【腈水合酶研究文献综述3000字】

腈水合酶研究文献综述1.1.1腈水合酶的来源与分类腈水合酶（Nitrilehydratase；EC:4.2.1.84）简称NHase,是一类能够催化腈类化合物发生水合反应并生成对应酰胺的金属酶。日本科学家Asano发现红球菌RhodococcusrhodochrousJ1可以利用乙腈作唯一氮源，至此筛选得到第一株能产腈水合酶的微生物[1]。随着深入研究，发现腈水合酶来源于土壤杆菌属（Agrobacterium）、嗜酸菌属（Acidovorax）、克雷白氏菌属（Klebsiella）、节杆菌属（Arthrobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、摩拉氏菌属（Moraxella）、芽孢杆菌属（Bacillus）以及诺卡氏菌属（Nocardia）等[2-11]。经过系统发育生物学分析，发现腈水合酶是专属于细菌的酶类，尤其是革兰氏阳性菌。除了来源于细菌，也有少数腈水合酶来源于真核微生物，主要是丝状真菌和酵母菌。例如木霉属（Trichoderma）、出芽短梗霉属（Aureobasidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、红酵母属（Rhodotorula）以及克鲁维酵母（Kluyveromyces）等[12-15]。迄今为止还未有植物来源腈水合酶的报道，总的来说，腈水合酶资源主要存在于微生物中。腈水合酶是一类多亚基的金属酶，由α亚基和β亚基组成，一般情况下形成α2β2异源四聚体。金属离子作为辅基，对腈水合酶活性至关重要。根据金属离子的不同，腈水合酶主要分为Fe-NHase（非血红素铁型）和Co-NHase（非类咕啉钴型）两类。研究人员通过X光吸收精细结构谱（X-RayAbsorptionFineStructure，XRAFS）技术表征钴型腈水合酶的蛋白质结构底部存在一个低自旋Co（III），利用XRAFS、电子自旋共振（electronspinresonance，ESR）和拉曼光谱仪（ResonanceRaman）等技术证明铁型腈水合酶中低自旋Fe（III）的存在[16-18]。最早报道的钴型腈水合酶来自于RhodococcusrhodochrousJ1，钴离子存在的情况下，该菌株经尿素培养可诱导表达高分子量NHase（H-NHase），经环己甲酰胺诱导则表达低分子量NHase（L-NHase）。两种腈水合酶底物谱不同，H-NHase对脂肪族腈类化合物表现较高的活力，L-NHase则对芳香族腈类化合物有较高的活力[19]。后续研究中也有来源于Pseudomonasputida、RhodopseudomonaspalustrisHaA2、Klebsiellaoxytoca的钴型腈水合酶报道[7,19-20]。Sugiura等最早发现了来自于RhodococcusR312和PseudomonaschlororaphisB23的铁型腈水合酶[18，21-22]。尽管不同微生物来源的腈水合酶序列存在差异，但腈水合酶α亚基中的活性中心存在一段高度保守的氨基酸序列-CXYCSCX-，钴型腈水合酶为-CTYLCSCY-，型腈水合酶中为-CSYLCSCT-。研究者认为该段保守序列与腈水合酶α亚基结合金属离子有关。在富含半胱氨酸的保守序列中，第二位氨基酸是苏氨酸时结合三价钴离子，若第二位是丝氨酸则结合三价铁离子[23]。另外，也有相关报道指明部分腈水合酶含其它金属离子，如锌、铜等。Okamoto和Elitis分析土壤细菌Rhodococcussp.RHA1，发现该菌株表达的腈水合酶含有两个铜离子、1个钴离子和一个锌离子[24]。1.1.2腈水合酶的催化机理迄今为止，腈水合酶的确切催化机制尚未被完全确认，现有三种不同的催化机理假说，如图1-1所示。在机理M1中，底物的氰基在金属离子中心的配位球上取代氢氧化物配体，金属结合的氰基被水分子水解。这会产生一种金属结合的亚胺醇中间体，重新排列释放酰胺产物。在机理M2中，金属离子与活性位点活化的-OH基结合后作为亲核试剂，进攻氰基中的碳负离子形成亚酰胺中间体，最后形成酰胺化合物。在机理M3中，同样金属离子与-OH基结合导致活性位点附近的自由水分子脱质子。新生成的氢氧化物使氰基水解，最终重排生成酰胺。图1-1三种可能的腈水合酶催化机制[25]Fig1-1ThreeproposedmechanismforthehydrolysisnitrilesbyNHase.1.1.3腈水合酶的基因结构特性一般情况下，腈水合酶存在于一个复杂的基因簇上。所谓基因簇是指多个功能相同或相关的基因按照一定的顺序排列，由一个启动子控制它们的转录和表达，而且基因簇表达产物之间相互调控，共同协作完成某一代谢途径。在PseudomonaschlororaphisB23菌株的腈类代谢基因簇上，编码了7个代谢相关蛋白，按顺序依次是乙醛肟脱水酶、酰胺酶、腈水合酶的α和β亚基、NhpC、NhpS和酰基辅酶A合成酶，其基因簇模型如图1-2所示。