DB5306T 19-2019 昭通市马铃薯脱毒苗生产技术规程

ICS65.020.20B21DB5306代替DG5306/T19—2014昭通市市场监督管理局发布DB5306/T19—2019I本规程按照DB/T1.1－2009《规程化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本规程由云南省昭通市农业科学院提出。本规程由昭通市农业农村局归口。本规程起草单位：昭通市农业科学院。本规程主要起草人：宋维际、李灿辉、张清凤、胡祚。本规程代替了DG5306/T19—2014。DB5306/T19—20191昭通市马铃薯脱毒苗生产技术规程本规程规定了马铃薯脱毒核心苗、基础苗、栽培苗的生产技术。本规程适用于昭通市马铃薯脱毒核心苗、基础苗、栽培苗生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5749生活饮用水卫生规程GB18133马铃薯脱毒种薯NY/T1212马铃薯脱毒种薯繁育技术规程NY/T1606马铃薯种薯生产操作技术规程YY0569生物安全柜3术语和定义下列术语和定义适用于本规程。3.1脱毒核心苗通过茎尖剥离获得的符合GB18133马铃薯脱毒种薯的再生苗。3.2基础苗用核心苗扩繁的苗，基础苗一般为核心苗第一代起继代扩繁22代±2代，即核心苗在保苗期间继代5代～7代，基础苗在扩繁栽培苗期间扩繁继代15代±2代。3.3栽培苗用密封、透明、耐高温的材料如玻璃瓶、耐高温塑料袋作容器，以生产为目的，快速繁殖后可用于移栽的马铃薯脱毒苗。3.4培养基为马铃薯脱毒苗的生长、发育提供所需物质的支撑物。3.5母液将培养基的成份配制成相应浓度的溶液或混合溶液。3.6接种在无菌条件下，将处理好的植物组织材料放置到培养基上的操作过程。DB5306/T19—201924脱毒种苗生产4.1仪器、器皿与试剂4.1.1仪器设备与器皿高压灭菌锅、超净工作台、0.01g感量天平、0.0001g感量天平、空调、光照培养箱、冰箱、光照培养架、紫外灯、枪状镊、专用组培剪、接种器械电热灭菌器、培养室、温度计、培养皿、带透气盖的组培瓶、烧杯、量筒、医疗手推车、周转用箱。4.1.2试剂75％酒精、甲醛、高锰酸钾、泛酸钙、氢氧化钠、盐酸、MS培养基（MurashigeandSkoog,1962）所含试剂。4.1.3培养基制作培养基制作按附录A进行，质量标准按附录B执行。4.2房间安排及要求4.2.1灭菌室室内主要仪器设备是高压灭菌锅、空调、配制培养基的不锈钢桌、灌装机、电磁炉、水池、拖把池。墙面及房间顶部贴墙砖，地面铺白色防滑地板砖。4.2.2接种室室内主要仪器设备是超净工作台、接种器械电热灭菌器、空调、医疗手推车、40W紫外灯1～2盏。接种室须设缓冲间于进门处与室内间距≧100cm，用5mm白玻璃隔断，隔断玻璃上贴警示彩条，进培养室的门须与隔断门对角开；玻璃窗为双层密封窗，雨天降雨0.5h后可开窗换气；墙面、地面处理同4.2.1。4.2.3光照培养室4.2.3.1光照培养室建设培养室宜建成四面为落地窗、顶部布≧50%比例玻璃的密闭环境，墙面刮腻子灰滚白乳胶漆或贴白墙砖；地面铺白色防滑地板砖；如顶部为全玻璃，须安装75%遮阳网，夏季加盖一层50%遮阳网；顶部安装FFU；门的密封性要好，以免灰尘进入。如整体房间≥100㎡，应用玻璃隔开，隔断玻璃上贴警示彩条，每个单元安装一台立柜式空调，以便节能。4.2.3.2培养架制作和摆放用万能角钢（表面喷白色漆）制作成层高40cm，长宽依光照培养室大小设计制作，层隔板用≥3.8mm白玻璃；培养架之间摆放间距为60cm。