卵泡液多组学研究进展与生殖医学应用

卵泡液多组学研究进展与生殖医学应用【摘要】在辅助生殖技术（assistedreproductivetechnology，ART）中，卵母细胞质量及其所影响的胚胎发育潜能，是决定其临床结局的重要因素。作为卵母细胞发育的核心微环境，卵泡液对于反映卵泡代谢、卵母细胞衰老以及核心信号通路转导等过程具有重要的作用。随着代谢组、蛋白组等多组学技术的不断发展，卵泡液的多组学分析也为了解卵母细胞的生长状态、能量代谢水平、氧化应激调控和胚胎发育潜能提供了新的窗口，同时在不孕症患者的诊疗中，有助于指导个体化促排卵、囊胚培养优化以及精细化ART策略。然而目前也面临着样本有限，成本高等问题，未来需强化多中心研究、降低检测成本，促进人工智能在卵泡液多组学研究中的应用。本文以卵泡液为核心，结合近些年相关文献，总结卵泡液的生物学基本特征、卵母细胞衰老机制、卵泡液多组学研究进展及其在ART诊疗中的相关应用最新进展，以期为不孕症患者的辅助生殖精准医学诊疗提供一研究总结。【关键词】卵泡液；卵母细胞；精准医学；辅助生殖；多组学近些年来，伴随着不孕症患病率的不断升高，辅助生殖技术（assistedreproductivetechnology，ART）在其诊疗过程中发挥着重要作用。尽管随着科技的进步，ART也获得了长足发展，然而体外受精/卵胞质内单精子注射（invitrofertilization/intracytoplasmicsperminjection，IVF/ICSI）的平均成功率仅为30%~40%，因此现阶段优化ART诊疗的核心目标就是提高其成功率［1］。在影响ART成功率的因素中，卵母细胞质量是其中最为重要的内容之一。传统评估卵母细胞质量的手段，主要依赖其结构学特征，比如极体状态，然而该方法具有较强的主观性，对于卵母细胞内部的代谢状态、信号通路活性等无法进行反映，因此也限制了ART精准诊疗的发展。卵泡液并非单纯的被动滤过液，而是由血浆成分、颗粒细胞与卵丘细胞分泌产物、卵母细胞旁分泌信号以及细胞外囊泡共同构成的动态信息体系；其分子组成会随卵泡发育阶段、患者年龄、疾病背景及促排卵状态发生系统性变化，因而具有反映卵泡微环境真实状态的独特优势［2］。随着质谱分析、基因测序和高通量组学技术迅速发展，卵泡液的蛋白组、转录组、代谢组学等均可进行系统解析，为研究卵母细胞质量、受精能力和胚胎发育潜能、囊胚形成和植入提供了新的研究平台［3］。有高通量测序研究观察到，卵泡液中的能量代谢通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白信号通路活性、氧化应激蛋白和外泌体miRNA水平可以预测胚胎发育结局，其评估效果显著优于传统形态学［4］。此外，卵泡液分子谱差异还可指导个体化促排卵、补充抗氧化剂、调整培养液能量底物等诊疗策略，改善卵母细胞微环境，继而改善ART结局［5］。基于上述背景，本文围绕卵泡液作为多组学研究载体的生物学基础、卵母细胞衰老相关分子通讯、不同组学层级的技术特征及其在生殖医学中的应用进展进行系统综述，并重点讨论不同不孕相关状态的分子异质性及其临床转化意义，以期为ART精准评估与个体化干预提供理论参考。一、卵泡液的生物学特性1.卵泡液的来源与生物学意义：卵泡液是包围于卵母细胞与放射冠细胞外侧、充填于卵泡腔内的局部微环境液体，由卵母细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞以及卵泡基质血管的滤过液共同组成，是卵泡发育过程中最重要的生化介质之一。由于卵泡液形成过程伴随卵泡生长、细胞分化及旁分泌/缝隙连接通讯的动态重塑，故其本身即承载着卵泡发育进程的阶段性分子信息，该过程使其成为反映卵泡发育状态的重要体液样本［6-7］。卵泡液的分子组成复杂，除类固醇激素和肽类因子外，还包括调节蛋白、能量代谢中间产物、多类别脂质、核酸分子以及来源于颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞的细胞外囊泡［8］。上述成分参与营养供应、代谢调节、氧化还原平衡、炎症反应和细胞间通信。有研究表明，卵泡液分子谱的改变可以用于解释卵母细胞成熟、受精、早期胚胎发育和妊娠结局差异，现已成为ART监测与干预的重要研究方向［9］。2.卵泡液对卵母细胞发育微环境的反映：在卵母细胞成熟过程中，卵泡液既是营养物质、代谢底物与信号因子的来源，也是卵泡微环境状态的直接反映，能够从下述三个方面反映卵母细胞发育潜能和生理特征。