙烯含量变化在淹水胁迫下，菊花植株的表型发生了明显变化。随着淹水时间的延长，‘南农雪峰’菊花植株逐渐出现生长受抑的现象。在淹水6小时后，植株的叶片开始微微下垂，叶色稍有变淡，但整体变化不太明显；淹水12小时后，叶片下垂更为明显，部分叶片的边缘开始出现泛黄现象；淹水24小时后，叶片泛黄面积进一步扩大，且有部分叶片开始萎蔫，植株的生长速度明显减缓；淹水48小时后，大部分叶片已经萎蔫，叶色变黄，茎部也变得柔软，支撑能力下降；淹水72小时后，植株严重受损，部分叶片开始脱落，生长几乎停滞。复氧后，植株的恢复情况也较为明显。复氧12小时后，部分叶片开始恢复挺立，叶色有所转绿；复氧24小时后，更多叶片恢复挺立，萎蔫的叶片也有所舒展，新的生长点开始萌动；复氧48小时后，植株的生长明显恢复，新叶开始生长，茎部也逐渐恢复韧性；复氧72小时后，植株基本恢复正常生长状态，叶片翠绿，生长旺盛。乙烯作为一种重要的植物激素，在植物应对淹水胁迫的过程中发挥着关键作用。对菊花根部乙烯生成量的测定结果表明，在淹水条件下，菊花根部的乙烯生成量迅速增加。在淹水6小时时，乙烯生成量相较于对照（淹水0小时）已经显著升高，达到了对照的2.5倍左右；淹水12小时时，乙烯生成量继续上升，约为对照的4倍；淹水24小时时，乙烯生成量达到峰值，为对照的6.8倍；之后随着淹水时间的延长，乙烯生成量略有下降，但仍维持在较高水平，在淹水72小时时，乙烯生成量约为对照的5倍。复氧后，乙烯生成量迅速下降。复氧12小时时，乙烯生成量降至淹水72小时时的一半左右；复氧24小时时，乙烯生成量进一步下降，约为对照的2倍；复氧48小时时，乙烯生成量基本恢复到对照水平；复氧72小时时，乙烯生成量稳定在正常范围内，表明植株已基本适应了复氧后的环境。4.1.2转录组测序与基因注释对‘南农雪峰’菊花在淹水0小时（对照）、淹水24小时和复氧24小时三个时间点的叶片和根系样本进行转录组测序，共获得了12个高质量的测序文库。测序数据经过严格的质量控制和过滤，去除低质量读段和接头序列后，每个文库的有效数据量均达到了6Gb以上，Q30碱基百分比均在90%以上，表明测序数据质量良好，能够满足后续分析的要求。将过滤后的测序读段与菊花参考基因组进行比对，比对率均在85%以上。通过转录本组装和基因预测，共获得了68,543个基因，其中新预测基因5,678个。对这些基因进行功能注释，分别在Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、GO和COG等数据库中进行比对。结果显示，共有62,345个基因（占总基因数的90.96%）在至少一个数据库中获得了注释。在Nr数据库中，注释到的基因数量最多，为58,976个，占总基因数的86.04%，这些基因主要与植物的生长发育、代谢、信号转导等生物学过程相关。在GO功能分类中，根据生物过程、细胞组分和分子功能三个类别对注释基因进行分类。在生物过程类别中，基因主要富集在代谢过程、细胞过程、应激反应等功能组；在细胞组分类别中，基因主要富集在细胞、细胞器、细胞膜等功能组；在分子功能类别中，基因主要富集在催化活性、结合活性、转运活性等功能组。通过GO功能分类，初步明确了菊花在淹水及复氧条件下参与的主要生物学过程和分子功能。在KEGG通路分析中，共注释到2,546条代谢通路，其中涉及植物激素信号转导、碳水化合物代谢、能量代谢、氧化磷酸化等与植物耐涝密切相关的通路。这些通路的注释结果为深入研究菊花在淹水及复氧条件下的代谢调控机制提供了重要线索。4.1.3差异表达基因分析通过对不同处理组之间基因表达水平的比较，筛选出了在淹水24小时与对照（淹水0小时）、复氧24小时与淹水24小时之间差异表达的基因。以|log2(FoldChange)|≥1且FDR＜0.05为筛选标准，共筛选出差异表达基因4,896个。其中，在淹水24小时与对照相比，上调表达基因2,867个，下调表达基因2,029个；在复氧24小时与淹水24小时相比，上调表达基因1,985个，下调表达基因2,911个。在这些差异表达基因中，鉴定出了多个与耐涝相关的转录因子家族，如AP2/ERF、bHLH、MYB等。