2024 皮革 抗菌性能的测定 第1部分：膜接触法

GB/T437221—2024

.

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件是皮革抗菌性能的测定的第部分已经发布了以下部分

GB/T43722《》1。GB/T43722:

第部分膜接触法

———1:。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由中国轻工业联合会提出

。

本文件由全国皮革工业标准化技术委员会归口

(SAC/TC252)。

本文件起草单位通标标准技术服务上海有限公司浙江通天星集团股份有限公司大康控股集

:()、、

团有限公司深圳市北测检测技术有限公司上海应用技术大学西南交通大学广东省科学院微生物研

、、、、

究所广东省微生物分析检测中心天创时尚股份有限公司广东新虎威实业投资有限公司江苏集萃

()、、、

先进纤维材料研究所有限公司朗盛化学中国有限公司博富科技股份有限公司上海市徐汇区疾病

、()、、

预防控制中心上海润河纳米材料科技有限公司中国皮革制鞋研究院有限公司中轻检验认证有限公

、、、

司中关村汇智抗菌新材料产业技术创新联盟

、。

本文件主要起草人蒋红陈健胡静徐晓玲彭如群徐祥进刘志勇廖武名傅泽安倪兼明

:、、、、、、、、、、

梁嘉俊周家良张瑜廖宇涛陶志清桑军任可帅张迎增朱青周业华钱子煜谢小保吴鹏

、、、、、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T437221—2024

.

引言

皮革产品作为皮胶原蛋白质的加工产品加工过程中使用的原辅料中含有大量的油脂糖类等成

,、

分是细菌霉菌生长的良好营养源再加上皮革结构的多孔性和极性结构使其容易吸湿从而导致其在

,、,,

保存和使用过程容易受到微生物的侵入不仅在皮革表面形成白色蓝色黄色或黑色的菌斑或色斑而

,、、,

且还能向革内发展使皮革的耐磨强度和弹性等性能降低严重影响其外观及使用性能此外随着人

,、,。,

们对于预防疾病的意识不断增强各类抗菌材料和产品成为人们关注的对象明示或宣传有抗菌性能的

,,

皮革制品也逐渐成为决定市场竞争力的重要因素之一

。

皮革产品根据其来源加工过程等分为不同的类型如根据表面吸水性的差异可分为表面不吸水

、。,

皮革和表面吸水性较强的皮革根据皮革抗菌剂溶出性的不同可分为非溶出型抗菌皮革和溶出型抗菌

;,

皮革等皮革抗菌性能的测定可以根据皮革种类采用适合的检测方法

。。

旨在为皮革抗菌性能的测定提供依据拟由四个部分构成

GB/T43722,。

第部分膜接触法目的在于确立适用于表面不吸水皮革抗菌性能测定的定量试验方法

———1:。。

第部分琼脂平皿扩散法目的在于确立皮革抗菌性能测定的定性试验和评价方法

———2:。。

第部分菌液吸收法目的在于确立适用于表面吸水性很强的皮革抗菌性能测定的定量试

———3:。

验方法

。

第部分振荡法目的在于确立其他膜接触法和菌液吸收法不适用的皮革尤其适用于使用

———4:。(

了非溶出型抗菌剂的皮革抗菌性能测定的定量试验方法

)。

Ⅱ

GB/T437221—2024

.

皮革抗菌性能的测定

第1部分膜接触法

:

警示———本文件涉及的微生物可感染致病操作人员应采取一切必要的防护措施避免对人员和环

,,

境的危害试验应由经过微生物学培训且具有实践经验的专业人员在具备处理微生物技术条件的实验

。

室中进行

。

1范围

本文件描述了膜接触法测定皮革抗菌性能的定量试验方法

。

本文件适用于不吸水皮革抗菌性能的测定

。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

皮革物理和机械试验试样的准备和调节

QB/T2707

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

。

31

.

抗菌性能antimicrobialactivity

采用化学或物理方法杀灭或妨碍细菌和真菌生长繁殖以减少其数量以及活性的能力

,。

来源有修改

[:WS/T650—2019,3.1,]

32

.

