无细胞蛋白合成方法对抗菌肽LR-X抑菌活性的筛选

[24]。综上所述，AMPs结构和作用机制多样，使其在抗菌、免疫调节及抗癌等领域具有广泛的应用潜力。可用于新型抗菌制剂开发、免疫疗法创新及抗癌药物设计，应用前景广。其多靶点、低耐药性的特征，更凸显出其极高的研究价值。第三章材料与方法3.1试验材料3.1.1试验菌株及抗菌肽来源大肠杆菌（E.coliATCC25922）。化学合成抗菌肽LRGG（LLRLLRRGGRRLLRLL-NH2）是实验室前期经过从头设计由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。3.1.2试验试剂表3-1主要试验试剂Table3-1Fortestagents试剂名称厂家盐酸北京化工厂冰乙酸北京化工厂氯化钠北京化工厂BCA蛋白浓度测定试剂盒BBI甲醇北京化工厂甘油北京化工厂甘氨酸北京索莱宝科技有限公司标准分子量蛋白Marker北京索莱宝科技有限公司质粒提取试剂盒北京全式金生物技术有限公司考马斯亮蓝G-250北京索莱宝科技有限公司SDSBBI三(羟甲基)氨基甲烷北京索莱宝科技有限公司25%戊二醛麦克林2XTaqPCRMastermix天根生化科技（北京）有限公司无水乙醇北京化工厂产物纯化试剂盒Vazyme酵母粉北京西美杰科技有限公司胰蛋白胨北京西美杰科技有限公司苯甲脒上海康朗生物科技有限公司PMSF碧云天琼脂糖BBISeamlesscloningMasterMixBBITricine-SDS凝胶试剂盒北京索莱宝科技有限公司塑料层析柱无锡天演生物技术有限公司Ni-NTASefinose(TM)Resin6FF(SettledResin)BBI超低分子量蛋白Marker北京索莱宝科技有限公司3.1.3试验仪器表3-2主要仪器Table3-2Maininstruments仪器厂家型号PCR仪EppendorfMCnexusX2电泳仪北京市六一仪器厂DYY-6D型水平摇床北京市六一仪器厂WD-9405B型HH.CHP-TCO2培养箱上海一恒实验仪器有限公司BPN-50CH(UV)荧光酶标仪瑞士TECANSPARKALLEGRA医用离心机贝克曼库尔特（美国）股份有限公司X-15R电子显微镜日本OlympusGX53M电子天平浙江纪铭科技有限公司监制JCS-21002C精细电子天平日本岛津制作所ATY2243.2试验方法3.2.1构建pLC-LRGG表达载体以及L-Ala替换的16个LRGG构象的变构体获得LRGG目的基因参照抗菌肽LRGG的基因序列，通过Snapgene软件设计引物LR1、LR2和LR3，引物序列如表3-3，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用Gibson组装的方法，将LRGG-F、LR1、LR2和LR3这四个寡聚核苷酸片段进行融合PCR，采用pfuDNA聚合酶对寡聚核苷酸互补后的单链补齐碱基，pfuDNA聚合酶用于连接切口，反应体系如表3-4。完成PCR反应后，通过2%琼脂糖凝胶电泳对产物进行分离，并使用凝胶回收试剂盒对目标条带进行回收。回收后的DNA浓度通过NanoDrop1000进行测定，要求OD260/280比值在1.8~2.0之间，以确保DNA样品的纯度和质量满足后续实验需求。图3.1pLC-LRGG质粒图谱Figure3.1pLC-LRGGplasmidmap获得L-Ala逐个替换的16个LRGG目的基因设计16对引物，引物序列详见表2-3。每对引物均在其变构位置将原有氨基酸替换成丙氨酸序列，与表2-3中所示的融合引物5'UTR-F和3'UTR-R进行PCR反应，得到每一个不同构象的LRGG变构体，如图3.2。进行2%琼脂糖凝胶电泳、胶回收PCR产物（参照北京全式金公司QuickGelExtractionKit说明书）。用NanoDrop1000测回收后的浓度。