稀土元素对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响研究

TOC\h\z\c"Figure"摘要 3关键词 41前言 41.1 简介 51.1.1稀土元素 51.1.2金花菌 51.2研究意义与国内外研究动态 61.2.1研究意义 61.2.2国内外研究动态 62材料与方法 72.1实验材料 72.2实验仪器 72.3方法 82.3.1金花菌种培养纯化 82.3.2金花菌发酵液的制备 82.4检测体系的建立 82.5不同单因素对抗氧化能力的影响 92.6三因素三水平正交试验 103结果与分析 103.1镧（La）浓度对抗氧化活性的影响 103.2钕（Nd）浓度对抗氧化活性的影响 113.3镨（Pr）浓度对抗氧化活性的影响 113.4正交试验优化抗氧化活性条件 124结论 12参考文献 12稀土元素对金花菌胞外酶抗氧化活性的研究摘要：为探究稀土元素对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响，利用实验室已知材料研究镧、钕、镨三个单因素的不同浓度对金花菌胞外酶的抗氧化活性的影响，并用正交实验方法验证。实验结果表明单因素实验中，镧、钕、镨对金花菌胞外酶抗氧化活性均呈现浓度依赖性，最佳浓度分别为10mg/L、7mg/L、13mg/L，对应DPPH清除率分别为89.2%、87.6%、84.8%。正交试验表明，镧浓度对抗氧化活性影响最显著，最优组合为镧16mg/L、钕4mg/L、镨16mg/L，此时DPPH清除率达92.8%，较单因素最佳值提升3.6%。关键词：稀土元素；金花菌；金花菌胞外酶；抗氧化活性ResearchontheantioxidantactivityofextracellularenzymesinAspergillusoryzaebyrareearthelementsAbstract:ToinvestigatetheeffectofrareearthelementsontheantioxidantactivityofextracellularenzymesinAspergillusoryzae,theinfluenceofdifferentconcentrationsoflanthanum,neodymium,andpraseodymiumassinglefactorsontheantioxidantactivityofextracellularenzymesinAspergillusoryzaewasstudiedusingknownmaterialsinthelaboratory,andverifiedbyorthogonalexperimentalmethod.Theexperimentalresultsshowedthatinthesinglefactorexperiment,lanthanum,neodymium,andpraseodymiumexhibitedconcentrationdependenceontheantioxidantactivityofextracellularenzymesinAspergillusflavus.Theoptimalconcentrationswere10mg/L,7mg/L,and13mg/L,respectively,withcorrespondingDPPHscavengingratesof89.2%,87.6%,and84.8%,respectively.Orthogonalexperimentsshowedthattheconcentrationoflanthanumhadthemostsignificanteffectonantioxidantactivity.Theoptimalcombinationwaslanthanum16mg/L,neodymium4mg/L,andpraseodymium16mg/L.Atthistime,theDPPHclearanceratereached92.8%,whichwas3.6%higherthantheoptimalvalueofasinglefactor.Keywords：rareearthelement;Goldenfungus;ExtracellularenzymesofAspergillusflavus;Antioxidantactivity