4.2.4药品室室内主要仪器设备是药品柜、天平、冰箱，墙面、地面处理同4.2.1。4.2.5洗涤室DB5306/T19—20193室内主要仪器设备是洗瓶机、洗涤池、不锈钢桌，墙面、地面处理同4.2.1。4.2.6贮藏室室内主要仪器设备是货架，墙面、地面处理同4.2.1。4.2.7培养基储备室室内主要仪器设备是空调，货架，墙面、地面处理同4.2.1。4.2.8病毒检测室室内主要仪器设备是酶标仪、洗板机、冰箱、解剖镜、显微镜，墙面、地面处理同4.2.1。4.2.9生化室室内主要仪器设备是光照培养箱、生化培养箱、冰箱，墙面、地面处理同4.2.1。4.3脱毒核心苗的获取4.3.1选材选择种植在≧2500m高海拔地区、具有本品种特性的优良健壮单株的薯块，或本品种的原原种50个以上，待芽长出1cm以上时备用。4.3.2高温处理将选中的带芽薯块放置于于37℃~37.5℃的光照培养箱内9周～10周，在高温处理过程中及时拣出腐烂或芽已全部死亡的薯块。4.3.3茎尖剥离4.3.3.1外材消毒切下芽顶部（0.5cm），放置于用75%酒精进行表面消毒过的烧杯中，上用干净纱布封口，置于自来水下冲洗数小时；将冲洗过的茎尖用75%酒精消毒3s～5s，置于0.1%升汞（HgCl2）溶液中消毒5min。然后在无菌水冲洗8次～10次。4.3.3.2茎尖剥离在超净工作台上、40×双筒解剖镜下用烧红冷却后的解剖针挑取茎尖顶部0.1mm带1～2个叶原基的组织。4.3.4茎尖培养4.3.4.1培养基MS＋0.05mg/LNAA＋0.05mg/L6-BA4.3.4.2培养条件将培养瓶放置于≥3000lux的洁净光照培养室内，温度22℃~25℃,光照≥12h/d。4.3.5扩繁待长成带4个～5个真叶的小植株进进行扩繁出5瓶～8瓶，每瓶10苗。操作按附录C执行。DB5306/T19—201944.3.6送检将扩繁后的瓶苗送检，检测对象为GB18133马铃薯脱毒种薯所列的病原物。4.3.7扩繁微型薯将合格的数个茎尖苗扩繁后在防虫网室中各生产微型薯100粒以上。4.3.8田间签定对各茎尖的微型薯在春季种植在二年内未种植过马铃薯的大田中进行品种真实性签定。4.3.9扩繁基础苗根据计划所需苗量和栽苗时间扩繁基础苗。操作按附录C执行。4.3.10基础苗检测在扩繁栽培苗前采用五点取样法，随机抽取1％～2％的基础瓶苗进行检测。检测方法应符合GB18133马铃薯脱毒种薯附录的要求。确认无检测对象后，方可扩繁栽培苗。4.4栽培苗的培养与炼苗4.4.1培养把接种好的瓶苗置于222℃,光照强度3000lux～50000lux，光照时间≥14h/d的培养室内进行培养。3月～9月培养20d左右、10月～翌年2月培养25d左右，可获得具有5片～6片小叶、高6cm左右的小苗4.4.2炼苗将室内培养的苗在移栽前5d～7d置于有遮光和控温设施的炼苗室或荫棚内炼苗，温度和光照强度分别控制在25℃±2℃、3000lux~50000lux。4.4.3栽培苗质量苗高5cm～8cm，茎粗≥1mm，具有明显叶柄的小叶≥5片，根白色至浅黄色，根系完整。4.5栽培苗的清洗与消毒将瓶苗取出，置于自来水中漂洗3次～4次。对附着的培养基则用拇指与食指轻压反复漂洗除去，切不可搓捻，以防损伤苗而影响成活率。漂洗干净后即可用0.05％的高锰酸钾溶液浸泡10min±2min进行消毒，也可用500倍～800倍的百菌清或甲基托布津浸泡处理。5组培室卫生按附录D执行。DB5306/T19—20195（规范性附录）培养基制作A.1母液配制MS培养基母液配制表ANH4·NO3MgSO4·7H2OKH2PO4BFeSO4·7H2ONa2-EDTA5CMnSO4·4H2OZnSO4·7H2OH3BO3Na2Mo4·2H2O1D5E221F221注：母液配制要求分别溶解后再定容。