《基因工程B》复习提纲2020

第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。2、简述基因工程操作的理论依据。3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。5、简述切口平移法标记DNA的原理。答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNaseI处理双链DNA，随机产生少量切口；然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性在切口处向3'端平移去除核苷酸，同时，其5'→3'聚合酶活性则将切口作为引物沿5'→3'方向催化DNA合成；随着反应的进行，5'端核苷酸不断去除，3'端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性从3’端降解DNA，当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的5'→3'聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3’端标记的DNA。第三章基因工程的载体一、名词解释载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签二、思考题1、简述克隆载体具备的基本条件。2、以大肠杆菌为例，解释利用α互补筛选重组质粒的原理。答：在IPTG的诱导作用下，lacZ基因编码产生β-半乳糖苷酶，可以分解Xgal产生蓝色的产物。当大肠杆菌宿主细胞中仅携带一个lacZ△M15基因，编码产生无活性的β-半乳糖苷酶C端肽段，而质粒载体上含有一个lacZ’基因，编码产生无活性的β-半乳糖苷酶N端肽段（即α-肽）时，两者可以在细胞内结合形成有活性的β-半乳糖苷酶，从而在含有X-gal和IPTG的培养基上形成蓝色菌斑，称为α-互补作用。而当把外源DNA片段插入到质粒载体的lacZ’基因中获得的重组载体导入大肠杆菌细胞，会导致α-互补功能丧失，从而在含有X-gal和IPTG的培养基上形成白色菌斑。3、解释TA克隆的基本原理。4、简述利用质粒载体进行基因克隆的基本步骤。5、简单描述λ噬菌体的溶原状态和裂解生长，及其在构建载体中的作用。答：λ噬菌体溶原周期是指感染宿主细胞后，将自己的DNA整合到宿主的基因组中，与宿主染色体一起复制，并随宿主细胞的分裂而传递给子代。利用噬菌体DNA定点整合到宿主基因组DNA上的重组原理建立Gateway重组技术用于载体的构建。λ噬菌体溶菌周期是指感染宿主细胞后，立即在菌体内复制，并合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致宿主细胞解体，释放出大量子代噬菌体。利用λ噬菌体作为载体，在构建载体时，外源DNA片段可插入或替换控制溶原状态的基因区段。6、简述利用λ噬菌体载体进行基因克隆的基本步骤。7、以大肠杆菌为例，说明表达载体比克隆载体多了哪些功能元件？各有什么生物学功能？答：表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加了启动子、核糖体结合位点和终止子等表达元件。①启动子：DNA上与RNA聚合酶结合的一段序列，启动RNA转录，包含转录起始位点。②核糖体结合位点：转录生成的mRNA上与核糖体结合的位点，启动蛋白质翻译。③终止子：提供转录终止信号的DNA序列，终止转录。8、什么是表达标签，有何作用？列举2类用作表达标签的蛋白。答：表达标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或蛋白，用于目的蛋白的表达、检测、示踪、分离和纯化等。例如，纯化标签（GST、HIS、FLAG）、报告标签（GUS、GFP、RFP）、定位标签（信号肽、核定位信号）。第四章核酸操作的基本技术一、名词解释琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern杂交、Nouthern杂交二、思考题1、简述CTAB法提取DNA的原理。答：CTAB是一种阳离子去垢剂，可以溶解细胞膜，使DNA释放出来，并形成溶于高盐溶液的CTAB-核酸复合物。通过有机溶剂（酚/氯仿/异戊醇）抽提，去除蛋白质、脂类、酚类等杂质。然后加入乙醇或异丙醇破坏DNA的水化层，使DNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗涤DNA沉淀，去除盐等杂质。实验中利用EDTA螯合Mg2+来抑制DNase对DNA的降解作用。2、简述SDS法提取DNA的原理。答：SDS是一种阴离子去垢剂，可以溶解细胞膜，使DNA释放出来，还可以变性蛋白质，并形成溶于有机溶剂的SDS-蛋白质复合物。DNA溶于水，通过有机溶剂（酚/氯仿/异戊醇）抽提，可以去除蛋白质、脂类、酚类等杂质。然后加入乙醇或异丙醇破坏DNA的水化层，使DNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗涤DNA沉淀，去除盐等杂质。实验中利用EDTA螯合Mg2+来抑制DNase对DNA的降解作用。3、简述碱裂解法提取质粒DNA的原理。