无细胞蛋白合成方法对抗菌肽LR-X抑菌活性的筛选

用机制是靶向细胞膜，且耐药性风险低。本研究基于无细胞蛋白合成系统(CFPS),针对抗菌肽LRGG进行结构优化，LRGG的序列是LLRLLRRGGRRLLRLL-NH2,优化目标是提升其对革兰氏阴性菌的活性，通过丙氨酸扫描技术构建了16种LRGG变构体LR-Xs。利用CFPS技术快速表达并筛选功能，结合生长曲线分析评估抗菌活性，测定最小抑菌浓度维结构，发现LR-8的第8位丙氨酸替换改变了多肽的α-螺旋构象，这增强了其与胞膜的相互作用，揭示了关键残基的调控机制。本研究为基于关键词：抗菌肽；无细胞蛋白合成；丙氨酸扫描；构效关系；最小抑菌浓度3第一章前言抗生素耐药性问题是全球公共卫生专家共同面临的挑战。世重耐药菌感染十分危险，每年导致全球至少127万人死亡，预估2050年将突破千万[1。然而，传统抗生素的研发远远跟不上病原体的进化速度，这迫使略。在此背景下，抗菌肽(AntimicrobialPeptides,AMPs)成为热点方向，抗菌肽广泛存在于细菌、植物、昆虫及哺乳动物中，其功能的可塑性。根据蛋白质的二级结构特征，抗菌肽可分为α-螺旋型(如LL-37)、β-折叠型 (如防御素)及延伸构象型(如富含脯氨酸的肽)3。前人研究表明，抗菌肽是通过破坏微生物膜的完整性、抑制生物膜的形成或调节宿主的免疫反应等多例如，LL-37通过形成两亲性α-螺旋穿透细菌膜，同时中和内毒素以减轻炎症反应5;而仍然面临活性不足、易被蛋白酶降解以及规模化生产难等困境7。近年来，合成生物学与结构导向设计为抗菌肽结构和功能的优术8。例如，Carlson等利用CFPS在6小时内完成了50种抗菌肽的表达与活性验证，效率 (LLRLLRRGGRRLLRLL-NH2)对革兰氏阴性菌具有显著敏感性，但其抑菌活性仍需进换的影响，关注LRGG抗菌活性的变化，分析其结构特征的改变。基平台，抗菌肽表达与活性检测在4小时内完成，效率比传统方法高10倍以上，筛选出高活性变构体LR-8,其MIC为4μg/mL,针对革兰氏阴性菌的抑菌效能提升一倍。较母体肽活性显著增强，具备临床转化潜力。通过丙氨酸扫描分析，结合PyMOL结构解析，发现3的一类，其主要特征是不含半胱氨酸，因此分子内无二硫键在水溶液常不超过40个氨基酸残基，线性结构简单便于结构表征，对哺乳动物细胞的副作用较小，键。这些分子内二硫键不仅维持抗菌肽结构稳定，同时有助于其穿氨基酸组成特殊，如脯氨酸、色氨酸、精氨酸、甘氨酸和组氨酸的肽(如昆虫嗜酸菌素和牛巴克烯星)[141、富含色氨酸的肽(如杀吲哚素、Tritrpticin和抗菌肽的活性受多种因素影响，这些因素包括分子量，还有重要，空间构型同样关键，疏水力矩不可忽视，两亲性平衡也有牛源抗菌肽B22,它们对革兰氏阳性菌有效，对阴性菌也有显著杀菌活性。抗菌肽的生物学活性受多种因素影响，包括分子量、氨基酸肽B22[181,它们不仅对革兰氏阳性菌有效，对阴性菌也有显著杀菌活性。能显著抑制生物被膜形成；部分AMPs在低于M(3)免疫调节功能：AMPs能够调节抗炎反应、影响控细胞凋亡等过程，同时能增强宿主免疫细胞活性。例如，LL-32和多粘菌素B能中和内(4)抗生素协同作用：AMPs能增强传统抗生素效果，它们提高膜渗透性，促进抗生3(5)肿瘤细胞毒性：部分AMPs具有选择性肿瘤细胞杀伤能力，如依哌舒丁-1,它是泛的应用潜力。可用于新型抗菌制剂开发、免疫疗法创新及抗癌药物设计，应用前景广。3是实验室前期经过从头设计由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表3-1主要试验试剂氯化钠甲醇甘油塑料层析柱Ni-NTASefinose(TM)Resin6FF(SettledR厂家北京化工厂北京化工厂北京化工厂北京化工厂北京化工厂北京索莱宝科技有限公司北京索莱宝科技有限公司北京全式金生物技术有限公司北京索莱宝科技有限公司北京索莱宝科技有限公司天根生化科技(北京)有限公司北京化工厂北京西美杰科技有限公司北京西美杰科技有限公司上海康朗生物科技有限公司碧云天北京索