乙醛肟脱水酶基因oxdA上游936bp的nhpR开放阅读框，其编码的氨基酸功能与转录调节蛋白Xyls/Arac家族相似。诱导野生型菌株表达腈类代谢酶过程中需甲基丙烯酰胺作为诱导物，此时基因簇上腈水合酶基因均得到转录。而当nhpR基因失活时，即使加入诱导物腈水合酶也不能得到转录。由此可知，nhpR蛋白是该基因簇重要的转录激活因子，且研究者通过反转录PCR证明乙醛肟脱水酶、酰胺酶、腈水合酶的α和β亚基及NhpC共转录为一条mRNA[24-26]。图1-2PseudomonaschlororaphisB23菌株腈水合酶基因簇结构[26]Fig1-2OrganizationoftheNHasegeneclusterinthePseudomonaschlororaphisB231.1.4腈水合酶的重组表达目前已经报道了众多表达腈水合酶的野生菌株，用野生细胞催化生产酰胺类化合物也具有应用价值，但是仍存在以下几个问题有待解决。主要有：（1）野生细胞产腈水合酶表达量低，生产效率低，很难达到工业水平需求且通常需要添加酰胺类化合物诱导产酶，工艺不稳定；（2）野生细胞中存在复杂的酶体系，除了腈水合酶还存在酰胺酶和腈水解酶。直接用野生细胞催化腈类化合物可能会生成羧酸类化合物，导致产物的纯度和产率降低，同时增大了产物分离纯化的难度；（3）多数野生菌株的遗传背景不清晰，实现高密度培养难度大。随着基因工程技术的发展和普及，有望通过重组表达提高腈水合酶表达水平。大肠杆菌的遗传背景清晰，具有结构简单、遗传操作手段成熟、生长快速、培养成本低廉及可实现高密度培养等优点，目前已开发出多种蛋白表达宿菌株主和基因载体，是最常用的重组表达宿主之一。刘胜先等在大肠杆菌中表达来源于Comamonastetosteroni5-MGAM-4D的腈水合酶，可溶性目的蛋白占总蛋白的40%以上[30]；Amit将来源于RhodococcusrhodochrousPA34的腈水合酶突变体在大肠杆菌中进行表达，同时共表达钴离子转运蛋白，纯化后获得37.1U/mg比活的重组蛋白[31]。随着基因组第二、三代高通量测序技术的发展和研究的深入，人们认识到腈水合酶位于一个基因簇上，该基因簇上存在对腈水合酶功能表达具有调控作用的关键基因。有研究表明，腈水合酶的激活原件发挥金属伴侣蛋白的功能。一旦激活原件缺失或失活，则无法获得活性腈水合酶[32]。如来源于RhodococcusequiTG328-2腈水合酶的功能表达需要基与因簇上β亚基下游的激活原件共表达[32]；来源于Rhodococcussp.N-771腈水合酶的重组表达需要同时表达基因簇上的orf1188[33]；Zhang等在大肠杆菌中克隆表达了来源于Pseudoxanthomonassp.AAP-7的腈水合酶和激活原件P46K，实现腈水合酶的功能表达[34]。除了大肠杆菌，也可使用毕赤酵母、谷氨酸棒状杆菌或直接使用腈水合酶产生菌作为宿主进行表达。Wu等将来源于Pseudomonasputida5B的腈水合酶及其激活原件P14K在毕赤酵母中共表达，不过酶活仅为大肠杆菌表达的10%[35-36]。Kang等在谷氨酸棒状杆菌中重组表达RhodococcusrhodochrousM33的腈水合酶,用重组菌株细胞以丙烯腈为原料生产丙烯酰胺可实现工业生产[37]。Hashimoto等人将来源于Rhodococcussp.N-771的腈水合酶在R.rhodochrousATCC12674菌株中进行同源表达，重组菌株的活力是野生菌株的2倍[38]。1.1.5腈水合酶在合成医药中间体的应用酰胺化合物是一类重要的医药中间体，利用传统化学工艺水解腈类进行制备，可能需要用到过渡金属等昂贵催化剂，或是高温反应条件。相比之下，腈水合酶介导的催化反应转化率高、选择性好、安全系数高，在医药中间体合成中越来越受到人们的关注。许多腈水合酶已经被开发出来并用于医药中间体的生产。左乙拉西坦的化学名称为(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，属于抗癫痫药，临床上用于治疗癫痫患者部分性发作，2007年销售额达到14亿美元。传统化学工艺在外消旋氨基酰胺中加入L-酒石酸，获得（S）-氨基酰胺，接着与4-氯丁酸丙酯反应合成左乙拉西坦[27]。该工艺拆分率仅为35%，R-型异构体回收困难导致原子经济性差。此外，在最后一步中还使用了一种危险的烷基化剂。Tucker披露了一种生物催化法制备左乙拉西坦的方案，所采用的的腈水合酶来自于BradyrhizobiumjaponicumUSDA505，对外消旋底物进行动力学拆分[28]，反应式见图1-3。利用腈水合酶催化，产率达到100g/L·d，收率达到43%，产物e.e达到94%，副产物R-型异构体可以回收进行消旋套用。与化学法相比，酶法催化法原子经济性更好。图1-3腈水合酶催化合成左拉西坦流程图Fig1-3NHase-catalyzedprocessforsynthesisofLevetiracetam腈水合酶可应用于烟酰胺的合成。烟酰胺（Nicotinamide）又名尼克酰胺，属于B族维生素家族，广泛存在于