首先，在卵母细胞的发育过程中，稳定且持续的能量供应发挥着关键的作用。卵泡液内存在多种小分子能量代谢物，比如：丙酮酸、葡萄糖和柠檬酸等，有助于研究者了解卵母细胞内部的氧化磷酸化及糖酵解水平。Zhang等［10］的研究表明：相对于发育受限的卵母细胞，成熟卵母细胞的卵泡液中乳酸浓度显著降低，三羧酸循环中间物浓度升高，提示成熟卵母细胞主要是由线粒体氧化供能。此外，Guo等［11］进行的关于卵泡液研究则表明：卵泡液中的能量代谢比值（例如：NAD+/NADH、ATP/ADP），是反映卵母细胞能量代谢的重要量化指标，同时对于预测卵母细胞受精率、囊胚发育能力等具有重要作用。其次，卵母细胞成熟及染色体稳定性高度依赖线粒体功能完整性，而氧化应激失衡是导致卵母细胞老化、DNA损伤及胚胎发育受阻的重要机制。卵泡液中所含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶，以及谷胱甘肽、4-羟基-2-壬烯醛、丙二醛（malondialdehyde，MDA）等分子，可较为敏感地反映卵泡局部氧化还原状态。Liu等［12］的研究表明，高龄、卵巢储备功能下降及多囊卵巢综合征（polycysticovariansyndrome，PCOS）患者卵泡液内抗氧化能力明显下降，且其抗氧化力与第3天的优质胚胎率和囊胚形成率呈负相关。最后，卵泡液内包含着多种信号分子，主要涉及PI3KAKT、mTOR、AMPK、炎症调控网络等关键的信号通路，其在卵母细胞的发育成熟中发挥着重要的作用［13］。Machtinger等［14］关于外泌体与miRNA的研究表明：颗粒细胞与卵母细胞之间存在有旁分析调控机制，卵泡液中外泌体的miR-21、miR-146a、miR-210等信号分子具有调控卵母细胞发育、炎症抗氧化以及细胞稳态的作用，因此上述外泌体分子可以作为了解卵母细胞内相关信号通路的潜在标志物。因此，对卵泡液进行分子解析，不但可以了解卵泡内的生化结构，而且能呈现卵母细胞内的信号传输通路的动态变化，为研究卵母细胞提供了重要的研究方向。3.卵泡液作为研究与临床样本的优势：与卵巢组织活检不同，卵泡液可以在ART的取卵过程中能够自然获得，无需增加额外操作，采样成本低、可重复性强，是ART中最便于收集的与卵母细胞配套的体液样本之一。这一特征使其便于应用于前瞻性队列研究，并支持基于训练集与验证集的预测模型构建［15］。此外，卵泡液样本具有独特的单卵泡定位属性，即来自同一卵泡的卵泡液可直接与其内的卵母细胞、受精结果及胚胎发育情况匹配，在单细胞水平上，实现生物标志物的发现与验证相对应。相较于血清等系统性体液，卵泡液样本的代表性更高，生物学解释性更强，被认为是生殖医学中最具临床转化价值的样本来源之一［16］。最后，由于卵泡液内含有多种物质，因此为整合多组学分析数据提供了天然的有利条件。在研究过程中，对卵泡液内的分子进行多组学整合分析，不仅能够从多层次宽领域理解卵母细胞发育的生理过程，使得从“单项指标”转向“多层次网络调控机制研究”，而且也对生殖医学的精准诊疗提供理论支撑［10］。二、卵母细胞衰老机制与卵泡液关联在影响女性生育能力和ART治疗效果的诸多因素中，卵母细胞的衰老占据着核心的地位。卵母细胞的衰老主要与以下4种病理改变相关：线粒体功能下降与能量衰退、氧化应激与抗氧化能力失衡、DNA损伤及修复障碍和核心信号通路调控失衡。作为卵母细胞发育的直接微环境，通过对卵泡液进行多组学整合分析，能够了解到卵泡的代谢状态以及卵母细胞的衰老水平，为深入阐明卵母细胞衰老机制提供新的研究窗口。1.线粒体功能下降与能量衰退：线粒体功能受损是卵母细胞衰老的重要基础。随着年龄增长，卵母细胞线粒体膜电位下降、呼吸链效率减弱、ATP生成减少，同时线粒体DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）拷贝数下降，导致能量供给不足及抗压能力减弱。Hu等［17］研究表明，AMPK活性下降可引起线粒体分布异常、ATP减少、mtDNA拷贝数下降，提示AMPK是维持卵母细胞线粒体功能和减轻氧化应激的关键调控因子。近些年有学者也进行了动物和体外实验，他们通过使用褪黑素、辅酶Q10等线粒体功能增强剂可以恢复老龄卵母细胞的线粒体活性、提高ATP生成并减少活性氧，从而显著改善卵母细胞成熟率和发育潜能［18］。学者Bao等［19］对卵泡液的多组学研究亦显示，随着卵母细胞中的线粒体发生功能异常，其相对应的卵泡液内能量代谢物也会出现显著改变，如NAD⁺/NADH比例异常、柠檬酸和ATP浓度显著降低，该改变同时与卵母细胞的成熟能力负相关。