对照样controlsample

未经抗菌处理用于验证试验微生物生长条件的样品

、。

4原理

通过接种定量微生物至不吸水的皮革试样表面用贴膜的方法使微生物均匀接触试样表面经一定

,,

时间培养后测定试样表面的活菌数计算抗菌率以此表示试样的抗菌性能

,,,。

5仪器设备

51恒温培养箱控温精度为

.,±1℃。

52冷藏箱温度能够保持在

.,2℃~10℃。

53二级生物安全柜

.。

1

GB/T437221—2024

.

54生物光学显微镜

.。

55压力蒸汽灭菌器温度能保持在压力能保持在

.,(121±2)℃,(103±5)kPa。

56培养皿直径为

.,90mm。

57紫外灯

.。

58接种环

.,4mm。

59天平精度为

.,±0.01g。

510计精度为

.pH,±0.2。

511模刀符合的规定内壁为的矩形

.,QB/T2707,(50±2)mm×(50±2)mm。

6试剂和材料

61除特殊说明外所用试剂均为分析纯试验用水应为蒸馏水或去离子水

.,,。

62氢氧化钠溶液

.(NaOH),0.1mol/L。

63盐酸溶液

.(HCl),0.1mol/L。

64氯化钠溶液质量分数

.(NaCl),0.85%()。

65无水磷酸氢二钠

.(Na2HPO4)。

66磷酸二氢钾

.(KH2PO4)。

67乙醇溶液体积分数

.,70%()。

68磷酸缓冲液将和加入至蒸馏水

.(PBS),2.83gNa2HPO4(6.5)1.36gKH2PO4(6.6)1000mL

中待完全溶解后用溶液或溶液调节为分装后置于压力蒸汽灭

,,NaOH(6.2)HCl(6.3)pH7.1~7.4,

菌器中条件下灭菌

,(121±2)℃15min。

69洗脱液采用中和肉汤作为洗脱液将胰蛋白胨

.,D/E(Dey-EngleyNeutralizingBroth)。5.0g、

酵母粉葡萄糖硫代乙醇酸钠硫代硫酸钠亚硫酸氢钠溴甲酚

2.5g、10.0g、1.0g、6.0g、2.5g、0.02g

紫卵磷脂吐温加入至蒸馏水中置于锥形瓶中混合并在沸水浴中充分溶

、7.0g、5.0g-80,1000mL,

解然后用溶液或溶液调节为分装后置于压力蒸汽灭菌器

。NaOH(6.2)HCl(6.3)pH7.0~7.2,

中条件下灭菌

,(121±2)℃15min。

610覆盖膜采用聚乙烯薄膜尺寸为也可与试样尺寸相适应厚度为

.,,(40±2)mm×(40±2)mm,,

用乙醇溶液浸泡再用蒸馏水冲洗自然晾干也可使用均质袋切下

0.05mm~0.10mm。(6.7)10min,,。

的膜

。

611对照样聚乙烯片材质厚度尺寸为与试样尺寸一致也

.,,<10mm,(50±2)mm×(50±2)mm,。

可使用均质袋切下的膜

。

7培养基

71营养肉汤培养基NB

.()

将牛肉膏蛋白胨和氯化钠与蒸馏水混合加热溶解然后用

5.0g、10.0g5.0g1000mL,,NaOH

溶液或溶液调节为分装后置于压力蒸汽灭菌器中条件下灭

(6.2)HCl(6.3)pH7.0~7.2,,(121±2)℃

菌

15min。

72营养琼脂培养基NA

.()

将牛肉膏蛋白胨氯化钠和琼脂与蒸馏水混合加热溶解然

5.0g、10.0g、5.0g15.0g1000mL,,

后用溶液或溶液调节为分装后置于压力蒸汽灭菌器中

NaOH(6.2)HCl(6.3)pH7.0~7.2,,(121±2)℃

条件下灭菌

15min。

2

GB/T437221—2024

.

73马铃薯培养基PDA

.()

将马铃薯浸粉葡萄糖琼脂和氯霉素与蒸馏水混合加热煮沸

5.0g、20.0g、20.0g0.1g1000mL,

至完全溶解然后用溶液或溶液调节为分装后置于压力蒸汽灭菌

,NaOH(6.2)HCl(6.3)pH5.8~6.2,

器中条件下灭菌

,(121±2)℃15min。

74平板计数琼脂PCA

.()

将酵母粉胰蛋白胨葡萄糖和琼脂与蒸馏水混合加热溶解然

2.5g、5.0g、1.0g15.0g1000mL,,

后用溶液或溶液调节为分装后置于压力蒸汽灭菌器中

NaOH(6.2)HCl(6.3)pH7.0~7.2,,(121±2)℃

条件下灭菌

15min。

8试验菌种

81菌种

.