莱宝科技有限公司无锡天演生物技术有限公司北京索莱宝科技有限公司3厂家型号电泳仪北京市六一仪器厂水平摇床北京市六一仪器厂HH.CHP-TCO₂培养箱上海一恒实验仪器有限公司荧光酶标仪贝克曼库尔特(美国)股份有限公司电子显微镜日本Olympus电子天平浙江纪铭科技有限公司监制日本岛津制作所3.2试验方法3.2.1构建pLC-LRGG表达载体以及L-Ala替换的16个LRGG构象的变构体序列如表3-3,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用Gibson组装的方法，将完成PCR反应后，通过2%琼脂糖凝胶电泳对产物进行分离，并使用凝胶回收试剂盒对目在1.8~2.0之间，以确保DNA样品的纯度和质量满足后续实验需求。(1177)BmeT110I获得L-Ala逐个替换的16个LRGG目的基因设计16对引物，引物序列详见表2-3。每对引物均在其变构位置将原有氨基酸替换成不同构象的LRGG变构体，如图3.2。进行2%琼脂糖凝胶电泳、胶回收PCR产物(参照北京全式金公司QuickGelExtractionKit说明书)。用NanoDrop1000测回收后的浓度。tututjeFigure3.2Schematicdiagramofaminoacidpla3使用回收的线性化pLC载体，分别与所有16个不同构象的LRGG变构体的目的基因片段进行无缝克隆连接，连接体系如表3-5,涡旋振荡使其充分混匀。置于50℃恒目的基因片段去离子水版DNA,在26℃条件下反应6h,设置荧光蛋白对照组，通过荧光强度实时监测蛋白表达情况，在这里使用丙酮浓缩蛋白法，该方法是一种常用的蛋白从复杂样品中分离和浓缩蛋白质。利用丙酮的脱水作用，使目的蛋白从溶液中沉淀出来，(1)样品准备：将含有目标蛋白的溶液置于冰上，确保样品温度保持在4℃以下。(2)丙酮沉淀：取适量样品(如1mL)加入预冷的丙酮(4倍体积，如4mL),轻轻混匀。将混合物置于-20℃冰箱中，静置1-2h或过夜，使蛋白质充分沉淀。3对于分子量范围为1-10kDa的小分子蛋白或多肽的分离，本研究采用Tricine-SDS电泳技术。凝胶采用三层结构：上层为8mm浓缩胶，中层为12mm夹层胶，下层为分离胶。电泳条件设置为：初始电压30V运行1h,随后调整至100V直至使用冰箱或预冷泡沫箱)。电泳结束后立即将凝胶浸入新配制的固定液，室温摇床处理30min。随后使用含40%甲醇和10%醋酸的考马斯亮蓝R-250溶液(0.25%,w/v)染色。最Westernblotting是一种广泛应用于分子生滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-正极)组装转膜装置，进行蛋白质在室温下封闭1h,以阻断膜上的非特异性结合位点。随后依次加入特异性一抗(4℃孵育过夜)和HRP标记的二抗(室温孵育1h),每次孵育后均用TBST缓冲液洗涤3次，每过程中需要注意：所有提取步骤需在低温环境下完成，保3.2.3无细胞表达产物的生长曲线测定无细胞蛋白表达技术为抗菌肽的高效生产提供了一种灵活性测试则是评估其功能和应用潜力的关键步骤。抗菌果的重要工具，通过绘制菌落形成单位(CFU)随时间变化的曲线，可直观地反映抗菌肽操作方法如下：以大肠杆菌(E.coliATCC25922)为革兰氏阴性菌的代表。接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期(OD600nm≈0.6-0.8)在96孔板中，每个不同构象的抗菌肽的无细胞反应量为50μL,在37℃下孵育8h。无细胞混合物直接用于大肠杆菌的活性检测。将细胞用LB稀释至10⁻⁴cfu/mL,将64μL稀释后的细胞加入96孔板的培养皿密封。设置阴性对照及阳性对照，每组设置3个重复，酶标仪测定每组的OD600nm值，每隔1h测量一次，在37℃下摇晃20h。分析生长曲线中抗菌肽对细菌生长的影响。抗菌肽的结构与其功能密切相关，因此分析其构象对于理解3/使用方法：输入抗菌肽的氨基酸序列。