2.氧化应激与抗氧化能力失衡：除线粒体功能下降外，氧化应激失衡也是影响卵母细胞衰老的重要因素之一。随着年龄增加，机体抗氧化能力逐渐减弱，超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GPX）等抗氧化酶活性下降，活性氧及相关氧化产物更容易积累。Zhang等［20］在卵巢相关研究中发现，氧化应激失衡会影响卵母细胞内线粒体的正常功能，并可能进一步促进端粒缩短和细胞凋亡，从而降低卵母细胞质量，甚至参与卵巢早衰的发生。Afrough等［21］的临床研究也显示，女性年龄增长时，卵泡液中过氧化物代谢产物水平升高，而SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化指标则呈下降趋势。这种变化与卵母细胞氧化应激状态较为一致。由此来看，卵泡液在一定程度上可以反映卵母细胞氧化应激水平，也可能为卵巢功能的动态评估提供参考。3.DNA损伤及修复障碍：DNA的损伤也是衰老的重要内容，Sun等［22］的研究显示：伴随着女性年龄增大，卵母细胞内的DNA链断裂（包括单链和双链）将显著增加，同时卵母细胞内RAD51、BRCA1/2等DNA修复基因表达量降低，该过程将影响卵母细胞内染色体的稳定性，同时导致其减数分裂过程失误。在卵泡液中，可以检测修复相关蛋白（如PARP、γ-H2AX）及非编码RNA［微小RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）］的表达变化［23］。也有研究揭示，卵母细胞的表观遗传修饰改变也能通过颗粒细胞或外泌体介导，继而在卵泡液中检测出其相应变化，因此卵泡液中的相应变化可反映卵母细胞DNA损伤与修复应激状态，为进一步的功能评估和临床干预提供数据支撑［24］。4.核心信号通路调控与细胞通信网络：卵母细胞的发育与成熟受多条信号通路精细调控。PI3K-AKT、mTOR、AMPK、Sirtuin及自噬相关通路共同构成卵母细胞“营养感知—能量调控—生存维持”的核心调节网络。其中，PI3KAKT/mTOR轴主要介导细胞生长、物质合成及营养信号整合，而AMPK与Sirtuin通路则主要参与能量缺乏及氧化应激状态下的适应性调控，上述通路间的动态平衡对于维持卵母细胞代谢稳态和功能完整性具有重要意义［25］。值得注意的是，卵母细胞与卵泡液之间并非简单的单向对应关系，而是通过卵丘细胞和颗粒细胞介导形成双向通信网络。一方面，支持细胞向卵母细胞提供丙酮酸、脂肪酸代谢底物及抗氧化支持，以满足其生长发育和能量代谢需求；另一方面，卵母细胞可通过分泌生长分化因子及非编码RNA反向调控支持细胞的功能状态。上述相互作用经外泌体、蛋白质及代谢物等形式释放并汇聚于卵泡液，从而形成可检测的协同表达特征［13］。例如，卵泡液外泌体中的miR-21、miR-146a、miR-34c及miR-320a-3p分别与炎症调控、细胞稳态维持、胚胎发育质量及卵巢衰老逆转等过程相关，而ENO1、HSP90B1等外泌体蛋白则可能参与能量代谢重塑及PI3K-AKT信号调节。由此提示，卵泡液分子谱的动态变化在一定程度上能够反映卵泡内细胞通信网络的功能状态及其调控方向［26］。卵泡液与卵母细胞衰老机制相关示意图可见下图1。三、卵泡液多组学技术及研究进展伴随着分子检测技术的不断进步，现阶段在对卵泡液内分子结构解析的过程中，转录组学、蛋白组学和代谢组学等技术也在发挥着越来越重要的作用。上述多组学研究不仅有助于阐明卵母细胞发育过程与卵泡液微环境之间的相关性，而且对于深入揭示卵母细胞衰老机制以及生殖医学诊疗优化提供新的研究窗口。1.转录组学：miRNA是卵泡液转录组的重要组成部分，通过调控mRNA的稳定性和翻译，参与细胞增殖、分化、代谢及存活等关键生物过程。国内学者Gong等［27］的研究总结了多种miRNA在哺乳动物颗粒细胞（granulosacells，GC）和卵母细胞成熟中的功能，例如miR21、miR125等通过调控细胞周期、类固醇生成及细胞存活发挥作用。近年来lncRNA与环状RNA（circularRNA，circRNA）的研究也受到越来越多关注。Sun等［28］基于大样本RNAseq和细胞系的最新研究显示，多个lncRNA可能通过海绵吸附miRNA或调控转录后基因表达，进而影响与衰老相关的代谢基因，从而在卵泡衰老及卵母细胞功能丧失过程中发挥重要调控作用。