在配制母液A时氯化钙最后加入并且溶液体积不少于总体积的A.2培养基配制A.2.1培养基配方DB5306/T19—20196马铃薯脱毒种苗生产培养基采用MS＋泛酸钙2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.2g～5.2g/L（依琼脂粉的强度标准定量，以不软不硬为准）。A.2.2琼脂粉的溶化在洁净的不锈钢锅里加入配制体积4/5左右的清澈自来水，加入所需的琼脂粉，置于电磁炉上煮沸直至琼脂完全溶化为止。A.2.3白糖的溶化把所需的药品和蔗糖（或食用白糖）加入琼脂溶液中。A.2.4定容加入清澈的自来水并最终定容至所需体积。A.2.5调整pH值充分混合后用1N的KOH（NaOH）或HCl调整pH值至5.8～6.0。A.2.6核查各种物质仔细检查各添加物品是否完全、正确，如无遗漏或差错即可分装。A.2.7分装在培养基完全凝固以前按照分装量（30ml/240ml瓶，厚度18mm±1mm）进行分装，分装时注意培养基不沾培养瓶口，分装完毕后尽快拧紧瓶盖，然后及时进行消毒灭菌。A.2.8如用灌装机制作，按灌装机操作规程重复A2.2～A2.7程序。A.3培养基灭菌A.3.1装锅培养基瓶在灭菌锅内不得倾斜。A.3.2卧式高压锅灭菌装锅前检查进水水管是否妥善连接水箱进水管，是否无漏水现象，将水箱工作开关调至“加热”位置，观察加水指示灯是否正常加水。设置参数为灭菌室温度121℃（灭菌室相应压力0.14Mpa灭菌时间25min，排气设置为“微排”。A.3.3立式高压灭菌锅装锅前关紧放水阀，往外桶内加入自来水，水位至灭菌桶搁脚处（挡水板下），装入盛有培养基半成品的组培瓶后，关闭、锁紧灭菌锅盖，按锅上设置按键设定A3.2条的灭菌参数（灭菌时间设置为30min灭菌结束蜂鸣声响起后关闭电源，待其冷却直至压力表指针回至零位时打开放汽阀排尽余汽，打开外桶盖才能取出灭菌物。A.4灭菌后的物品应及时转运至培养基储备室摆放整齐。DB5306/T19—20197（规范性附录）容器和培养基质量标准B.1用瓶质量标准B.1.1培养容器为广口罐头透明玻璃瓶。B.1.2洗涤洗涤溶液为清澈透明加有洗衣粉的自来水，在25℃水温下，洗衣粉用量（0.16g～0.17g/L）。B.1.3裂损瓶定义瓶口缺口超过5mm的和裂纹瓶。B.1.4洗后质量标准B.1.4.1瓶内无残存洗衣粉，检测方法是用未沾有洗衣粉、肥皂、洗洁精等洗涤物质的湿手指，擦试新洗出的瓶内、外壁无滑溜感。B.1.4.2表面无原有标签印记。B.1.4.3瓶内外壁无污物、无污痕。B.1.4.4洗净瓶的摆放和晾贮洗净后的瓶需反扣在周转箱或筐中，堆码在干净干燥处，堆码高度不超过150cm，码在桌子上的可堆到160cm，用前瓶内外不能有明显的水痕。B.2培养基B.2.1培养基种类MS+蔗糖30g/L，琼脂4.5～5.0g/L，灭菌前pH5.8～6.0。B.2.2配制母液用水纯净水。B.2.3母液的存放配制好的母液贮存在塑料桶或玻璃瓶内，标记清楚后，除大量元素外都存放在4℃~5℃的冰箱内。各母液桶（瓶）一旦标记好后，今后不能调换使用，下次使用时只能贮存同一种贮备母液。B.2.4配制培养基用水清澈透明的自来水。B.2.5培养基用量DB5306/T19—20198B.2.5.1用240ml瓶做栽培苗时，培养基厚度为18mm±1mm；每瓶培养基灌装量为30mL±1.5mL，每升培养基灌装33瓶±1瓶。B.2.5.2用350ml瓶在做栽培苗时，培养基厚度为18mm±1mm；每瓶培养基灌装量为48mL±1.5mL，每升培养基灌装21瓶±1瓶。