图3.2融合PCR替换氨基酸质粒图示Figure3.2SchematicdiagramofaminoacidplasmidreplacedbyfusionPCR无缝克隆连接pLC载体与不同构象的LRGG目的基因使用回收的线性化pLC载体，分别与所有16个不同构象的LRGG变构体的目的基因片段进行无缝克隆连接，连接体系如表3-5，涡旋振荡使其充分混匀。置于50℃恒温金属浴或水浴锅中孵育20min完成连接反应。反应终止后随即将连接产物放置在冰上冷却，随后将连接产物转化至大肠杆菌DH5-α感受态细胞中进行克隆筛选。表3-4Gibson组装体系（50μL）Table3-4Gibsonassemblysystem（50μL）组分含量LRGG-FLR1LR2LR32μL2μL2μL2μL2XTaqPCRMastermix25μLSterilizedddH2O补足50μL表3-5无缝克隆连接体系Table3-5Seamlesscloneconnectionsystem组分含量2×SeamlesscloningMasterMix10μL线性化载体50-100ng目的基因片段Xng去离子水补足20μL注：目的片段与线性化载体的摩尔比在2∶1~3∶1之间。3.2.2pLC-LRGG的无细胞表达无细胞蛋白表达系统是实验室前期构建并优化的。在无细胞体系中加入pLC-LRGG模版DNA，在26℃条件下反应6h，设置荧光蛋白对照组，通过荧光强度实时监测蛋白表达情况，在这里使用丙酮浓缩蛋白法，该方法是一种常用的蛋白质沉淀和浓缩方法，适用于从复杂样品中分离和浓缩蛋白质。利用丙酮的脱水作用，使目的蛋白从溶液中沉淀出来，从而实现浓缩和纯化。具体方法如下：（1）样品准备：将含有目标蛋白的溶液置于冰上，确保样品温度保持在4℃以下。如果样品中含有高浓度的盐或其他干扰物质，可先用透析或超滤法进行预处理。（2）丙酮沉淀：取适量样品（如1mL）加入预冷的丙酮（4倍体积，如4mL），轻轻混匀。将混合物置于-20℃冰箱中，静置1-2h或过夜，使蛋白质充分沉淀。（3）离心收集沉淀：将混合物在4℃、10,000×g条件下离心10min。小心弃去上清液，保留沉淀。（4）洗涤沉淀：加入适量预冷的丙酮（如1mL），轻轻悬浮沉淀。再次在4℃、10,000×g条件下离心10min，弃去上清液。（5）溶解沉淀：将沉淀置于冰上，加入适量缓冲液（40μL5×上样Buffer＋50μL水），轻轻混匀，使蛋白质重新溶解。对于分子量范围为1-10kDa的小分子蛋白或多肽的分离，本研究采用Tricine-SDS电泳技术。凝胶采用三层结构：上层为8mm浓缩胶，中层为12mm夹层胶，下层为分离胶。电泳条件设置为：初始电压30V运行1h，随后调整至100V直至BPB指示剂到达凝胶底部。为维持蛋白质稳定性，整个电泳过程在4℃低温环境下进行（可使用冰箱或预冷泡沫箱）。电泳结束后立即将凝胶浸入新配制的固定液，室温摇床处理30min。随后使用含40%甲醇和10%醋酸的考马斯亮蓝R-250溶液（0.25%，w/v）染色。最后，使用脱色液进行脱色处理，直至背景清晰、条带明显。Westernblotting是一种广泛应用于分子生物学和生物化学的实验技术，用于检测特定蛋白质在复杂样品中的表达水平和分子量。操作方法如下：‌将制备好的凝胶安装在电泳槽中，加入电泳缓冲液，样品经煮沸变性后上样，在80-120V恒压条件下进行SDS电泳分离。将PVDF膜用甲醇激活，浸泡于转膜缓冲液中。电泳结束后，将凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上，按照“三明治”结构（负极-海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-正极）组装转膜装置，进行蛋白质转移。‌转膜完成后，用封闭液在室温下封闭1h，以阻断膜上的非特异性结合位点。随后依次加入特异性一抗（4℃孵育过夜）和HRP标记的二抗（室温孵育1h），每次孵育后均用TBST缓冲液洗涤3次，每次10min。在暗室中加入化学发光底物，曝光显影，扫描胶片并进行数据分析。‌过程中需要注意‌：所有提取步骤需在低温环境下完成，保持样品始终置于冰浴中，以防止温度升高引起蛋白水解酶激活导致的靶蛋白降解。