在卵泡液研究中，转录组学的独特优势在于其能够较早地反映卵泡内转录后调控异常及细胞间通信变化，因此更适用于识别卵母细胞成熟异常、卵泡发育不同步及疾病相关调控网络失衡等早期事件。已有研究提示，miRNA或miRNA分子簇可通过靶向特定基因影响GC凋亡过程，例如miR-23a和miR-27a可通过Fas-FasL通路促进GC凋亡［27］。此外，lncRNADANCR可通过调控hNRNPC-p53相互作用抑制p53依赖的GC衰老，从而参与维持卵母细胞正常功能并在一定程度上延缓卵巢功能减退［28］。从疾病分层角度看，PCOS、卵巢储备功能下降（diminishedovarianreserve，DOR）及低发育潜能卵泡均可表现出不同程度的外泌体RNA或无细胞RNA异常，因此转录组学在疾病特异性分子筛查和早期风险识别方面具有较高应用价值。总体而言，转录组学为解析卵泡液中RNA水平的动态变化提供了基础，并在揭示早期转录调控异常、细胞间通信失衡及疾病特异性分子网络方面具有独特优势。2.蛋白组学：蛋白组学是利用质谱等高通量技术，对特定生物样本在一定条件下的蛋白质组成、表达量及其修饰状态进行系统鉴定与定量分析的研究方法。蛋白组学技术现在也广泛应用于卵泡液内的信息分析，通过对比不孕症患者和健康人群的卵泡液内的蛋白谱，能够了解在同卵母细胞发育成熟潜能、信号通路活性相关的蛋白分子。Debbarh等［29］对两组女性的卵泡液进行蛋白组分析，结果显示：同年轻组女性相比，高龄女性的卵泡液内同抗氧化系统（如SOD、GPX）、细胞外基质重塑以及PI3K/AKT、mTOR等信号通路相关蛋白存在显著差异。除此之外，近些年来外泌体研究也逐渐发挥着重要的作用。Liu等［26］对来源于卵泡液中的外泌体进行蛋白分析，发现高龄女性的卵泡液的外泌体中ENO1、HSP90B1、FETUB和APOC4蛋白表达量显著降低，上述外泌体蛋白可能调控PI3K/AKT通路继而影响卵母细胞质量。Liu等［30］从年轻小鼠卵泡液中分离出miR-320-3p外泌体，随后将其转移至年老小鼠的卵巢内，结果显示后者卵泡内GCs的细胞增殖和线粒体功能显著改善，该研究为治疗卵巢衰老提供了极具价值的新窗口。综上所述，蛋白组学数据有助于了解卵母细胞微环境状态以及卵母细胞发育调控的相应分子机制，能够为探索卵泡液中与生育力相关的生物标志物提供分子基础。3.代谢组学：机体的不同组织、细胞在不同的生理病理状态下代谢物各异，代谢组学就是对代谢物进行定性与定量分析，继而明确代谢物差异以及代谢分子通路的研究方法。卵泡液中的代谢物与卵母细胞功能状态以及发育微环境密切相关，因此卵泡液代谢组学分析能够评估微环境状态、卵母细胞氧化应激水平和能量供给状态。Gu等［31］对比了年轻组（<35岁，n=30）和老年组（≥40岁，n=30）女性的卵泡液代谢组数据，结果显示相比于年轻组，老年组女性的卵泡液14种代谢物升高（包括胞苷、谷胱甘肽、β-丙氨酸等）和4种代谢物降低（包括谷氨酰胺/谷氨酸、丙二酸等），其可能对嘧啶代谢、牛磺酸等代谢产生影响，提示随着年龄增长，女性卵泡液会出现能量供应失衡和代谢活动下降等显著改变。此外，不同病因的不孕症患者其卵泡液内部的代谢物种类也存在显著差异。为了明确代谢物差异，Zhang等［32］和Liang等［33］对PCOS、子宫内膜异位症和DOR三类不孕症患者卵泡液进行代谢组学分析，通过对比三组数据，结果发现PCOS患者的卵泡液内部磷脂和三酰甘油等代谢物浓度降低；子宫内膜异位症患者的氧化磷酸化水平失衡，抗氧化能力显著下降，同时特定的磷脂酸和乳酸水平显著升高；而DOR患者的卵泡液内部的花生四烯酸代谢发生异常，因此上述研究也提示代谢组学分析对于优化不孕症患者的诊疗存在重大意义。Yang等［34］则对大小卵泡内部的卵泡液代谢体征进行了对比分析，结果显示对比于大卵泡，小卵泡内部的去氧皮质酮表达显著下降，而DHEA和雄烯二酮水平则表达增加。该研究提示，在卵泡发育的不同阶段，其内部的代谢组谱存在差异，其差异可以为未来预测卵母细胞质量和发育结局提供候选筛查指标。4.脂质组学：脂质组学是分析机体内部脂质的类型、分布以及相应功能，同时明确其在不同的生理和病理状态下相应的动态变化，从而揭示脂质在机体组织构成、能量代谢和生理活动中的作用的学科。因此通过分析卵泡液种脂质学特征，有助于深入阐明卵母细胞的生物膜构成、生理状态和分子通路调控等重要信息。