选择模板蛋白(与目标序列同源性较高的已知结构)。生成三维结构模型并下载。功能：基于模板和无模板的蛋白质结构预测，适用于抗菌肽的从头结构预测。网址：/I-TAS标准模式或快速模式)。生成三维结构模型并下载。功能：专门用于小肽(如抗菌肽)的三维结构预测。网址：序列。选择预测参数(如溶剂条件、温度等)。生成三维结构模型并下载。功能：提供已知蛋白质结构的数据库，可用于查找与抗菌肽结构相似的模板。网址：/使用方法：输入抗菌肽的序列或关键词进行搜 (如PDB格式)。菌肽的三维结构文件(如PDB格式)。使用工具栏进行结构可视化、旋转、缩放等操作。生成三维结构模型。使用PyMOL导入生成的三维结构文件，进行结构可视化。分析抗菌肽的二级结构(如α-螺旋、β-折叠)和关键残基。使用PyMOL比较不同构象抗菌肽最低抑菌浓度(MinimumInh肽对细菌抑制效果的标准方法，而抑菌圈实验是一种常用的定性方 (如抗菌肽)对细菌的抑制效果。通过测量抑菌圈的大小，可以直观地比较不同抗菌物质(1)菌液准备：将目的菌种接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期3(OD600nm≈0.6-0.8)。用PBS缓冲液洗涤菌体，调整菌液浓度至10⁵-10⁶CFU/mL。(2)抗菌肽稀释：将抗菌肽溶液用培养基进行稀释，制备不同浓度的抗菌肽溶液。(3)接种菌液：在96孔板中，每孔加入100μL稀释后的抗菌肽溶液。每孔加入100μL菌液，使最终菌液浓度为10⁵CFU/mL。设置空白组(仅培养基)、阴性对照(仅菌液)和阳性对照(多粘菌素B+菌液)。(4)培养与观察：将96孔板置于37℃培养箱中培养16-24h。观察孔板中菌液生长(5)结果判定：以完全抑制菌液生长的最低抗菌肽浓度作为MIC值。4.1pLC-LR₆表达载体以及16个不同构象达载体的构建线性化的载体和扩增的LRGG目的基因经无缝克bp,由此可以证明pLC-LRGG表达载体构建成功，如图3.3所示。Figure3.3ConstructionofpLC-LRgGexpressi4.1.2构建16个不同构象的表达载体AFigure3.4ConstructionofpLCLRGGexpressionvectorswithdifferentconformations将融合PCR得到的目的基因进行2%琼脂糖凝胶电泳、胶回收PCR产物(参照北京全式金公司QuickGelExtractionKit说明书)。用NanoDrop1000测回收后浓度。胶回收验3证琼脂糖凝胶验证后条带大小与理论分子量一致，大小为674bp。如图3.4A所示。凝胶电泳验证连接后的目的基因目的条带为271bp,与理论值一致，如图3.4B所示。(剩余14个不同构象表达载体图示见附录)提取16个不同构象表达载体质粒，送至生工生物工程(长春)股份有限公司测序。测序结果如图3.5所示，由此可证明不同构象的表达载iEieaicigricareitecresunesiciesjtricnnrnureiresiscssosfcinicrseairietsiEieaicigricareitecresunesiciesjtricnnrnureiresiscssosfcinicrseairietsininweiwiieiiie进行Tricine-SDS和W图3.6所示，在1.6KDa处有与目的蛋白大小相等的条带，但是由于阴性对照以及阳性对照均有与目的蛋白大小相等的条带产生，故暂且无细胞反应后的产物进行Westernblot验证，结果如图3.7所有与目的蛋白大小相等的条带，由此可以证明pLC-LRGG在无细胞体系中成功表达。20.1KD一图3.6pLC-LRGG无细胞表达后的Tris-tricine-SDS分析图(反应6h)1:阴性对照2:阳性对照3:pLC-LRGGFig.3.7Westernblotanaly1:pLC-LRGG2:阳性对照3:阴性对照将4.3.1构建好的共17个表达载体均进行无细胞表达反应，反应完成的混合物直接用于大肠杆菌的活性检测。