3.2.3无细胞表达产物的生长曲线测定无细胞蛋白表达技术为抗菌肽的高效生产提供了一种灵活、快速的方法，而抗菌肽的活性测试则是评估其功能和应用潜力的关键步骤。抗菌肽的生长曲线是评估抗菌肽杀菌效果的重要工具，通过绘制菌落形成单位（CFU）随时间变化的曲线，可直观地反映抗菌肽的杀菌速率和效果。操作方法如下：以大肠杆菌（E.coliATCC25922）为革兰氏阴性菌的代表。接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（OD600nm≈0.6-0.8）在96孔板中，每个不同构象的抗菌肽的无细胞反应量为50µL，在37℃下孵育8h。无细胞混合物直接用于大肠杆菌的活性检测。将细胞用LB稀释至10-4cfu/mL，将64µL稀释后的细胞加入96孔板的孔中，事先加入16µL无细胞反应混合物(产生amp)。将培养物混合，并用透气性薄膜将培养皿密封。设置阴性对照及阳性对照，每组设置3个重复，酶标仪测定每组的OD600nm值，每隔1h测量一次，在37°C下摇晃20h。分析生长曲线中抗菌肽对细菌生长的影响。3.2.4抗菌肽LR-X的3D结构预测抗菌肽的结构与其功能密切相关，因此分析其构象对于理解其抗菌机制和优化设计具有重要意义。以下是一些常用的在线软件和工具，可用于分析不同构象抗菌肽的结构：（1）SWISS-MODEL功能：用于蛋白质的同源建模，预测抗菌肽的三维结构。网址：/使用方法：输入抗菌肽的氨基酸序列。选择模板蛋白（与目标序列同源性较高的已知结构）。生成三维结构模型并下载。（2）I-TASSER功能：基于模板和无模板的蛋白质结构预测，适用于抗菌肽的从头结构预测。网址：/I-TASSER/使用方法：输入抗菌肽的氨基酸序列。选择预测模式（如标准模式或快速模式）。生成三维结构模型并下载。（3）PEP-FOLD功能：专门用于小肽（如抗菌肽）的三维结构预测。网址：https://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD/使用方法：输入抗菌肽的氨基酸序列。选择预测参数（如溶剂条件、温度等）。生成三维结构模型并下载。（4）PDB(ProteinDataBank)功能：提供已知蛋白质结构的数据库，可用于查找与抗菌肽结构相似的模板。网址：/使用方法：输入抗菌肽的序列或关键词进行搜索。下载相关结构文件（如PDB格式）。（5）PyMOL功能：用于蛋白质结构的可视化与分析。网址：/2/使用方法：导入抗菌肽的三维结构文件（如PDB格式）。使用工具栏进行结构可视化、旋转、缩放等操作。分析抗菌肽的二级结构（如α-螺旋、β-折叠）和关键残基。具体操作步骤：序列输入与结构预测使用SWISS-MODEL，输入抗菌肽的氨基酸序列，生成三维结构模型。使用PyMOL导入生成的三维结构文件，进行结构可视化。分析抗菌肽的二级结构（如α-螺旋、β-折叠）和关键残基。使用PyMOL比较不同构象抗菌肽的结构差异。分析构象变化对抗菌活性的影响。3.2.5无细胞蛋白表达最优丙氨酸替换结构由抗菌肽活性测试及Pymol软件分析结果，筛选出最优LRGG变构体结构。将其作为模板DNA通过无细胞表达，SDS验证其是否成功表达并将表达产物用于后续实验。3.2.6抗菌肽LRGG和LR-8的抑菌活性测定最低抑菌浓度（MinimumInhibitoryConcentration,MIC）测定是评估抗菌药物或抗菌肽对细菌抑制效果的标准方法，而抑菌圈实验是一种常用的定性方法，用于评估抗菌物质（如抗菌肽）对细菌的抑制效果。通过测量抑菌圈的大小，可以直观地比较不同抗菌物质的抗菌活性。操作方法如下：（1）菌液准备：将目的菌种接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（OD600nm≈0.6-0.8）。用PBS缓冲液洗涤菌体，调整菌液浓度至10⁵-10⁶CFU/mL。（2）抗菌肽稀释：将抗菌肽溶液用培养基进行稀释，制备不同浓度的抗菌肽溶液。