新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范

新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范一、引言为进一步提高新冠病毒核酸检测效率，在保证检测质量的前提下，最大限度地利用现有检测资源，满足大规模人群筛查的需求，特制定本新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范（以下简称“本规范”）。本规范旨在为从事新冠病毒核酸检测的实验室、医疗机构及相关检测人员提供统一、科学、规范的技术指导，确保混采检测工作的有序开展和结果的准确性。二、适用范围本规范适用于新冠病毒肺炎疫情防控期间，对大规模人群进行新冠病毒核酸筛查时采用的10合1混采检测技术。其他特殊场景下的混采检测可参照本规范执行，但需结合实际情况进行调整并验证。三、术语与定义1.10合1混采检测（10-in-1PooledTesting）：指将采集自10名受检者的鼻咽拭子样本，分别置于同一采样管的保存液中，混合后进行核酸提取和扩增检测的方法。2.样本采集单元：指用于采集单个受检者呼吸道样本的工具，通常包括采样拭子和含保存液的采样管（单采管）。3.混样管：指用于混合10份单采样本保存液的专用离心管。4.阳性对照：已知含有新冠病毒核酸的样本或假病毒颗粒，用于监控整个检测过程的有效性。5.阴性对照：已知不含新冠病毒核酸的样本（如生理盐水、灭活的其他无关病毒或细菌），用于监控检测过程中的污染情况。6.内标：加入到样本提取或扩增体系中的已知核酸序列，用于监控RNA提取、逆转录及扩增过程是否受到抑制或失败。四、样本采集（一）采集前准备1.物资准备：根据预期采集人数，准备足量的合格采样拭子（植绒拭子）、含病毒保存液的单采管（建议保存液体积为3-5ml）、混样管（建议体积不小于15ml，内含适量保存液或不含保存液，根据实验室方案确定）、个人防护用品（PPE）、手消毒剂、医疗废弃物收集袋等。2.人员培训：采集人员必须经过严格培训，熟悉采集流程、样本保存要求及生物安全防护知识。3.受检者信息登记：采用信息化手段或纸质记录，准确登记受检者姓名、身份证号（或其他唯一标识符）、联系方式、采样时间、采样地点等关键信息，并确保10人一组的样本信息可追溯、可关联。（二）采集操作1.采样点设置：应选择通风良好、相对独立的空间，划分等候区、采集区、缓冲区和临时隔离区，并设置清晰标识。2.个人防护：采集人员应按照二级及以上生物安全防护要求着装，包括医用防护口罩、护目镜或防护面屏、防护服、一次性手套、鞋套等。3.采集方法：*嘱受检者头稍后仰，去除鼻腔内表面分泌物。*用一只手轻扶受检者头部，另一只手持采样拭子，将拭子头轻轻插入受检者一侧鼻孔内，沿下鼻道的底部向后缓缓深入1-1.5厘米后，贴鼻腔旋转至少4圈（停留时间不少于15秒），随后使用同一拭子在另一鼻腔内重复相同操作。*采集完毕后，将拭子头垂直浸入含保存液的单采管中，拭子杆在管口处折断（或按拭子说明书操作），确保拭子头完全浸泡在保存液内。旋紧管盖，做好标记。4.混样操作：*待10名受检者的单采样本采集完成后，核对无误。*分别拧开10个单采管的管盖，用移液枪分别从每个单采管中吸取等量的保存液（例如，每管吸取____μl，具体体积根据单采管保存液总量、混样后总体系及后续检测需求确定），加入到同一个混样管中。*每吸取一份样本前，应更换新的无菌吸头，严禁吸头重复使用，以防交叉污染。*混样完成后，旋紧混样管管盖，在管外壁清晰标记混样编号，并确保该编号与10名受检者的信息准确关联。*单采管在完成样本转移后，应暂时保留，直至混样管检测结果阴性方可按照医疗废弃物处理；若混样管结果为阳性，则需对相应的10份单采样本进行复核检测。（三）采集后样本处理1.混样管应在2-8℃条件下保存和运输。若不能在24小时内完成检测，应置于-20℃或更低温度保存，但应避免反复冻融。2.样本运输应符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》等相关要求。五、实验室检测（一）检测前准备1.实验室环境与分区：实验室应严格按照基因扩增检验实验室设置要求，划分试剂准备区、样本制备区、扩增区及产物分析区（若有）。各区独立，空气流向符合要求，避免交叉污染。2.