答：质粒是独立于染色体外的、能够自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种共价闭合环状的双链DNA分子。强碱性条件下，质粒DNA双链间的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，但两条环状的互补链不完全分离；当酸中和至中性时，质粒DNA迅速准确配对重新恢复原来构型，溶于水中。强碱性条件下，染色体DNA双链间的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，两条线性互补链完全分离；当酸中和至中性时，染色体DNA不能复性，而与破裂的细胞壁，蛋白质相互缠连成不溶物，经离心除去。4、简述琼脂糖凝胶电泳中DNA迁移的原理。答：迁移方向—电荷效应：DNA分子是两性电解质，在碱性（pH8.0）缓冲液中，磷酸基团解离，带负电荷，向正极移动。迁移速率—分子筛效应：DNA分子迁移速率同其与凝胶介质间的摩擦系数呈反比，同一介质中，摩擦系数主要与DNA分子的大小和构型相关。5、比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳用途的异同。答：琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶电泳分辨率低，分辨DNA片段大小为100-50000bp，聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，分辨DNA片段大小为1-1000bp。琼脂糖凝胶电泳采用水平装置在强度和方向恒定的电场下进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置在强度和方向恒定的电场下进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳操作比琼脂糖的困难。6、简述紫外分光光度法检测核酸浓度和纯度的原理。答：核酸在紫外线260nm波长处有最大吸收峰，蛋白质在280nm波长处有最大吸收峰，盐和其它杂质的吸收峰则聚集在230nm波长处，通过A260/A280和A260/A230的比值可以判定出核酸的纯度。1OD260分别对应50μg/mL的dsDNA，33μg/mL的ssDNA，40μg/mL的ssRNA含量，通过260nm处的吸光值可以推定处核酸的浓度。7、简述Trizol法提取RNA的原理。答：Trizol试剂是一种直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，其主要成分为异硫氰酸胍和酸性苯酚。其中异硫氰酸胍可以裂解细胞，解离核糖体，而苯酚可以变性蛋白质，从而使核酸与蛋白质分离，酸性条件下，DNA在酚相，RNA在水相，两者就分开了。然后加入氯仿抽提，可以去除蛋白质、脂类、酚类等杂质，离心后，样品分为水样层和有机层，其中RNA在水相中，蛋白质和DNA留在有机相中。收集水样层，加入异丙醇破坏RNA的水化膜，使RNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗涤RNA沉淀，去除盐、多糖等杂质。8、印记分子杂交主要有哪些类型，并分别说明其用途。答：①Southern杂交：检测DNA②Northern杂交：检测RNA③Western杂交：检测蛋白质④菌落杂交或噬菌斑杂交：检测阳性克隆⑤基因芯片：检测mRNA的含量和结构，重测序，SNP检测。第五章目的基因的获取一、名词解释目的基因、基因组DNA文库、cDNA文库、聚合酶链反应（PCR）、Tm值二、思考题1、简述基因组DNA文库构建的基本步骤。2、简述cDNA文库构建的基本步骤。3、简述自身引导法合成第二链cDNA的基本过程。4、简述置换法合成第二链cDNA的基本过程。5、简述引物-衔接头法合成第二链cDNA的基本过程。6、简述常规PCR的基本原理。答：PCR是依据细胞内DNA半保留复制的机制，体外模拟DNA复制的技术。基本要素包括反应缓冲液、模板DNA、引物DNA、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+等组分。模板DNA的高温变性、引物与模板低温退火（结合）、子链中温延伸３个基本步骤构成PCR反应的一个循环。新合成的DNA链经变性后又可以作为下一轮PCR循环反应的模板，如此反复循环，使目的DNA呈倍性扩增。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。21、简述普通PCR的基本程序答：①预变性：92-98℃，DNA解螺旋；②变性：92-98℃，双链DNA解链成单链DNA；③退火：37-72℃，引物与模板互补结合；④延伸：68-75℃，DNA聚合酶将dNTP不断添加到引物的3’-OH端，合成子链DNA；⑤再延伸：68-75℃，充分延伸。②③④为PCR循环过程，重复一次为一个循环。22、列举至少5条引物设计的基本原则。答：①引物长度一般为18～30个核苷酸；②引物碱基尽可能随机分布，G+C含量在45％~55％；③引物内部避免出现回文序列，以免形成发夹结构；④两条引物之间不能有3个以上碱基互补配对，以免形成引物二聚体，；⑤引物有特异性，与非扩增区无明显同源序列；⑥引物