（3）接种菌液：在96孔板中，每孔加入100μL稀释后的抗菌肽溶液。每孔加入100μL菌液，使最终菌液浓度为10⁵CFU/mL。设置空白组（仅培养基）、阴性对照（仅菌液）和阳性对照（多粘菌素B＋菌液）。（4）培养与观察：将96孔板置于37℃培养箱中培养16-24h。观察孔板中菌液生长情况，记录各孔的浑浊度。（5）结果判定：以完全抑制菌液生长的最低抗菌肽浓度作为MIC值。第四章结果与分析4.1pLC-LRGG表达载体以及16个不同构象达载体的构建4.1.1构建pLC-LRGG表达载体线性化的载体和扩增的LRGG目的基因经无缝克隆连接转化后，琼脂糖凝胶验证后条带大小与理论分子量一致，pLC载体与LRGG连接后经琼脂糖凝胶电泳验证目的条带为132bp，由此可以证明pLC-LRGG表达载体构建成功，如图3.3所示。图3.3pLC-LRGG表达载体的构建Figure3.3ConstructionofpLC-LRGGexpressionvectorM:Trans2KDNAMarker,1-3:无缝克隆连接菌落PCR验证4.1.2构建16个不同构象的表达载体图3.4pLC-LRGG不同构象表达载体的构建Figure3.4ConstructionofpLCLRGGexpressionvectorswithdifferentconformationsA.融合目的基因胶回收验证M:Trans2KDNAMarker,1、2:不同构象融合目的基因B.T7引物菌落PCR验证无缝克隆连接后的目的基因；M:Trans2KDNAMarker,1、2:变构目的基因将融合PCR得到的目的基因进行2%琼脂糖凝胶电泳、胶回收PCR产物（参照北京全式金公司QuickGelExtractionKit说明书）。用NanoDrop1000测回收后浓度。胶回收验证琼脂糖凝胶验证后条带大小与理论分子量一致，大小为674bp。如图3.4A所示。线性化的载体和丙氨酸替换的不同构象的目的基因经无缝克隆连接转化，通过菌落PCR经琼脂糖凝胶电泳验证连接后的目的基因目的条带为271bp，与理论值一致，如图3.4B所示。（剩余14个不同构象表达载体图示见附录）提取16个不同构象表达载体质粒，送至生工生物工程（长春）股份有限公司测序。测序结果如图3.5所示，由此可证明不同构象的表达载体构建成功。图3.516个LRGG变构体测序结果图Figure3.5Sequencingresultsof16LRGGvariantsA.L1-L4B.L5-LR-8C.L9-L12D.L13-L164.2无细胞表达pLC-LRGG抗菌肽将pLC-LRGG作为底物模板添加到无细胞体系中，26℃条件下反应6h后，处理样品，进行Tricine-SDS和Westernblot验证目的蛋白是否表达，Tricine-SDS结果如图3.6所示，在1.6KDa处有与目的蛋白大小相等的条带，但是由于阴性对照以及阳性对照均有与目的蛋白大小相等的条带产生，故暂且无法证明目的蛋白已经表达。接下来，将无细胞反应后的产物进行Westernblot验证，结果如图3.7所示，3、4孔道在1.6KDa处仍有与目的蛋白大小相等的条带，由此可以证明pLC-LRGG在无细胞体系中成功表达。图3.6pLC-LRGG无细胞表达后的Tris-tricine-SDS分析图（反应6h）Fig.3.6TristricineSDSanalysisofpLC-LRGGwithoutcellularexpression(Reactiontimeof6hours)1:阴性对照2:阳性对照3:pLC-LRGG图3.7pLC-LRGG无细胞表达后的Westernblot分析图Fig.3.7WesternblotanalysisofpLC-LRGGwithoutcellularexpression1：pLC-LRGG2：阳性对照3：阴性对照4.3无细胞表达产物的生长曲线测定将4.3.1构建好的共17个表达载体均进行无细胞表达反应，反应完成的混合物直接用于大肠杆菌的活性检测。