B.2.6培养基半成品的熬制B.2.6.1按预定的用量称取琼脂和白糖，分别存放在搪瓷钵等容器内。B.2.6.2在用于熬制培养基半成品的钢精锅作好10L、20L的水位标记线。B.2.6.3用钢精锅装好预定量3/4的清澈自来水，放在电磁炉上调至2000℃档位，先用冷水浸泡琼脂粉5min，待水沸腾时放入琼脂，并用不锈钢勺不停搅动；当水快开时将炉温调至1000℃档位，随后往锅内倒入白糖，并用不锈钢勺不停搅动，至琼脂白糖都完全溶化时关闭电磁炉，加入母液，并用清水洗2次盛母液的容器，再加入余下的水至10L或20L的水位线（此阶段称为定容）。经充分搅拌后，用酸度计量pH值，用1N盐酸（HCl）或氢氧化钠（NaOH）或氢氧化钾（KOH）调整pH值至5.8～6.0，再开电磁炉将锅内培养基半成品烧至沸腾时关闭电磁炉。B.2.6.4用不锈钢勺手工分装培养基半成品至组培瓶中，按B2.5培养基用量装入。B.2.6.5用灌装机灌装培养基半成品。以上环节如用灌装机时按灌装机操作规程操作，当灌装机内培养基半成品中的琼脂粉完全溶化时，用酸度计量pH值，用1N盐酸（HCl）或氢氧化钠（NaOH)调整pH值至5.8～6.0，再打开灌装开关分装培养基半成品至组培瓶中。B.2.71N盐酸（HCl）和1N氢氧化钠（NaOH)的配制B.2.7.11N盐酸即取90mL37.01%的盐酸（HCl）加入1000mL纯净水中轻摇匀。B.2.7.21N氢氧化钠（NaOH）的配制即称40g氢氧化钠（NaOH)溶于1000mL纯净水中溶解。B.2.8成品培养基的存贮成品培养基堆码高度不超过150cm（码在桌子上不超过160cm），摆放在干净干燥处，即空气洁净度30万级，温度23℃±1℃、相对湿度30%～40%的密闭环境内。室内屋顶每10㎡装40W紫外灯管1支或每20㎡房间安装臭氧发生量4～7g/h的臭氧消毒机1台。B.2.9培养基存贮后的质量标准B.2.9.1外在质量培养基保持正常的凝固状态，即将瓶倾斜45°角5s后培养基不流淌、轻晃瓶后培养基不散；表面平整光滑；瓶口以下内外壁均无培养基；培养基内有少量的直径为1mm（芝麻大小）以下气泡为正常现象；瓶盖松脱率≦0.5%、破损率≦0.5%。B.2.9.2内在质量存贮5天后的污染率≦0.5%。DB5306/T19—20199（规范性附录）无菌操作技术C.1接苗前的准备C.1.1超净工作台的使用超净工作台标准须符合YY0569-2005生物安全柜标准。开启电源开关，启动鼓风机使超净工作台处于工作状态，同时打开超净工作台上的紫外灯对超净工作台的台面进行消毒（接种时关闭20min后即可使用。C.1.2开启室内紫外灯30min。C.1.3换鞋。C.1.4洗手，先用洗手液洗，在自来水上冲洗2～3min，再用75%酒精喷手抹匀。C.1.5穿戴整齐工作服、口罩、帽子，将手机存入衣帽柜。C.1.6关闭紫外灯。C.1.7检查接种室窗子是否完全关闭，如有开着的窗子，应关闭。C.1.8将当节或当天需用的培养基、灭过菌的吸水纸（每人每节工作时间两包灭菌纸）等送入接苗C.1.9每个接苗时段只能安排一个编号的基础苗进入接种室。C.1.10将灭过菌的镊子、剪刀插入灭菌器内灭菌，850℃电热灭菌器应严格按使用说明书轻插器具、每隔3h调至低温档冷却后才重新调至850℃使用的规定。C.1.11核查基础苗的标签是否完整和有无污染。C.1.12用酒精擦试超净工作台内腔壁等接种仪器、工具。C.1.13将一次所需接苗量的培养基（4～8瓶）用75%酒精擦试后摆在超净工作台一侧。C.2接苗C.2.1检查核实当节各自的基础苗的编号是否完全为同一个编号、标签是否完整无误、是否有污染。