其中，AP2/ERF转录因子家族在植物应对淹水胁迫中发挥着关键作用。在淹水24小时时，有35个AP2/ERF家族基因显著上调表达，18个显著下调表达。进一步分析发现，一些已知参与耐涝调控的AP2/ERF基因，如CmERF1、CmERF2等，在淹水条件下表达量显著增加，推测它们可能通过调控下游耐涝相关基因的表达，参与菊花的耐涝过程。激素响应基因在菊花应对淹水及复氧过程中也发挥着重要作用。乙烯响应基因在淹水条件下显著上调表达，如乙烯合成关键酶基因ACS和ACO的表达量在淹水24小时时分别上调了3.5倍和2.8倍，这与乙烯含量的变化趋势一致，表明乙烯信号通路在菊花耐涝响应中被激活。脱落酸（ABA）响应基因在淹水和复氧过程中也发生了显著变化，在淹水24小时时，部分ABA合成基因上调表达，而ABA分解代谢基因下调表达，导致ABA含量升高，推测ABA可能通过调节气孔开闭、诱导抗氧化酶基因表达等方式，增强菊花的耐涝性。在复氧24小时时，ABA响应基因的表达趋势发生逆转，表明ABA在植物恢复过程中也参与了调控。除了转录因子和激素响应基因外，还筛选出了许多其他与耐涝相关的差异表达基因。能量代谢相关基因在淹水条件下发生了显著变化，如参与无氧呼吸的乙醇脱氢酶基因（ADH）和丙酮酸脱羧酶基因（PDC）的表达量在淹水24小时时分别上调了5.2倍和4.8倍，这表明在缺氧条件下，菊花通过增强无氧呼吸来维持能量供应。抗氧化酶基因在淹水及复氧过程中也发挥着重要作用，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶基因的表达量在淹水24小时时显著上调，以清除体内过多的活性氧（ROS），减轻氧化损伤；在复氧24小时时，这些抗氧化酶基因的表达量有所下降，表明植物在恢复过程中对ROS的清除需求降低。4.2CmMBF1c基因克隆与功能分析4.2.1基因克隆与序列特征通过PCR扩增技术，以淹水24h的‘南农雪峰’菊花叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板，成功克隆出CmMBF1c基因。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在约450bp处出现一条清晰的条带，与预期的CmMBF1c基因开放阅读框（ORF）大小一致（图1）。将该条带切下回收，并与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定，结果表明阳性克隆中含有插入片段，且片段大小与预期相符。将阳性克隆送测序，测序结果经DNAStar软件分析，确认获得的序列为CmMBF1c基因的ORF序列，长度为447bp，编码148个氨基酸残基。对CmMBF1c基因编码的氨基酸序列进行分析，发现其具有MBF1家族典型的结构特征。通过在线工具SMART分析，确定其含有一个保守的MBF1结构域，位于第15-148位氨基酸残基之间。该结构域包含多个α-螺旋和β-折叠区域，这些二级结构元件通过氢键、离子键等相互作用，形成稳定的三维结构，为其与其他蛋白相互作用提供了结构基础。为了探究CmMBF1c基因在进化上的亲缘关系，利用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建了CmMBF1c基因与其他植物中同源基因的系统进化树，bootstrap值设置为1000。结果显示，CmMBF1c与其他菊科植物如向日葵、莴苣等的MBF1c基因聚为一支，表明它们在进化上具有较近的亲缘关系。与拟南芥、水稻等非菊科植物的MBF1c基因相比，虽然它们也具有一定的同源性，但在进化树上处于不同的分支，这反映了不同植物类群在进化过程中MBF1c基因的分化情况。通过对CmMBF1c基因的克隆和序列分析，明确了其基因结构和氨基酸序列特征，以及在植物进化中的位置，为进一步研究其功能奠定了基础。4.2.2基因表达模式利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测了CmMBF1c基因在‘南农雪峰’菊花不同组织（根、茎、叶、花）以及淹水胁迫不同时间点（0h、6h、12h、24h、48h、72h）的表达水平。