为了研究卵泡液中的脂质变化，Zhang等［32］采用超高效液相色谱和高分辨率质谱联用技术对IVF患者的卵泡液进行脂质组分析，结果显示相对于年轻组，老年组卵泡液内的花生四烯酸和溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LysoPC）水平发生改变，其中花生四烯酸和LysoPC（16∶1）、LysoPC（20∶4）和LysoPC（20∶3）共四种脂质代谢物下调，LysoPC（18∶3）与LysoPC（18∶1）发生上调，为花生四烯酸的变化，影响卵母细胞发育，而LysoPC参与滤泡发育和卵母细胞成熟的调控，其复杂变化与卵泡发育密切相关，这些与卵泡发育相关的差异代谢物可能为调控卵母细胞健康提供潜在的诊疗靶点。Zhang等［35］基于对65例接受ART治疗女性的脂质组学分析发现，卵泡液与血浆之间的脂质组成存在显著差异，两种生物基质的区分主要由溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、醚PE和甘油三酯类脂类驱动。相关性分析进一步显示，卵泡液中LysoPC与PE水平和囊胚形成率呈正相关，提示特定脂质分子可能参与卵泡微环境调控，并具有作为ART胚胎发育结局预测性生物标志物的潜在价值。多组学整合分析：随着各项研究的不断发展，各种卵泡液的组学研究均为揭示卵母细胞发育及衰老提供了生物信息，然而单一组学分析无法全面描述卵泡液微环境及卵母细胞内部的分子调控机制以及细胞间的信息交流。因此有效整合蛋白质组、脂质组等多组学数据，有助于促进卵泡液研究从单一线性研究转向多重网状的转化，为生殖医学的精准诊疗提供基础支撑。在分子机制研究方面，多组学技术对于揭示卵母细胞与胚胎发育的相关机制发挥重要作用。蛋白组学分析有助于揭示卵母细胞内部的重要分子信号通路性，明确其在卵母细胞发育和衰老过程中的差异，代谢组学研究有助于帮忙了解不同发育状态的卵母细胞内或周围颗粒细胞的能量代谢，而转录组学则有助于分析卵泡液微环境中miRNA、lncRNA及circRNA的动态变化，阐明卵泡液与卵母细胞内部的转录调控机制［31］。在标志物筛查方面，多组学联合分析有助于从卵泡液中筛查出与卵母细胞质量相关的分子标志物，包括蛋白质、RNA和脂质分子等，能够协助构建一套更加稳定高效可解释的筛查机制，为不孕症患者的诊疗过程提供了有效的基础理论［36］。在临床诊疗层面，将多组学分析数据同女性的年龄、激素水平、卵泡大小等基本生命体征相结合，有助于构建女性生育力预测模型，后续有助于为生殖医学中促排卵方案、囊胚培养体系的优化以及胚胎移植时机提供科学依据。卵泡液多组学技术及研究进展示意图见图2。综合而言，随着卵泡液多组学技术的不断发展，已经实现从单一分子发展为多组学数据整合系统性评估卵泡微环境、卵母细胞质量与优化胚胎培养体系。同时，在ART诊疗过程中，不同的不孕症患者病因各异，其体内的卵泡液多组学数据也存在显著的差异，因此表1总结了不同不孕症病因的卵泡液多组学特征和潜在相关机制。四、卵泡液多组学在生殖医学中的临床应用卵泡液多组学技术的不断发展，使其在对不孕症患者的临床诊疗中发挥着重要作用。国内外研究人员同临床医生共同对卵泡液进行多组学检测以及临床实验，最终将其研究结果结合患者的临床基本信息，发现其不仅有助于卵母细胞质量评估和体外胚胎发育潜能的预测，而且对于优化不孕症患者的排卵方案和胚胎培养体系也具有重大潜力。1.卵母细胞质量评估与早期干预：近些年来，通过利用卵泡液的多组学分析，为生殖医学诊疗中评估卵母细胞的质量提供了有效的分子标志物。Liu等［30］将来自于年轻小鼠的滤泡外泌体（YFF-exos）注射入年老小鼠尾部静脉内，结果显示：YFF-exos治疗后年老小鼠体内的卵泡数量显著增加，证明外泌体具有促进卵泡发育与成熟的作用；随后在对其机制进行深入研究发现，卵泡液内的miR-320a-3p外泌体通过结合转录因子FOXQ1，抑制其表达水平，继而促进了细胞内线粒体的活性及代谢活性，该过程对于调控卵母细胞质量、延缓卵巢早衰具有重要作用。上述研究表明，通过对卵泡液内外泌体的动态监测有助于评估卵母细胞的活性状态。除此之外，检测卵母细胞和卵泡液的氧化应激水平对于评估卵母细胞质量和胚胎发育能力具有重要意义。张琳等［41］对67例PCOS患者和66例对照组女性，在取卵日同时采集其直径为18mm卵泡的卵泡液，随后对其进行代谢组学分析，结果显示：相比于对照组，PCOS患者总体抗氧化（totalantioxidantcapacity，TAC）水平显著升高［（0.62±0.05）mmol/L比（0.53±0.04）mmol/L，P<0.001］，而MDA水平也显著升高［（18.20±4.68）mmol/L比（13.74±2.28）mmol/L，P<0.001］，随后对相对应卵母细胞的胚胎形成能力进行检测，结果发现卵泡液中的TAC水平与优质胚胎率呈显著负相关（β=−1.83，P=0.012），因此说明卵泡液中过高的TAC水平可能是胚胎质量低下的危险因素之一，其可以作为不孕症高风险患者的早期识别与干预的重要指标［41］。