仪器与试剂：*仪器：实时荧光定量PCR仪、核酸提取仪（或手工提取所需设备）、生物安全柜、离心机、移液器等，均应经过校准并处于良好运行状态。*试剂：新冠病毒核酸检测试剂盒（应包含针对ORF1ab、N基因或E基因等至少两个靶标的引物和探针）、RNA提取试剂、无RNA酶的离心管、吸头等耗材，均应在有效期内使用，并按说明书要求储存。3.人员防护：实验室操作人员应按相应区域的防护要求进行个人防护。（二）样本接收与处理1.样本接收时应核对混样管编号、数量、保存状态等信息，确认无误后进行登记。2.样本在生物安全柜内进行开盖、震荡混匀（若有需要）等操作。（三）核酸提取1.严格按照RNA提取试剂说明书进行操作，可采用自动化提取或手工提取。2.每次实验应同时设置阴性对照（如生理盐水或提取试剂自带阴性对照）和阳性对照（如已知浓度的假病毒对照），以监控提取过程。3.提取产物应立即进行下一步实验或在规定条件下短暂保存。（四）逆转录与扩增反应1.反应体系制备：在试剂准备区，按照检测试剂盒说明书配制逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）混合液（包含引物、探针、酶、dNTP等）。2.加样：在样本制备区的生物安全柜内，将提取的RNA产物（通常为5-10μl，具体体积按试剂盒要求）加入到RT-PCR反应管中。同时，设置阴性对照（如无模板对照NTC，使用无RNA酶水）、阳性对照和内标（通常试剂盒自带或提取试剂中已加入）。3.扩增反应：将加样完成的反应管密封，转移至扩增区，放入实时荧光定量PCR仪。按照试剂盒说明书设置循环参数（如逆转录温度和时间、预变性温度和时间、变性、退火/延伸温度和时间、循环数等），启动扩增程序。（五）结果判读与报告1.结果判读标准：严格按照所使用的新冠病毒核酸检测试剂盒说明书进行结果判读。*阴性结果：混样管中所有靶标（如ORF1ab、N基因）的Ct值均大于或等于试剂盒说明书设定的阈值，或无明显扩增曲线。*阳性结果：混样管中至少一个靶标的Ct值小于试剂盒说明书设定的阈值，且扩增曲线呈典型的S型。*可疑结果（灰区）：若Ct值在试剂盒说明书设定的灰区范围内，或扩增曲线不典型，应重新提取该混样管核酸进行复核检测；若复核结果仍为可疑或阳性，则按阳性结果处理。2.结果报告与后续处理：*阴性结果：报告该混样管为阴性，提示该10名受检者样本均为阴性（在排除假阴性可能的前提下）。*阳性/可疑结果：*立即上报实验室负责人，并对原始混样管样本进行复核检测。*若复核结果仍为阳性，则需通知相关部门，对该混样管所对应的10名受检者进行单独采样（单采单检），以确定具体哪名或哪些受检者为阳性。*整个过程需严格按照疫情防控相关规定进行信息上报和后续处置。六、质量控制与安全管理（一）质量控制1.内标控制：内标应在所有样本（包括阳性对照）中均有扩增，若内标无扩增，则提示该样本可能存在RNA降解或PCR抑制，需重新采样或处理样本。2.阴性对照：实验设置的各种阴性对照（如NTC、提取阴性对照）应均为阴性，若出现阳性，则提示实验过程可能存在污染，需查找原因并重新实验。3.阳性对照：阳性对照应出现预期的阳性结果，若为阴性，则提示实验试剂或操作可能存在问题，需查找原因并重新实验。4.人员与操作：定期对实验室人员进行培训和考核，确保操作规范。严格执行实验室内质量控制程序，参与室间质评活动。（二）安全管理1.生物安全：严格遵守生物安全相关规定，所有操作均在相应防护级别的生物安全柜内进行。样本处理、废弃物处置等均需符合生物安全要求。2.个人防护：实验人员应正确佩戴和使用个人防护用品，并在实验前后进行手卫生。3.消毒：实验台面、仪器设备、生物安全柜等应定期清洁消毒。实验结束后，对实验区域进行彻底消毒。4.废弃物处理：所有接触过样本的耗材、废弃物等，均应按照感染性医疗废弃物进行处理。七、废弃物处理检测过程中产生的所有废弃物，包括使用过的采样拭子、采样管、离心管、吸头、反应管以及污染的防护用品等，均应放入专用的医疗废弃物收集袋，经高压灭菌或其他无害化处理后，交由有资质的医疗废弃物处理机构进行处置。八、记录与报告1.记录：整个检测过程（包括样本采集、运输、接收、提取、扩增、结果判读等）均应进行详细、准确、完整的记录，记录应具有可追溯性。记录内容至少包括：样本信息、试剂信息（批号、有效期）、仪器操作参数、质控结果、检测结果、操作人员、操作时间等。2.报告：检测报告应规范、及时、准确。混样检测阳性结果需按规定流程上