设置阴性对照及阳性对照，每组设置3个重复，酶标仪测定每组的OD600值，每隔1h测量一次，在37℃下孵育20h。分析生长曲线中抗菌肽对细菌生长的影响。结果如图3.8所示，LR-8即第8位氨基酸替换的抑菌效果最好。在此基础上，将0.3将所有抗菌肽的氨基酸序列至SWISS-MODEL,生成三维结构模型。使用PyMOL导生很明显的变化，结合生长曲线结果表明，丙氨酸替换的第8位氨基酸结果为最优结构。L.13L14.5无细胞蛋白表达最优丙氨酸替换结构3成功表达，并将表达产物用于后续实验，SDS结果如图3.11所示。在1.6KDa处出1:上样前2:穿出3、4:50mM咪唑洗涤5、6、7:500mM咪唑洗脱采用标准微量肉汤稀释法测定了抗菌肽LRGG及其变构体LR-8的最低抑菌浓度 843第五章结论与展望本研究构建了16个LRGG丙氨酸替换的表达载体LR-X(1-16),使用生物信息学软功能活性，揭示了抗菌肽的分子作用机制，候选肽LR-8具有优异抑菌活性然氨基酸或化学修饰(如聚乙二醇化)[281增强LR-8的蛋白酶抗性，评估其对铜绿假单胞要研发新型抗菌药物替代抗生素，应加强合成生物学、计与毒性的统一评价标准I361,促进不同研应加大对新型抗菌肽研发的投入1,优先支持针对多重耐药菌的创新药物开发。本研究为抗菌肽的高效开发提供了技术参考，但临床应用仍需系统性的验7参考文献report[R].2023.[4]ZHANGLJ,GALLORL.Antimicrobialpeptides[J].CurrentBiology,2016,26(1):R14-R19.[5]NIZETV,OHTAKET,LAUTHX,etal.bacterialinfection[J].Nature,2001,414(6862):454-457.BiotechnologyAdvances,2012,30(5):1185-1194.SyntheticBiology,2014,3(6):398[11]LIUS,MAH.RationaldesignofantimicrobofPeptideScience,2023,29(4):e3470.[12]Vila,J.;Moreno-Morales,J.;Balleste-Delpierre,C.Currentlandscapeinthediscoveryoantibacterialagents.Clin.Microbiol.Infect.2020,26,596-603.[13]Mishra,A.K.;Choi,J.;Moon,E.;Baek,K.H.TryptophaMolecules2018,23,815.[14]Graf,M.;Mardirossian,M.;Nguyen,F.;Seefeldt,A.C.;Guichard,G.;ScoD.N.Proline-richantimicrobialpeptidestargetingproteinsynthesis.Nat.Prod.Rep.2017,34,7[15]Shagaghi,N.;Palombo,E.A.;Clayton,A.H.;Bhave,M.Archetypaltryptophapeptides:Propertiesandapplications.WorldJ.Microbiol.Biotechnol.7[16]Basak,A.;Ernst,B.;Brewer,D.;Seidah,N.G.;Munzer,J.S.;Lazure,CPept.Res.1997,49,596-603.[17]Sochacki,K.A.;BarbythehumanantimicrobialpeptideLL-37.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2011,108,E77-E81.[18]Rowe-Magnus,D.A.;Kao,A.Y.;Prieto,A.C.;Pu,M.;Kao,C.CathelicidinPeptidesRestrictBacterial[19]Zhang,K.;Li,X.;Yu,C.;WangCha