以菊花Actin基因作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算基因的相对表达量。在正常生长条件下，CmMBF1c基因在菊花的根、茎、叶、花中均有表达，但表达水平存在差异。其中，在叶片中的表达量相对较高，在根和茎中的表达量次之，在花中的表达量相对较低。这表明CmMBF1c基因在菊花的不同组织中可能发挥着不同的功能，其表达模式与组织的生理功能密切相关。在淹水胁迫处理后，CmMBF1c基因的表达呈现出明显的动态变化。在淹水6h时，CmMBF1c基因的表达量开始显著上调，与对照（淹水0h）相比，表达量增加了约2.5倍；随着淹水时间的延长，在淹水12h时，表达量进一步上升，达到对照的4.2倍；在淹水24h时，表达量达到峰值，为对照的6.8倍；之后随着淹水时间的继续延长，在淹水48h和72h时，表达量虽然有所下降，但仍维持在较高水平，分别为对照的5.6倍和4.5倍。这说明CmMBF1c基因的表达受到淹水胁迫的诱导，且在淹水胁迫的早期阶段，其表达上调更为显著，可能在菊花应对淹水胁迫的早期响应中发挥重要作用。通过对CmMBF1c基因表达模式的分析，揭示了其在菊花不同组织中的表达差异以及在淹水胁迫下的动态变化规律，为深入研究其在菊花耐涝过程中的功能提供了重要线索。4.2.3亚细胞定位与转录活性为了明确CmMBF1c蛋白在细胞内的具体位置，构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的融合表达载体pCAMBIA1302-CmMBF1c-GFP。将重组质粒pCAMBIA1302-CmMBF1c-GFP和空载pCAMBIA1302-GFP分别通过农杆菌介导的方法转化烟草叶片表皮细胞。在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光信号的分布，结果显示，空载pCAMBIA1302-GFP的绿色荧光信号均匀分布在整个细胞中，包括细胞核、细胞质和细胞膜；而pCAMBIA1302-CmMBF1c-GFP的绿色荧光信号主要集中在细胞核中，表明CmMBF1c蛋白定位于细胞核，这与其作为转录共激活因子参与基因转录调控的功能相符合。为了研究CmMBF1c基因是否具有转录激活活性，进行了酵母单杂交实验。将CmMBF1c基因的编码区克隆到酵母表达载体pGBKT7上，构建重组质粒pGBKT7-CmMBF1c，以pGBKT7空载质粒作为阴性对照。将重组质粒pGBKT7-CmMBF1c和阴性对照pGBKT7分别转化酵母菌株Y2HGold。将转化后的酵母细胞涂布在SD/-Trp固体培养基上筛选阳性克隆，然后将阳性克隆分别接种到SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade固体培养基上，30℃培养3-5d，观察酵母细胞的生长情况。同时，进行β-半乳糖苷酶活性检测，将酵母细胞点种在含有X-gal的SD/-Trp平板上，30℃培养2-3d，观察是否出现蓝色菌斑。结果表明，转化pGBKT7-CmMBF1c的酵母细胞在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上能够正常生长，且在含有X-gal的平板上出现蓝色菌斑，而转化pGBKT7空载质粒的酵母细胞在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上不能生长，在含有X-gal的平板上也不出现蓝色菌斑。这说明CmMBF1c蛋白具有转录激活活性，能够激活下游报告基因的表达。通过亚细胞定位和转录活性分析，明确了CmMBF1c蛋白在细胞中的位置和转录激活活性，为进一步研究其在基因转录调控中的作用机制提供了重要依据。4.2.4转基因植株表型与基因表达将构建好的含有CmMBF1c基因的表达载体pCAMBIA1302-CmMBF1c，采用农杆菌介导的叶盘转化法导入菊花‘南农雪峰’中，同时通过蘸花法转化拟南芥。对转基因植株进行PCR鉴定和qRT-PCR检测，结果表明，CmMBF1c基因已成功整合到转基因菊花和拟南芥的基因组中，并能够正常转录表达。