近些年来多组学整合研究的迅猛发展，也支持卵泡液用于卵母细胞亚群分层与靶向干预。Chen等［38］通过卵泡液及卵丘细胞群进行代谢组学+转录组测序联合分析，对比正常女性PCOS患者的三羧酸循环、氧化磷酸化、cAMP和mTOR信号通路异常，并鉴定10种差异代谢物（如植酸、琥珀酸、2'-脱氧肌苷三磷酸等），能够区分高风险卵母细胞群体；并且结果提示L-精氨酸与双原核受精率及卵裂率呈负相关，雌酮硫酸盐与高质量胚胎率呈负相关，该研究为卵巢衰老与能量代谢失衡提供了分子证据链。2.胚胎发育潜能预测：除了对于卵母细胞质量的评估之外，卵泡液多组学分析同样对于预测胚胎发育潜能和植入周期具有重要作用。Ji等［7］采集了22份拟行ART诊疗的不孕症女性卵泡液，随后通过使用LC-MS/MS蛋白检测技术分析卵泡液的蛋白表达谱，随后将卵泡液检测数据同第3天的胚胎质量相对比，共计鉴定出50种与胚胎质量密切相关的差异蛋白，包括32种上调蛋白（>1.20倍，P<0.05）和18种下调蛋白（下调幅度>67%，P<0.05）。上述研究表明卵泡液中的相关蛋白质同胚胎质量密切相关，未来有助于开发一种有效且无创的胚胎筛选生物标志物。除此之外，卵泡液中的外泌体miRNA对胚胎质量也表现出良好的预测潜能。国外学者Benedetti等［42］在哺乳动物模型进行研究，对于不同的卵泡进行外泌体组分析，发现90个差异miRNA，这些差异miRNA富集于细胞调控、分化、细胞周期及代谢过程。其中miR-34c在优质卵母细胞的外泌体中呈高表达，并在功能实验中显示，加入miR-34cmimic可显著提高囊胚质量，提示miR-34c在卵母细胞成熟及早期胚胎发育中发挥关键作用。在人类研究中，对卵泡液外泌体组学的探索也取得进展。Martinez等［43］对接受IVF治疗女性的卵母细胞的卵泡液进行外泌体组学分析，结果显示：外泌体中的miRNAs可能参与调控卵巢功能和卵泡/卵母细胞发育，此外特定外泌体中的miRNAs（如miR92a、miR130b、miR888、miR214、miR454等）与受卵母细胞受精成功率及第3天胚胎质量显著相关，可作为潜在的非侵入性生物标志物用于预测IVF结局。这些研究提示，多组学综合评价模式，相较于传统显微形态学评估，能够更早、更客观地识别具有高发育潜能的卵母细胞及胚胎，有望显著提升ART诊疗的成功率。3.个体化促排卵与培养策略优化：卵泡液的多组学分析对于揭示卵泡液微环境动态改变以及卵母细胞衰老机制具有重要意义，因此其也为明确卵母细胞的排卵机制调控提供了分子层面基础。因此，近些年的卵泡液多组学研究也成为优化ART诊疗过程中促排卵方案的重要手段。Chen等［38］为了研究不孕症女性和健康女性的卵泡液代谢物差异，分别采集了35例对照组女性和36例PCOS女性的卵泡液，进行统一处理后进行代谢组学分析，检测结果提示：比起对照组数据，PCOS患者的多条信号通路发生异常改变，包括氧化磷酸化、cAMP信号通路、mTOR信号通路、三羧酸循环以及类固醇激素合成等，随后结合上述数据信息优化ART诊疗过程中的促排卵剂量和时间制定，显著降低了治疗过程中药物使用不足或卵巢过度刺激综合征的风险。Pan等［44］的研究也解释了卵泡液内的蛋白组学和脂质组学数据差异与女性的年龄和卵巢储备功能密切相关，因此进行多组学分析不仅有利于对不孕症患者进行分层诊疗与病例模型搭建，而且也为优化促排卵方案提供分子基础。Tian等［37］则将PCOS患者与对照组女性的卵泡液进行多组学分析检测，结果显示：同对照组相比，PCOS患者的卵泡液内部的饱和脂肪酸、肉豆蔻酸C14∶0和单不饱和脂肪酸C24∶1显著升高，而多不饱和脂肪酸LA/ALA比值下降。将上述因素进行综合分析，发现其对PCOS患者预测模型的准确度约为0.86（曲线下面积≈0.86），说明卵泡液内的脂质分子具备不孕症的临床分层与风险评估价值，同时也为调整胚胎培养液脂质成分和促排方案的制定提供了分子依据。在临床实践阶段，多项哺乳动物的体外实验同样取得了显著的成果。