1前言简介1.1.1稀土元素稀土元素是指钪（Sc）、钇（Y）以及镧系元素（包括镧La、镨Pr、钕Nd等），共17种元素。稀土元素于众多领域皆有重要作用，处于冶金工业范畴内，能起到改善金属材料性能的作用，就如掺入稀土元素的镁合金，其强度和耐热的表现会显著提升；在石油化工领域当中，稀土元素可充当催化的药剂，提高石油裂化等各类化学反应的效率；就农业这一领域，稀土元素肥料可推动农作物种子发芽和根系生长，提升农作物产出量。1.1.2金花菌金花菌[1]，学名冠突散囊菌，是散囊菌目曲菌科散囊菌属的一种真菌，属于国家二级保护菌种。子囊果基原明显，营养菌丝上形成螺旋状产囊体，子囊果为闭囊壳型，通常黄色、球形或近球形，内含8个子囊孢子，囊壁早期消解。好氧，耐干燥与高渗透压，喜pH低于7环境，pH值为5时生长最佳，生长温度28℃-30℃最佳，最高38℃，相对湿度75%-85%。金花菌具有较强的抗氧化活性，金花菌在生长代谢过程中会产生一些具有抗氧化能力的代谢产物，如多酚类物质、黄酮类化合物等，该成分能特异性结合并清除体内自由基，削弱氧化破坏，由此降低细胞老化速率，可有效支持心脑血管健康，茶多糖的抗氧化潜力，多项实验证实，当黑茶、绿茶等茶叶加工剩余物接种金花菌后[2]，检测到茶多糖含量明显上升，茶多糖提取物对DPPH自由基的清除能力均获得增强，进而强化了茶叶的抗氧化特性，金花菌黄色素的抗氧化潜力，实验证实此类黄色素具有强效抗氧化作用，相较于维生素E，低浓度黄色素展现出更强的还原性、DPPH清除及溶血抑制能力，其DPPH半数抑制浓度未达50mg/L，可作为天然抗氧化剂的理想开发对象。金花菌胞外酶是金花菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的一类酶[2]，主要有多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等。它可在茯砖茶中形成，偶尔在普洱茶中形成。1.2研究意义与国内外研究动态1.2.1研究意义稀土元素能够与金花菌胞外酶发生相互作用[3]，改变酶的活性中心结构，从而提高其抗氧化活性，更有效地清除体内自由基，减轻氧化应激损伤，保护细胞免受氧化损伤。可增强金花菌适应性优化后的胞外酶抗氧化活性[4]，有利于金花菌在更宽泛的环境条件下存活和繁衍，遭遇高温、干旱、高盐等逆境状况之际，能更有效地维持细胞内氧化还原平衡，增进金花菌的抗逆性，可以增强发酵效率，处于发酵工业环境下，拥有更强抗氧化活力的金花菌胞外酶，可使

发酵过程愈发稳定且高效，减少因氧化而引起的底物与产物损失，提高发酵产物的数量和质量水平，使生产成本下降，经稀土元素实施优化后，金花菌胞外酶抗氧化活性的上扬，使其于医药、保健品、化妆品等对氧化性能有较高需求的领域，体现出更可观的应用潜力，设计出更多拥有抗氧化效果的产品，能推动资源开发利用工作开展，实现对金花菌胞外酶抗氧化活性的优化，有利于进一步发掘金花菌的潜在价值，驱动相关产业的前行，为稀土资源于生物领域的应用开拓新的途径，增进稀土资源的综合利用效果。1.2.2国内外研究动态国内对稀土元素与微生物关系的研究始于80年代[5]，在稀土元素对金花菌胞外酶抗氧化活性方面，有研究表明稀土元素能够影响金花菌的代谢过程，进而使胞外酶抗氧化活性发生变化。比如借助改变酶的活性中心结构，增加金花菌胞外酶清除自由基的能力，进而提升其抗氧化的活性，相关实验研究发觉，采用稀土元素处理后的金花菌，其胞外酶处于茯砖茶发酵进程中，可较好地催化茶多酚等物质的氧化聚合进程，还降低了黑茶的粗涩口感，还提升了茯砖茶的抗氧化功效，这侧面证明了稀土元素对金花菌胞外酶抗氧化活性起到积极效果。国外研究多集中在稀土元素抗菌、抗炎的功效以及对植物生理特性的影响等方面，直接涉及稀土元素对金花菌胞外酶抗氧化活性的研究比较少，研究结果表明，稀土元素对某些微生物的生长和代谢具有调节作用，好比改变细胞膜通透性以及酶的活性，这些研究为查找稀土元素对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响机制提供了一定的参考支撑。1.3本人见解从文献中知悉，稀土元素说不定通过与金花菌胞外酶的活性中心相契合，引起酶的构象变动，进而提升它的抗氧化活性，也有概率影响金花菌的代谢进程，引起胞外酶的合成与分泌量上升，或者去调节相关的信号通路，提高细胞内的抗氧化防御水平，间接提高胞外酶的抗氧化活性[6]。能借助体外实验模式，把稀土元素跟金花菌胞外酶放在特定条件之中孵育，对酶活性、自由基清除能力等指标的变化进行检测，还可运用体内实验，如在金花菌培养过程中添加稀土元素，观察其对胞外酶抗氧化活性的影响，并结合基因表达分析、蛋白质组学等技术，深入探究相关机制[7]。稀土元素的种类、浓度以及作用时间等方面都会影响到金花菌胞外酶的抗氧化活性，因化学性质存在差异，不同种类稀土元素，对胞外酶的作用结果不一样；在特定范围里，伴随稀土元素浓度上升和作用时间延长，抗氧化活性大概会增强，但超过一定限度也许会引发抑制效应。增进金花菌胞外酶抗氧化活性，可以提高茯砖茶等发酵产品的品质，增强保健功能[8]，在医药与保健品范畴，利用稀土元素跟金花菌胞外酶的相互作用，开发新型抗氧化制剂，还可给稀土资源的生物应用开辟新门道，带动稀土资源跟生物产业协同发展，但需要关注稀土元素在生物方面的安全性[9]，其在生物体内的累积或许会对生物体产生潜在隐患，应当严格控制稀土元素的使用剂量及残留量，加大对发酵产品等安全性检测力度，保证其符合既定的相关标准。2材料与方法2.1实验材料实验室中的DPPH、稀土元素镧、稀土元素钕、稀土元素镨、金花菌、甲醇、葡萄糖、蒸馏水、土豆。2.2实验仪器