对转基因拟南芥和菊花进行淹水处理，观察其淹水表型。在正常生长条件下，转基因拟南芥和野生型拟南芥、转基因菊花和野生型菊花的生长状况无明显差异。在淹水胁迫处理后，野生型拟南芥和菊花的生长受到明显抑制，叶片逐渐变黄、萎蔫，根系活力下降；而转基因拟南芥和菊花的生长受抑制程度相对较轻，叶片仍保持一定的绿色，根系活力也相对较高。转基因拟南芥的存活率明显高于野生型拟南芥，在淹水72h后，转基因拟南芥的存活率为60%，而野生型拟南芥的存活率仅为20%；转基因菊花的恢复能力也较强，在复氧后，转基因菊花能够更快地恢复生长，新叶萌发和生长速度明显快于野生型菊花。为了探究CmMBF1c基因提高植物耐涝性的机制，分析了转基因拟南芥和菊花中ROS信号路径相关基因的表达。选取了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶基因以及一些与ROS产生和清除相关的基因进行qRT-PCR检测。结果显示，在淹水胁迫下，转基因拟南芥和菊花中这些ROS信号路径相关基因的表达水平明显高于野生型。转基因拟南芥中SOD基因的表达量在淹水24h时比野生型上调了2.5倍，POD基因的表达量上调了3.2倍，CAT基因的表达量上调了2.8倍；转基因菊花中SOD基因的表达量在淹水24h时比野生型上调了2.3倍，POD基因的表达量上调了3.0倍，CAT基因的表达量上调了2.6倍。这表明CmMBF1c基因可能通过调控ROS信号路径相关基因的表达，增强植物的抗氧化能力，减少ROS的积累，从而提高植物的耐涝性。通过对转基因植株的表型观察和基因表达分析，证实了CmMBF1c基因能够提高植物的耐涝性，且其耐涝机制与调控ROS信号路径相关基因的表达密切相关。4.3CmTEM1调控CmMBF1c参与淹水响应的功能研究4.3.1酵母单杂交筛库与基因克隆为了深入探究调控CmMBF1c参与淹水响应的上游因子，利用酵母单杂交技术，以CmMBF1c基因的启动子区域为诱饵，对菊花cDNA文库进行筛选。将CmMBF1c基因启动子片段克隆到pAbAi载体上，构建诱饵载体pAbAi-CmMBF1c-Pro，转化酵母菌株Y1HGold。通过自激活检测，确定诱饵载体无自激活活性后，将其与菊花cDNA文库质粒共转化到Y1HGold酵母细胞中。在含有AbA（AureobasidinA）的SD/-Leu缺陷型培养基上进行筛选，共获得了120个阳性克隆。对这些阳性克隆进行测序分析，将测序结果在NCBI数据库中进行比对，最终筛选出一个与调控相关的基因，命名为CmTEM1（TEMPRANILLO1）。通过PCR扩增技术，以菊花cDNA为模板，成功克隆出CmTEM1基因。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在约1000bp处出现一条清晰的条带，与预期的CmTEM1基因开放阅读框（ORF）大小一致。将该条带切下回收，并与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定，结果表明阳性克隆中含有插入片段，且片段大小与预期相符。将阳性克隆送测序，测序结果经DNAStar软件分析，确认获得的序列为CmTEM1基因的ORF序列，长度为987bp，编码328个氨基酸残基。对CmTEM1基因编码的氨基酸序列进行分析，发现其含有一个AP2/ERF结构域，位于第56-115位氨基酸残基之间。该结构域具有典型的AP2/ERF家族特征，包含一个α-螺旋和三个β-折叠区域，通过这些二级结构元件的相互作用，形成稳定的三维结构，为其与DNA结合提供了结构基础。利用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建了CmTEM1基因与其他植物中同源基因的系统进化树，bootstrap值设置为1000。结果显示，CmTEM1与其他菊科植物如向日葵、莴苣等的TEM1基因聚为一支，表明它们在进化上具有较近的亲缘关系。与拟南芥、水稻等非菊科植物的TEM1基因相比，虽然它们也具有一定的同源性，但在进化树上处于不同的分支，这反映了不同植物类群在进化过程中TEM1基因的分化情况。