GBT 26352-2026《蜚蠊抗药性检测方法 德国小蠊生物测定法》

1蜚蠊抗药性检测方法德国小蠊生物测定法本文件规定了德国小蠊(Blattellagermanica)对有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、新烟碱类等杀虫剂抗药性检测时，试虫、仪器设备和测试条件的要求，描述了诊断剂量法和敏感基线法的生物测定方法。本文件适用于德国小蠊对杀虫剂抗药性的生物测定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。下列术语和定义适用于本文件。敏感品系susceptiblestrain由于未曾接触过杀虫剂而保持对杀虫剂具有敏感状态，遗传上较均一的试虫种群。待测种群estpopulation从野外(现场)特定地点和时间采集的、需要进行杀虫剂敏感性测试的目标昆虫群体。诊断剂量diagnosticdose能杀死媒介生物敏感品系99%或99.9%个体的杀虫剂剂量[99%致死量(LDs)或99.9%致死量注：用以区分敏感和抗性种群。实验室标准化饲养的形态完整、活动灵敏、体型大小一致的雄性成虫。4.2待测种群现场采集德国小蠊，室内饲养繁殖得到的形态完整、活动灵敏、体型大小一致的第一代(F1)或第二代(F2)代雄性成虫。丙酮(分析纯)或其他有机溶剂，二氧化碳或无水乙醚，杀虫剂原药，凡士林(分析纯)与液体石蜡(密26仪器设备具可控光照和温湿度的培养箱或房间，移液枪(管),500mL透明磨砂广口瓶，微量点滴器或微量点滴仪。注：广口瓶尺寸为高16cm,底部直径8cm,瓶口直径5.5cm,内表面积约为350cm²。7测试条件7.1温度：26℃±2℃。7.2相对湿度：(60±10)%。8敏感基线法依据杀虫剂使用浓度(剂量)的对数值和试虫死亡率机率值关系建立毒力回归方程，以敏感品系建立的杀虫剂毒力回归线作为敏感基线，以待测试虫种群得到的杀虫剂毒力回归线与敏感基线对比，通过比较由毒力回归线计算得到的致死中浓度(致死中量)[LC₅₀(LD₀)]的变化来确定待测种群抗性水平。8.2操作步骤8.2.1药膜法8.2.1.1预试验浓度的确定8.2.1.1.1用丙酮或其他适宜的溶剂将供试杀虫剂原药配成一定浓度的母液，结合试虫采集地点环境和用药历史，使用相应溶剂将杀虫剂母液稀释成一定浓度的测试药液进行预试验。取测试药液2.5mL加入500mL广口瓶中，立即不断转动广口瓶或用滚瓶机滚瓶，使药液均匀分布于瓶口磨砂表面以下所有内壁，直至肉眼看不到液体流动，置于通风橱中待溶剂完全挥发。瓶口磨砂玻璃处涂抹凡士林与液体石蜡混合物(1:1),每瓶放试虫10头，接触1h后，将试虫移入清洁容器内正常饲养。24h后记录死亡数。8.2.1.1.2每个浓度试验至少重复2次，以相应溶剂处理为对照组。根据试虫死亡率调整测试药液浓度，直至最低浓度药液组试虫死亡率在0%～20%,最高浓度药液组试虫死亡率在80%～100%,将其作为正式试验的杀虫剂浓度范围。8.2.1.2正式测定根据预试验确定的杀虫剂浓度范围，使用相应溶剂将杀虫剂母液按等比或等差系列稀释成5个~7个浓度作为正式试验的测试药液。每个浓度试验至少重复3次，以相应溶剂处理为对照组，药膜制备、试虫处理的具体操作同预试验。8.2.2.1预试验浓度的确定8.2.2.1.1用丙酮或其他适宜的溶剂将供试杀虫剂原药配成一定浓度的母液，结合试虫采集地点环境3和用药历史，使用相应溶剂将杀虫剂母液稀释成一定浓度的测试药液进行预试验。