Nakayama等［39］和Kereilwe［45］发现氧化应激失衡营养胚胎体外培养成功率，因此分别在对猪和牛的胚胎IVM/IVF培养液中加入吲哚-3-丙酸（Indole-3-propionicacid，IPA）等抗氧化剂，结果显示显著改善了胚胎的氧化应激、维持了线粒体功能、调控了胚胎内信号通路，胚胎的质量以及发育潜能均得到显著改善，为未来培养体系的优化提供了宝贵经验。此外，随着人工智能的发展，Hanassab等［46］则利用人工智能将卵泡液多组学数据进行优化整合，不仅实现了对卵母细胞发育和胚胎发育潜能的早期预测，同时也为不孕症的促排方案提供精准的预测模型。4.动态评估与精细化ART策略：伴随着高通量检测技术的发展，卵泡液的多组学分析有助于不孕症的分子检测从“静态评估”向“动态检测+个体化诊疗”的模式，同时也为ART的诊疗以及精准医疗提供了分子基础。由于卵泡液的多组学分析包含有蛋白质、脂质等多种数据，能够反映卵泡液的微环境、颗粒细胞状态和卵母细胞质量等生理信息数据，将上述数据纳入ART诊疗流程，有助于构建“检测—诊疗—再检测”的精准诊治体系。Chen等［47］通过分析多个周期的卵泡液内的多组学信息，能够检测到卵泡液微环境以及卵泡液的状态，卵泡液内部的常见氧化应激指标，如MDA、8-OHdG、TAC、SOD等，同卵母细胞质量、受精能力和胚胎发育质量密切相关，因此加服抗氧化制剂，同时在体外培养体系减低氧化物产生、完善培养体系，有利于提高ART诊疗的成功率。Vardanyan等［48］则对41例子宫内膜异位症的不孕症女性的卵泡液进行多组学分析，同时统计其卵母细胞的妊娠结局，结果显示，成功妊娠者和未获妊娠者的卵泡液内脂质存在显著差异，主要包括胆固醇酯、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、甘油三酯，因此对卵泡液内的脂质信息进行分析可区分获得妊娠与未获得妊娠的女性，其可以作为预测子宫内膜异位症患者ART诊疗结局的潜在标志物，同时对于相应异常的患者，可以优化培养液内的脂质成分，改善卵母细胞的脂质环境，提高ART的诊疗结局。除此之外，Zhang等［40］和Hariton等［49］分别统计国内外的IVF/ICSI不育症周期数据，将卵泡液的多组学研究数据和不孕症患者的激素水平、超声结果等临床数据相结合，随后将上述大数据构建人工智能和机器学习算法建模，其不仅有利于提前预估成熟卵母细胞的质量，而且还能用于ART诊疗优化，实现不孕症患者更精细化的个体化管理。上述预测体系能够使得生殖医学诊疗从经验主观向精准转化，适应不育症群体的异质性，提升模型的可适性。综合上述内容，卵泡液多组学在生殖医学中应用详见图3。五、总结与展望1.卵泡液多组学研究的优势与意义：卵泡液作是卵母细胞发育的直接微环境，其内部含有多种蛋白质、脂质和外泌体等多种物质。通过对卵泡液进行多组学分析，不仅能够深度揭示卵母细胞的发育状态、代谢活力和氧化应激水平，而且也有助于揭示细胞之间的信息交流状态［15］。在ART的卵母细胞筛选过程中，相较于传统的形态学方法，卵泡液的多组学分析能够综合内部的多种分子数据，有利于卵母细胞质量评估向“动态分子诊断”方向发展。上述流程不但能揭示不同患者在不同促排周期中卵母细胞的差异性，而且通过机械算法分析也能鉴别出与卵母细胞受精能力和胚胎发育潜能的分子标志物，有助于未来调整不孕症女性的促排卵方案和优化胚胎的培养体系［34］。此外，利用不断发展的人工智能技术，依据卵泡液多组学数据构建出算法模型，不仅能够根据卵泡液数据协助诊断不孕症患者临床病因，而且为后续优化患者的诊疗方案提供数据支持。综上所述，鉴于卵泡液与卵母细胞具有一对一的特点，多组学分析不但有助于构建起科学精准的卵母细胞评价体系，而且也能够促进ART诊疗从依赖影像学和激素指标，向更加精准化和个体化的治疗体系发展，为促进生殖医学成功率的提高提供新的研究方向。2.现阶段研究局限与应用障碍：虽然卵泡液的多组学研究技术对于揭示卵母细胞的发育分子机制、评估胚胎质量以及优化ART方案等方面发挥着十分重要的作用，但是其在进行临床大范围仍然面临着诸多困难。首先，目前的绝大多数研究仍以单个中心、小样本量为主，并且不同的研究在入组标准、ART诊疗方案、卵泡液的取样、样本处理流程和检测质控等方面缺乏统一标准，因此研究之间存在明显的异质性。并且，现阶段的研究也受限于地域分布、种族构成以及基础疾病的差异性，因此也影响了卵泡液中的分子筛查标注物的应用效果评价以及在不同种族人群中的推广应用效果［50］。此外，虽然卵泡液具有生物局限性，但是当卵泡处于发育阶段、促排卵药物治疗以及实验室处理等影响之后，也增加了实验结果的对比复杂性。