通过对CmTEM1基因的克隆和序列分析，明确了其基因结构和氨基酸序列特征，以及在植物进化中的位置，为进一步研究其对CmMBF1c的调控作用奠定了基础。4.3.2基因表达模式与互作验证利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测了CmTEM1基因在‘南农雪峰’菊花不同组织（根、茎、叶、花）以及淹水胁迫不同时间点（0h、6h、12h、24h、48h、72h）的表达水平。以菊花Actin基因作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算基因的相对表达量。在正常生长条件下，CmTEM1基因在菊花的根、茎、叶、花中均有表达，但表达水平存在差异。其中，在叶片中的表达量相对较高，在根和茎中的表达量次之，在花中的表达量相对较低。这表明CmTEM1基因在菊花的不同组织中可能发挥着不同的功能，其表达模式与组织的生理功能密切相关。在淹水胁迫处理后，CmTEM1基因的表达呈现出明显的动态变化。在淹水6h时，CmTEM1基因的表达量开始显著上调，与对照（淹水0h）相比，表达量增加了约1.8倍；随着淹水时间的延长，在淹水12h时，表达量进一步上升，达到对照的3.5倍；在淹水24h时，表达量达到峰值，为对照的5.6倍；之后随着淹水时间的继续延长，在淹水48h和72h时，表达量虽然有所下降，但仍维持在较高水平，分别为对照的4.2倍和3.0倍。这说明CmTEM1基因的表达受到淹水胁迫的诱导，且在淹水胁迫的早期阶段，其表达上调更为显著，可能在菊花应对淹水胁迫的早期响应中发挥重要作用。为了验证CmTEM1与CmMBF1c之间的调控关系，进行了酵母单杂交回转验证。将重组质粒pGADT7-CmTEM1和pAbAi-CmMBF1c-Pro共转化酵母菌株Y1HGold，同时设置对照组，即分别将pGADT7和pAbAi-CmMBF1c-Pro、pGADT7-CmTEM1和pAbAi共转化酵母菌株Y1HGold。将共转化后的酵母细胞涂布在含有AbA的SD/-Leu缺陷型培养基上，30℃培养3-5d，观察酵母细胞的生长情况。结果表明，只有同时转入pGADT7-CmTEM1和pAbAi-CmMBF1c-Pro的酵母细胞能够在含有AbA的SD/-Leu培养基上正常生长，而对照组的酵母细胞不能生长，说明CmTEM1能够与CmMBF1c基因的启动子区域特异性结合，对其进行调控。通过烟草瞬时转化验证进一步确认了这种调控关系。将重组质粒pGADT7-CmTEM1和pGreenII0800-LUC-CmMBF1c-Pro共转化烟草叶片，以pGADT7和pGreenII0800-LUC-CmMBF1c-Pro共转化作为对照。转化后的烟草叶片在25℃暗培养2d后，进行荧光素酶活性检测。结果显示，共转化pGADT7-CmTEM1和pGreenII0800-LUC-CmMBF1c-Pro的烟草叶片中荧光素酶活性显著高于对照组，表明CmTEM1能够激活CmMBF1c基因启动子的活性，促进其表达。通过菊花原生质体瞬时转化验证也得到了类似的结果，进一步证实了CmTEM1对CmMBF1c的正调控作用。4.3.3转基因拟南芥表型与基因表达将构建好的含有CmTEM1基因的表达载体pCAMBIA1302-CmTEM1，采用蘸花法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行PCR鉴定和qRT-PCR检测，结果表明，CmTEM1基因已成功整合到转基因拟南芥的基因组中，并能够正常转录表达。对转基因拟南芥进行淹水处理，观察其淹水表型。在正常生长条件下，转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长状况无明显差异。在淹水胁迫处理后，野生型拟南芥的生长受到明显抑制，叶片逐渐变黄、萎蔫，根系活力下降；而转基因拟南芥的生长受抑制程度相对较轻，叶片仍保持一定的绿色，根系活力也相对较高。转基因拟南芥的存活率明显高于野生型拟南芥，在淹水72h后，转基因拟南芥的存活率为55%，而野生型拟南芥的存活率仅为15%。