可见光分光光度计（722，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；电子天平（FA-2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；低速离心机（DT5-2B，北京时代北利离心机有限公司）；旋转蒸发仪（RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂）。2.3方法2.3.1金花菌种培养纯化将保存的金花菌菌种转接至PDA平板上[10]，在28°C恒温培养箱中培养5-7天，待菌落生长至直径约2-3cm且形态特征典型时，进行下一步实验。2.3.2金花菌发酵液的制备将金花菌菌种接至培养瓶中，于恒温培养室中发酵，7天后取出后保存待用。2.3.3胞外酶的提取与纯化发酵阶段完成后，发酵液于4°C，8000rpm离心20分钟，离心结束取其上清液作为胞外酶粗提液。通过硫酸铵分级沉淀法初步纯化胞外酶粗提液[12]，采用梯度加入法使粗提液与30%-60%饱和硫酸铵溶液结合，4℃冷藏处理过夜，离心后收集沉淀组分，取少量中性磷酸盐缓冲液溶解离心沉淀，得到纯化的胞外酶溶液。2.3.4稀土元素的配制配制碳酸镧（La2(CO3)3）溶液、硝酸钕（Nd(NO3)3）溶液、硝酸镨（Pr(NO3)3）溶液稀土元素母液各1mg/ml备用。2.4检测体系的建立2.4.1多酚氧化酶(PPO)活性测定采用邻苯二酚法。在10mL比色管中依次加入2.5mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)、1mL0.1mol/L邻苯二酚溶液和0.5mL胞外酶溶液，混匀后在30°C水浴中反应5分钟，立即于420nm处测定吸光度变化。以每分钟吸光度增加0.001定义为一个酶活力单位(U)，PPO活性计算公式为：PPOactivity(U/mL)=DeltaA*Vt/(0.001*Vs*t)其中，DeltaA为反应时间内吸光度的变化值，Vt为反应体系总体积(mL)，Vs为加入酶液的体积(mL)，t为反应时间(min)。2.4.2胞外酶抗氧化活性测定DPPH自由基清除能力的测定：取2mL不同浓度的胞外酶溶液与4mL0.2mol/LDPPH乙醇溶液混合，振荡，溶液混匀后，于黑暗中静置30分钟后在517nm处测定吸光度(Ab)，同时测定2mL无水乙醇与4mLDPPH混合后溶液的吸光度(Ac)以及2mL胞外酶溶液与4mL无水乙醇混合后溶液的吸光度(Ab)。DPPH自由基清除率计算公式为：清除率(%)=QUOTEA0-AX-AQUOTEA0——空白对照组吸光度、QUOTEAX——样品组的吸光度、QUOTEA1——样品本底吸光度2.5不同单因素对抗氧化能力的影响以金花菌胞外酶抗氧化活性为指标[13]，分别探究镧、钕、镨对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响2.5.1稀土元素镧对金花菌胞外酶抗氧化活性影响用蒸馏水将稀土元素母液配制成不同浓度梯度（4、7、10、13、16mg/L）的镧溶液，向含有不同浓度镧溶液的培养基中接入等量的金花菌种子液，置于适宜环境培养，观察记录其生长状况，如菌斑形态、大小、颜色变化及生长速率等[14]。培养结束后，取含镧培养基的培养液离心，得到上清液，再经超滤、透析等操作，获得胞外酶粗提液。采用检测体系中的方法对不同镧浓度下胞外酶的抗氧化活性数据进行统计学分析，以确定稀土元素镧对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响及其最佳合适浓度。2.5.2稀土元素钕对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响用蒸馏水将稀土元素母液配制成不同浓度梯度（4、7、10、13、16mg/L）的钕溶液。把金花菌种子液接种到含不同浓度钕溶液的培养基里，在相同条件下培养，注意其生长过程中的特征变化，像菌丝的生长密度、蔓延速度等[15]。