C.2.2用75%酒精浸湿灭过菌的吸水材料如纯棉口罩或小手帕擦试培养基瓶和基础苗瓶。C.2.3将灭过菌的吸水纸用镊子夹出后反铺在超净工作台上，每次四张、各两层。C.2.4轻旋松开培养基瓶盖。DB5306/T19—2019C.2.5以一瓶基础苗为一个接苗单元，用灭好菌并冷却了的剪刀在瓶内将苗从基部剪断，并用剪刀夹出轻放在吸水纸上，在此操作过程中瓶口不得离开超净工作台送风区域。C.2.6将每一苗剪成带有1个叶片的茎段，苗尖部分带2个以上完整叶片，苗尖部分另放；过长茎段上如无小叶应剪除。C.2.7将培养基瓶盖取放在超净工作台或待用的培养基瓶上，盖口向上。C.2.8将茎段、苗尖分开均匀正插（苗要插入培养基1mm）或平铺于培养基表面，平铺时应使苗与培养基紧密接触。每瓶接苗数量按不同品种、时间的规定接入茎段量。C.2.9每接完一瓶应及时轻盖好已接好苗的瓶子，盖时瓶盖不得擦碰到瓶外壁，待接完一瓶基础苗（母瓶）后再将接好苗的瓶子盖紧或扎紧。C.2.10每接完一个编号的苗均应及时在瓶上写上与基础苗（母瓶）完全一致的编号，再写接苗人编号及接苗时间。C.2.11接完一瓶基础苗后更换吸水纸、剪刀、镊子，并重新擦试超净工作台。C.2.12操作过程上不得将接苗器具离开超净工作台送风区域，接苗器具不得碰到苗、吸水纸、瓶内壁以外的任何器物和地方。C.2.13接苗过程中取吸水纸时和手的移动均不得在铺好的吸水纸上经过。C.2.14接苗过程中剪刀和镊子摆放时应摆放在在吸水纸上，但要注意未进入灭菌器灭菌的部分不得与吸水纸接触。C.2.15接苗过程中不得面对超净工作台咳嗽和频繁离开超净工作台。C.3接后工作C.3.1每接完一个编号的苗均应及时将接好的苗送入培养室按培养室管理规定摆在培养架上。C.3.2每天接完苗后均应及时清理接种室内留剩余的空瓶、封口膜、扎瓶线及其他需清理的物品。C.3.3关闭室内超净工作台电源、电热灭菌器电源和其他电器如取暖器及空调等。C.3.4将抹超净工作台的小帕子晾于医用手推车的栏杆上,定期清洗小手帕。C.3.5准确记录并于第二天与培养室管理人员核对当天的接苗品种和数量。C.3.6清洗接苗工具（剪刀、镊子）。C.3.7关好接种室。C.3.8衣帽、口罩摆放在接种室当晚用紫外灯灭菌。C.4其他C.4.1逢阴雨天降雨30min后开窗换气30min。DB5306/T19—2019C.4.2注意超净工作台及其他仪器的运转是否正常。C.4.3每3个月为一个周期，需清洗或更换超净工作台过滤网。C.4.4需对接种室进行每月定期甲醛+高锰酸钾熏蒸。DB5306/T19—2019（规范性附录）组培室卫生标准D.1卫生标准D.1.1器具物品卫生标准以下仪器设备表面及常开内腔壁应保持无尘、无污渍、无杂物、无碎玻璃。D.1.1.1超净工作台。D.1.1.2电热灭菌器。D.1.1.3取暖器。D.1.1.4高压灭菌锅。D.1.1.5不锈钢工作台。D.1.1.6空调外部、顶部、叶扇。D.1.1.7其他物品的内外表面。D.1.2物件堆放整齐。D.1.3地面卫生标准接种室，走道，光照培养室，楼梯应无残存培养基、无线、无塑料膜等杂物。D.1.4房间四壁无污痕。D.1.5水池所有眼见部分及滤渣箩筐和洗拖把的桶应无污斑、无残渣、无碎玻璃。D.1.6拖把及洗拖把桶D.1.6.1接种室、光照培养室、灭菌室、洗涤室应分开用。D.1.6.2在桶里用清水杵5次水不明显变混浊。D.1.6.3无残渣、头发绺。D.1.7扫把、撮箕、垃圾箩无残存培养基、无厚污痕、无残渣、头发绺。D.1.8培养架D.1.8.1台面无污痕和手试后无尘。D.1.8.2万能角钢无污痕。D.1.9个人卫生DB5306/T19—2019D.1.9.1