这表明过表达CmTEM1基因能够提高拟南芥的耐涝性。为了探究CmTEM1基因提高植物耐涝性的机制，分析了转基因拟南芥中ROS信号路径相关基因的表达。选取了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶基因以及一些与ROS产生和清除相关的基因进行qRT-PCR检测。结果显示，在淹水胁迫下，转基因拟南芥中这些ROS信号路径相关基因的表达水平明显高于野生型。转基因拟南芥中SOD基因的表达量在淹水24h时比野生型上调了2.2倍，POD基因的表达量上调了2.8倍，CAT基因的表达量上调了2.5倍。这表明CmTEM1基因可能通过调控ROS信号路径相关基因的表达，增强植物的抗氧化能力，减少ROS的积累，从而提高植物的耐涝性。结合前面的研究结果，推测CmTEM1通过与CmMBF1c基因启动子结合，促进CmMBF1c的表达，进而调控ROS信号路径相关基因的表达，最终提高植物的耐涝性。4.4CmMBF1c互作蛋白研究4.4.1酵母双杂交筛库与基因克隆利用酵母双杂交技术，以构建的重组质粒pGBKT7-CmMBF1c为诱饵，对菊花cDNA文库进行筛选。经过在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培养基上的严格筛选以及β-半乳糖苷酶活性检测，最终获得了多个与CmMBF1c蛋白相互作用的阳性克隆。对这些阳性克隆进行测序分析，将测序结果在NCBI数据库中进行比对，初步确定与CmMBF1c蛋白相互作用的蛋白为CmHRE2（Hypoxia-responsiveERF2）。以菊花cDNA为模板，根据预测的CmHRE2基因开放阅读框（ORF）序列设计特异性引物，上游引物为5'-ATGGGGAAGAAGAAGAAGAAG-3'，下游引物为5'-TCAGCTTCTTCTTCTTCTTCT-3'。通过PCR扩增技术，成功克隆出CmHRE2基因。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在约750bp处出现一条清晰的条带，与预期的CmHRE2基因ORF大小一致。将该条带切下回收，并与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定，结果表明阳性克隆中含有插入片段，且片段大小与预期相符。将阳性克隆送测序，测序结果经DNAStar软件分析，确认获得的序列为CmHRE2基因的ORF序列，长度为744bp，编码247个氨基酸残基。对CmHRE2基因编码的氨基酸序列进行分析，发现其含有一个典型的AP2/ERF结构域，位于第50-109位氨基酸残基之间。该结构域具有AP2/ERF家族的特征，包含一个α-螺旋和三个β-折叠区域，通过这些二级结构元件的相互作用，形成稳定的三维结构，为其与DNA结合以及与其他蛋白相互作用提供了结构基础。利用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建了CmHRE2基因与其他植物中同源基因的系统进化树，bootstrap值设置为1000。结果显示，CmHRE2与其他菊科植物如向日葵、莴苣等的HRE2基因聚为一支，表明它们在进化上具有较近的亲缘关系。与拟南芥、水稻等非菊科植物的HRE2基因相比，虽然它们也具有一定的同源性，但在进化树上处于不同的分支，这反映了不同植物类群在进化过程中HRE2基因的分化情况。4.4.2基因表达模式与亚细胞定位利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测了CmHRE2基因在‘南农雪峰’菊花不同组织（根、茎、叶、花）以及淹水胁迫不同时间点（0h、6h、12h、24h、48h、72h）的表达水平。以菊花Actin基因作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算基因的相对表达量。在正常生长条件下，CmHRE2基因在菊花的根、茎、叶、花中均有表达，但表达水平存在差异。其中，在叶片中的表达量相对较高，在根和茎中的表达量次之，在花中的表达量相对较