试虫用二氧化碳或乙醚麻醉，用微量点滴器将1μL测试药液点滴于雄性成虫中足基节与后足基节间的腹板上，每个处理点滴试虫10头。将处理后的试虫转入清洁容器内正常饲养。24h后记录死亡数。8.2.2.1.2每个浓度试验至少重复2次，以点滴相应溶剂为对照组。根据试虫死亡率调整测试药液浓度，直至最低浓度药液组试虫死亡率在0%～20%,最高浓度药液组试虫死亡率在80%～100%,将其作为正式试验的杀虫剂浓度范围。8.2.2.2正式测定根据预试验确定的杀虫剂浓度范围，使用相应溶剂将杀虫剂母液按等比或等差系列稀释成5个～7个浓度作为正式试验的测试药液。8.3死亡判断8.4数据处理采用概率值分析法(probitanalysis),根据不同测试药剂浓度(剂量)对数值与相应死亡率的机率注：采用点滴法进行生物测定时，根据测试药液浓度和试虫受药量求测试药剂剂量，计算LDso;采用药膜法则计8.5结果表述结果用抗性倍数表述，抗性倍数=待测种群LC₅₀(LDo)值/敏感品系LC₅₀(LDso)值，常用杀虫剂对敏感品系德国小蠊的LC₅₀/LD₃₀见附录A中表A.1。敏感品系和待测种群LC₅₀(LD₀)的95%置信限不重叠，且抗性倍数大于或等于5倍为抗性种群。9诊断剂量法依据杀虫剂对敏感品系的毒力回归线，确定一个能区分敏感个体和抗性个体或抗性杂合子的剂量。一般以2倍(或数倍)敏感品系的99%致死浓度(99%致死量)[LC₉(LD₉)]值作为诊断剂量。用该剂量的杀虫剂处理待测种群一定数量的个体，通过死亡率来判断待测种群是否产生抗药性。9.2操作步骤9.2.1药膜法用丙酮或其他适宜的溶剂将供试杀虫剂配成一定浓度的母液，再使用相应溶剂将母液稀释到诊断剂量需要的浓度(常用杀虫剂对敏感品系德国小蠊的LC,9见表A.1),取2.5mL药剂溶液加入500mL广口瓶中，立即不断转动广口瓶或用滚瓶机滚瓶，使药液均匀分布于瓶口磨砂表面以下所有内壁，直至肉眼看不到液体流动，置于通风橱中待溶剂完全挥发。瓶口磨砂玻璃处涂抹凡士林与液体石蜡混合物(1:1),每瓶放试虫10头，接触1h后，将试虫移入清洁容器内正常饲养。24h后记录死亡数。试验至4少重复10次，以相应溶剂处理为对照组。9.2.2点滴法用丙酮或其他适宜的溶剂将供试杀虫剂配成一定浓度的母液，再使用相应溶剂将杀虫剂母液稀释到诊断剂量需要的浓度(常用杀虫剂对敏感品系德国小蠊的LD₉9见表A.1)。试虫用二氧化碳或乙醚麻醉，用微量点滴器将1μL药剂溶液点滴于雄性成虫中足基节与后足基节间的腹板上，每个处理点滴试虫10头。将处理后的试虫转入清洁容器内正常饲养。24h后记录死亡数。试验至少重复10次，以点滴相应溶剂为对照组。9.3死亡判断按照8.3对试虫进行死亡判断。9.4数据处理结果用死亡率表达，计算见公式(1)。式中：M——死亡率；Nm——死亡虫数；N——试虫总数。对照死亡率小于5%无需校正；对照死亡率在5%～20%之间，用公式(2)进行校正；对照死亡率大于20%为无效测定。Mm——校正死亡率；M,—-测定组死亡率；M.—对照组死亡率。9.5结果判定死亡率或校正死亡率小于80%为抗性种群。5(资料性)常用杀虫剂对敏感品系德国小蠊的致死剂量(浓度)表A.1给出了常用杀虫剂对敏感品系德国小蠊的致死剂量(浓度)。表A.1常用杀虫剂对敏感品系德国小蠊的致死剂量(浓度)(95%置信区间)(95%置信区间)(95%置信区间)(95%置信区间)(1.83×10-²~2.64×10-²)(4.83×10-³~8.17×10-³)乙酰甲胺磷(1.33×10-³~1.61×10-³)(2.87×10-³~5