试验菌种通常至少采用种如下所示

3,。

革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌细菌或

———:(,ATCC6538CGMCC1.2465)。

革兰氏阴性菌大肠杆菌细菌或

———:(,ATCC8739CGMCC1.2463)。

白色念珠菌真菌或

———(,ATCC10231CGMCC2.2086)。

也可根据客户要求选用其他菌种应至少包括细菌和真菌其中细菌种类至少含有种革兰氏阳性

,,1

和种革兰氏阴性菌种并在报告中注明试验菌种及编号所有菌种均应由国家相应菌种保藏管理中

1,。

心提供选用其他菌种时培养基成分培养温度和培养方法可根据需要调整

。,、。

82菌种保存

.

对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌将菌种接种于斜面上在下培养

,NA(7.2),(37±1)℃18h~24h;

对于白色念珠菌将菌种接种于斜面上在下培养然后置于

,PDA(7.3),(28±1)℃24h~48h。5℃~10℃

下保存不应超过个月作为斜面保存菌

(1),。

9试验菌液的制备

91接种液的制备

.

用溶液稀释培养基用于金黄色葡萄球菌培养的质量分数为用于大肠杆

NaCl(6.4)NB,NB1%,

菌培养的质量分数为白色念珠菌采用磷酸缓冲液配制用溶液或

NB0.2%,(PBS)。NaOH(6.2)HCl

溶液调节为分装后置于压力蒸汽灭菌器中条件下灭菌为便

(6.3)pH7.0~7.2,,(121±2)℃15min。

于菌种分散可加入少量表面活性剂如吐温等

(-80)。

92菌种活化

.

对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌将斜面保存菌转接至平板上在下培养

,NA(7.2),(37±1)℃

再连续转接次后在代以内的新鲜菌种培养物内培养物用于菌悬液的制备对

18h~24h,1(5)(24h);

于白色念珠菌将斜面保存菌转接到马铃薯培养基平板上在下培养再连

,(PDA),(28±1)℃24h~48h,

续转接次后在代以内的新鲜菌种培养物内培养物用于菌悬液的制备

1(5)(48h)。

93菌悬液的制备

.

用接种环从的新鲜菌种培养物上取环环新鲜菌种加入到接种液中用显

(5.8)9.21~2,20mL(9.1),

3

GB/T437221—2024

.

微镜观察法或其他合适的方法估计活菌数目倍梯度稀释并选择菌液浓度为5

,102.5×10CFU/mL~

5的稀释液作为试验菌液该试验菌液冰冷保存在内使用

10.0×10CFU/mL。3℃~4℃,4h。

10试样的准备

101试样和对照样的取样

.

试样用模刀从粒面切取块尺寸为的试样试样厚度不应大于

:6(50±2)mm×(50±2)mm,5mm。

片用于接触测试片用于规定时间的接触测试

3“0”,3。

若试样尺寸无法满足切取条件可切取块尺寸不小于的试样同时覆

,6(20±1)mm×(20±1)mm,

盖膜聚乙烯薄膜也相应减小

。

对照样片片用于接触测试片用于规定时间的接触测试

(6.11):6,3“0”,3。

102试样和对照样的灭菌

.

通常采用紫外灯处理灭菌将试样和对照样的正反面在紫外灯下分别照射灭菌也可选用其他适

,。

宜的灭菌方法试样的灭菌处理应以不影响试样的抗菌性能为原则如采用其他灭菌方法应在试验报

,。,

告中注明

。

11试验步骤

111接种

.