其次，检测的高成本也是限制卵泡液多组学临床应用的关键因素。目前，卵泡液中的蛋白质、RNA、脂质以及代谢物的检测，多采用质谱流式分析、高通量测序等方法，由于其对样本预处理、仪器设备规格、质控体系和检测人员能力均有较高的要求。因此导致卵泡液多组学研究目前仍处于实验探索阶段，仍需较大的距离才能实现标准、快速和低成本的临床检测模式。在ART的临床诊疗指导中，当多组学检测结果无法及时回报时，将极大限制对促排卵方案制定、卵母细胞质量评估和胚胎培养体系优化的指导意义。最后，多组学数据整合困难是限制其向临床转化的另一项重大挑战。因为不同的组学数据在数据标准化、信号类型、缺失值比例和生物学意义层面差异较大，除此之外，不同检测平台的批次效应、样本量差异和多重检验也容易导致假阳性，也增加了构建准确的预测模型的难度。此外，卵泡液的多组学监测数据还需纳入年龄、抗米勒管激素和卵泡刺激素等激素水平、促排卵方案、卵泡大小等临床数据，才能适用于指导临床决策［51］。目前的卵泡液研究仍处于差异分子筛查阶段，对于可解释、可验证和可推广的预测模型的构建和应用仍有一段距离。总体而言，卵泡液的多组学分析为ART的精准诊疗提供了重要的研究路线，但是其临床应用仍需继续完善多组学检测体系、数据结果整合以及模型验证等方面。3.未来研究方向：针对以上存在的问题，未来的卵泡液多组学研究需从设计研究、平台规范、数据整合以及转化应用等方面共同推进。首先，积极构建多中心、大样本的卵泡液多组学研究项目。围绕着卵泡液的采集、样本保存、检测前处理、组学检测和数据整合等环节建立起统一的技术规范，有效抑制研究中的异质性，提高研究结果的可使用性。随后依据上述研究结果，逐步建立起涵盖不同的年龄、不孕症类型和ART诊疗结果的卵泡液多组学数据库，为筛选卵泡液中的生物标志物和预测模型构建提供数据支撑。其次，降低检测成本，促进多组学检测推广。未来可利用靶向质谱分析、微控芯片和人工智能等设备，建立起卵泡液多组学快速检测平台，缩短检测周期，从而提高检测结果对优化ART诊疗方案的数据支撑能力。对比于全组学分析，卵泡液中的关键生物标志物检测体系可能更容易由科研走向临床应用。再次，应着重将卵泡液多组学数据与临床基本变量、实验室相关指标以及影像学参数综合分析，促进卵母细胞评价标准由标志物判断向对维度综合评定转换。同时应借助人工智能手段，对于不同组学的数据进行信号提取、模式分析和风险评估，从而构建起相对准确的预测算法模型，有助于评估卵母细胞质量、胚胎的发育潜能以及不孕症患者促排方案的优化。同时在模型构建过程中，还应该训练独立验证多组学数据库的能力，并且强化模型的泛化能力和临床适用性。最后，未来的研究还应该进一步推动机制研究与临床干预研究的衔接。依据上述研究进展的内容，积极开展相对应的诊疗实验，如针对卵泡液中脂质紊乱和氧化应激失衡等异常特征，进行调整培养体系内脂质成分和体内外抗氧化治疗，评估对卵母细胞质量影响以及胚胎发育能力的影响，促进从科学研究向临床实际运用的发展。总体而言，卵泡液的多组学研究促进卵母细胞评估体系的改变以及生殖医学精准诊疗的发展，实现了不孕症诊疗“精准预测和个体化干预”新模式。因此伴随着检测技术的不断发展、多中心大样本实验数据的收集整理、算法及预测模型的优化，有助于完善ART诊疗流程和提高生殖医学成功率。参考文献[1]LiuL,LiangH,YangJ,etal.ClinicaldatabasedmodelingofIVFlivebirthoutcomeanditsapplication[J].ReprodBiolEndocrinol,2024,22(1):76.DOI:10.1186/s12958-024-01253-3.[2]SangQ,YaoZ,WangH,etal.IdentificationofmicroRNAsinhumanfollicularfluid:characterizationofmicroRNAsthatgovernsteroidogenesisinvitroandareassociatedwithpolycysticovarysyndromeinvivo[J].JClinEndocrinolMetab,2013,98(7):3068-3079.DOI:10.1210/jc.2013-1715.[3]QianY,TongY,ZengY,etal.Integratedlipidmetabolomics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