设置阴性对照及阳性对照，每组设置3个重复，酶标仪测定每组的OD600值，每隔1h测量一次，在37°C下孵育20h。分析生长曲线中抗菌肽对细菌生长的影响。结果如图3.8所示，LR-8即第8位氨基酸替换的抑菌效果最好。在此基础上，将LR-8与LRGG单独进行比较，结果如图3.9所示，LR-8与100μg/mL的抗生素杀菌效果相当，LRGG的杀菌效果介于10μg/mL的抗生素和1μg/mL的抗生素之间。由此可得，LR-8具有比LRGG更加良好的抑菌效果。图3.8LRGG0-16号生长曲线Fig.3.7LRGG0-16growthcurve图3.9LRGG和8号氨基酸替换变构的生长曲线Fig.3.9GrowthcurvesofLRGGandaminoacidsubstitutionconformationalchangesatposition84.4抗菌肽LR-X的3D结构预测将所有抗菌肽的氨基酸序列至SWISS-MODEL，生成三维结构模型。使用PyMOL导入生成的三维结构文件，进行结构可视化。使用PyMOL比较不同构象抗菌肽的结构差异。分析构象变化对抗菌活性的影响。如图3.10可得，LR-8的替换位点会导致LRGG的结构发生很明显的变化，结合生长曲线结果表明，丙氨酸替换的第8位氨基酸结果为最优结构。图3.10.抗菌肽L1-L16三维结构模型Figure3.103Dstructuralmodelofantimicrobialpeptides1-164.5无细胞蛋白表达最优丙氨酸替换结构确定出最优结构后进行无细胞表达反应，反应完成纯化后进行SDS验证其是否成功表达，并将表达产物用于后续实验，SDS结果如图3.11所示。在1.6KDa处出现与目的蛋白大小相等的条带，但由于小分子肽不稳定，会出现如图示类似小山样的条带。图3.11LR-8经无细胞蛋白表达纯化后的Tris-tricine-SDS分析图Figure3.11TristricineSDSanalysisofLR-8afterCell-FreeProteinSynthesis1：上样前2：穿出3、4：50mM咪唑洗涤5、6、7：500mM咪唑洗脱4.6抗菌肽LRGG和LR-8的抑菌活性测定采用标准微量肉汤稀释法测定了抗菌肽LRGG及其变构体LR-8的最低抑菌浓度（MinimumInhibitoryConcentration,MIC）。如表3-3所示，抗菌肽LRGG和LR-8对革兰氏阴性菌有较好的广谱抑菌活性。表3-3抗菌肽对大肠杆菌（E.coliATCC25922）的MICsTable3-3MICsofantimicrobialpeptideagainstEscherichiacoliATCC25922TestStrainsMICs(μg/mL)LRGGLR-8E.coliATCC2592284第五章结论与展望本研究构建了16个LRGG丙氨酸替换的表达载体LR-X（1-16），使用生物信息学软件分析了其3D结构，测定生长曲线确定了最优变构位点，还验证了CFPS技术的高效性，证实了其在抗菌肽开发中的实用性REF_Ref11234\r\h[25]，为多肽药物筛选提供了实验范式；通过结构导向设计优化了LRGG功能活性，揭示了抗菌肽的分子作用机制REF_Ref11276\r\h[26]，通过结构导向设计优化了LRGG功能活性，揭示了抗菌肽的分子作用机制，候选肽LR-8具有优异抑菌活性，这为革兰氏阴性菌感染研究奠定基础REF_Ref11322\r\h[27]。未来可通过分子动力学模拟实验解析其抑菌机制，引入非天然氨基酸或化学修饰（如聚乙二醇化）REF_Ref11361\r\h[28]增强LR-8的蛋白酶抗性，评估其对铜绿假单胞菌等耐药菌的效果REF_Ref9490\r\h[6]。当前研究限于体外实验，需通过动物感染模型验证LR-8的体内药效学与安全性REF_Ref192257575\r\h[29]，需探究其药代动力学特性，如半衰期和组织分布。