将试样和对照样分别放入灭菌培养皿中保持待测面向上用移液管分别移取菌悬液

,,0.4mL

缓慢滴加到每个试样和对照样的待测面上然后将聚乙烯薄膜覆盖于菌液上调节使菌液

(9.3),,(6.10),

分散到整个聚乙烯薄膜注意避免菌液从薄膜边缘溢出盖上培养皿的上盖每组试样做个平行

,,。3

试验

。

若试样尺寸较小可移取菌悬液使贴膜后试样表面的菌液中含菌数量达到

,0.1mL~0.4mL,

5片5片

1.0×10CFU/~4.0×10CFU/。

有些试样表面很难防止菌液溢出可通过增加惰性增稠剂如质量分数为的琼脂等

,(0.1%~0.3%)

以增加菌液的黏度防止溢出并在试验报告中注明

,,。

如果因样品表面的花纹很难防止菌液溢出可以通过倒贴膜的方法进行测试试样尺寸调整为

,“”。

聚乙烯薄膜尺寸为菌悬液中增加

(40±2)mm×(40±2)mm,(6.10)(50±2)mm×(50±2)mm。(9.3)

惰性增稠剂以增加菌液的黏度用移液管移取菌悬液缓慢滴加到每个聚乙烯薄膜表

,0.4mL,(6.10)

面将试样待测面朝下覆盖于菌液上调节使菌液分散到整个试样注意避免菌液从试样边缘溢出如

,,,,。

采用该方法应在试验报告中注明

,。

112培养

.

对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌将接种后的试样和对照样在相对湿度的条件

,(37±1)℃、≥90%

下培养对于白色念珠菌将接种后的试样和对照样在相对湿度的条件下培养

24h;,(28±1)℃、≥90%

48h。

113活菌回收

.

11310接触时间的洗脱

..“”

分别量取洗脱液到个接触时间的试样和对照样中充分洗脱后取一定量的洗脱

20mL(6.9)3“0”,,

4

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.

液用倍稀释法系列稀释至合适稀释倍数金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种于平板计数琼脂

,10。(PCA)

中每个稀释倍数制作两个平行样在下培养白色念珠菌接种于马铃薯培养基

,,(37±1)℃24h~48h。

中在下培养然后进行活菌计数

(PDA),(28±1)℃48h~72h,。

1132培养后的洗脱

..

分别量取洗脱液到培养后的试样和对照样中充分洗脱后取一定量的洗脱

20mL(6.9)(11.2),,

液用倍稀释法系列稀释至合适稀释倍数金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种于平板计数琼脂

,10。(PCA)

中每个稀释倍数制作两个平行样在下培养白色念珠菌接种于马铃薯培养基

,,(37±1)℃24h~48h。

中在下培养然后进行活菌计数

(PDA),(28±1)℃48h~72h,。

如试验菌悬液中增加惰性增稠剂以增加菌液的黏度洗脱时需要采用机械搅拌如均质旋动

(9.3),,、

或超声波振动等需验证这些方法的回收有效性后方可采用

,。

注对于厚度较大的皮革适当增加洗脱液的用量并在试验报告中注明

:,,。

114菌落计数

.

用肉眼观察必要时可用放大镜或菌落计数器记录稀释倍数和相应的菌落数量以表示

(),,CFU。

选取菌落数在无蔓延菌落生长的平板记录菌落总数小于的平板记

30CFU~300CFU、。30CFU

录具体菌落数大于的可记录为多不可计每个稀释倍数的菌落数取两个平板的平均数

,300CFU。。

若平板有较大片状菌落生长时不宜采用应以无片状菌落生长的平板作为该稀释倍数菌落数若

,,;

片状菌落生长不到平板的一半另一半中菌落分布比较均匀可计算半个平板后乘以代表该平板中

,,2,

的菌落数

。

当平板出现菌落间无明显界限的链状生长时将每条单链作为一个菌落计数

,。

12结果计算与表示

121活菌数

.

试验结果以试样中的活菌数表示按公式进行计算

,(1):

N=C×D×V

…………(1)

式中

:

N每个试样的活菌数单位为菌落形成单位每片片

———,(CFU/);

C菌落数平均值单位为菌落形成单位

———,(CFU);

D稀释倍数

———;

V洗脱液体积与计数时所取洗脱液体积的比值

———。

活菌数N的计算结果保留两位有效数字在V为的情况下对菌落数小于的情况活菌数试

。20,1

验结果记为小于

20。

试验结果取个试样中的活菌数的算术平均值保留两位有效数字当活菌数小于时用进

3,。20,20

行平均值计算保留两位有效数字

,。

122试验的有效性

.

当试验同时满足以下个条件时则试验有效否则应重新取样进行试验

3,,:

个对照样的接触时间的活菌数应符合最高对数值最低对数值平均活菌数值对数

a)3“0”(-)/

值的要求

≤0.2;

个对照样