含钕培养基的培养液进行类似的离心、超滤、透析等处理，以提取胞外酶粗提液。采用检测体系中的方法对不同镧浓度下胞外酶的抗氧化活性数据进行统计学分析，以确定稀土元素钕对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响及其最佳合适浓度。2.5.3稀土元素镨对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响用蒸馏水将稀土元素母液配制成不同浓度梯度（4、7、10、13、16mg/L）的镨溶液。在加了不同浓度镨溶液的培养基中接入金花菌种子液，保持一致的培养条件，关注金花菌生长的细节表现，是否有特殊的代谢产物生成等。同样地，将含镨培养基的培养液离心等处理，取得胞外酶粗提液，采用检测体系中的方法对不同镧浓度下胞外酶的抗氧化活性数据进行统计学分析，以确定稀土元素镨对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响及其最佳合适浓度。2.6三因素三水平正交试验在单因素实验的基础上，以提取镧、钕、镨为因素，进行三因素三水平的正交实验[16]，这里使用的是(L9(33))的正交试验表，从而进一步确定获得最优抗氧化性能的条件。设计如下表所示：表SEQ表\*ARABIC1因素水平表水平因素镧(A)钕(B)镨(C)1444210773161616表SEQ表\*ARABIC2L9(33)表1(A)2(B)3(C)DPPH清除率（%）144476.5247781.434161678.44104789.951071685.261016482.571641692.88167480.791616783.13结果与分析3.1镧（La）浓度对抗氧化活性的影响通过不同浓度镧溶液（4、7、10、13、16mg/L）处理金花菌后，其胞外酶对DPPH自由基清除率的变化如表3所示。结果显示，随着镧浓度增加，清除率呈现先升高后降低的趋势。当镧浓度为10mg/L时，清除率达到峰值（89.2%），显著高于其他组。推测低浓度镧可能通过激活酶活性中心或促进酶蛋白构象优化，而高浓度（>10mg/L）可能引发酶结构变性，导致活性下降。表3镧浓度对DPPH自由基清除率的影响镧浓度（mg/L）DPPH清除率（%）472.3785.11089.21381.21668.43.2钕（Nd）浓度对抗氧化活性的影响钕溶液对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响如表4所示。当钕浓度为7mg/L时，清除率最高（87.6%），但浓度超过7mg/L后，清除率显著下降。这表明钕对酶活性的促进作用存在阈值，可能与钕离子与酶活性位点的竞争性结合有关。表4钕浓度对DPPH自由基清除率的影响钕浓度（mg/L）DPPH清除率（%）478.4787.61080.51375.91669.93.3镨（Pr）浓度对抗氧化活性的影响镨溶液对金花菌胞外酶抗氧化活性的影响如表5所示。镨的最佳浓度为13mg/L，此时清除率为84.8%。与其他稀土元素相比，镨的促进作用较弱，可能与其离子半径较大，难以有效结合酶活性位点有关。表5镨浓度对DPPH自由基清除率的影响镨浓度（mg/L）DPPH清除率（%）470.2776.91080.71384.81678.33.4正交试验优化抗氧化活性条件基于单因素实验结果，采用三因素三水平正交试验（L9(3³)）优化镧、钕、镨的浓度组合。正交试验设计及结果如表2所示。最优组合为A3B1C3，即镧16mg/L、钕4mg/L、镨16mg/L，此时DPPH清除率达92.8%。4结论一.单因素实验表明，镧、钕、镨对金花菌胞外酶抗氧化活性均呈现浓度依赖性，最佳浓度分别为10mg/L、7mg/L、13mg/L，对应DPPH清除率分别为89.2%、87.6%、84.8%。二.正交试验表明，镧浓度对抗氧化活性影响最显著，最优组合为镧16mg/L、钕4mg/L、镨16mg/L，DPPH清除率达92.8%，与单因素最佳值相比提升3.6%。三.稀土元素可能通过调控酶构象或代谢途径增强抗氧化活性，但高浓度会引发抑制作用。未来需结合蛋白质组学进一步揭示分子机制，并评估稀土元素在发酵产品中的安全性。参考文献[1]杨金梅.金花菌生长特性及其发酵茶的蛋白组学分析[D].福建师范大学,2016.[2]杨抚林.茯砖茶发花过程中优势菌研究进展[J].茶叶科学技术,2005,(1):4-7.[3]王燕.稀土元素对微生物的生物学作用研究进展[J].齐鲁工业大学学报:自然科学版,2005.[4]朱雯,马煜明,曾莉,等.金花菌发酵甜茶生化品质及抗氧化活性分析[J].茶叶通讯,2019,46(03):318-322.[5]王秋霜,陈栋,操君