此外，人工智能可预测抗菌肽序列，如生成对抗网络是一种有效工具REF_Ref11495\r\h[30]，结合CFPS技术可加速筛选，形成设计-合成-测试闭环REF_Ref11469\r\h[31]，可探索万亿级化学空间；同时，需开发低成本、高通量的无细胞反应体系REF_Ref11531\w\h[32]，推动工业化生产。耐药性机制有待进一步研究，需进行连续传代实验监测LR-8对耐药性发展的影响REF_Ref11557\w\h[33]，并通过转录组学揭示其作用靶点，分析耐药逃逸途径REF_Ref11586\w\h[34]。要研发新型抗菌药物替代抗生素，应加强合成生物学、计算化学与临床医学的交叉合作REF_Ref11609\w\h[35]，构建完整研发链条十分重要，从分子设计到临床转化都要全覆盖；建立抗菌肽活性与毒性的统一评价标准REF_Ref11635\w\h[36]，促进不同研究间的数据可比性与资源共享；同时，政府与药企应加大对新型抗菌肽研发的投入REF_Ref8931\w\h[1]，优先支持针对多重耐药菌的创新药物开发。本研究为抗菌肽的高效开发提供了技术参考，但临床应用仍需系统性的验证。未来研究要聚焦技术优化与机制深化，以应对全球抗生素耐药性危机。7参考文献WorldHealthOrganization.Globalantimicrobialresistanceandusesurveillancesystem(GLASS)report[R].2023.HANCOCKREW,SAHLHG.Antimicrobialandhost-defensepeptidesasnewanti-infectivetherapeuticstrategies[J].NatureBiotechnology,2006,24(12):1551-1557.MAHLAPUUM,HAKANSSONJ,RINGSTADL,etal.Antimicrobialpeptides:anemergingcategoryoftherapeuticagents[J].FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology,2016,6:194.ZHANGLJ,GALLORL.Antimicrobialpeptides[J].CurrentBiology,2016,26(1):R14-R19.NIZETV,OHTAKET,LAUTHX,etal.Innateantimicrobialpeptideprotectstheskinfrominvasivebacterialinfection[J].Nature,2001,414(6862):454-457.VELKOVT,ROBERTSKD,NATIONRL,etal.Pharmacologyofpolymyxins:newinsightsintoan'old'classofantibiotics[J].FutureMicrobiology,2013,8(6):711-724.FJELLCD,HISSJA,HANCOCKREW,etal.Designingantimicrobialpeptides:formfollowsfunction[J].NatureReviewsDrugDiscovery,2012,11(1):37-51.CARLSONED,GANR,HODGMANCE,etal.Cell-freeproteinsynthesis:applicationscomeofage[J].BiotechnologyAdvances,2012,30(5):1185-1194.HONGSH,KWONYC,JEWETTMC.Cell-freeproteinsynthesisfromareleasefactor1-deficientEscherichiacoliactivatesefficientandmultiplesite-specificnonstandardaminoacidincorporation[J].ACSSyntheticBiology,201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