【蛋白质组学概述4400字】

蛋白质组学概述1.1引言人类基因组测序工作的完成，预示着人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP)的顺利收关，人类生命科学研究成功迈入后基因组时代[1]。而功能基因组学(Functionalgenomics)则成为后基因组时代生命科学领域的主要研究对象。结构基因组学和蛋白质组学是功能基因组学的两个重要组成部分[2,3]。蛋白质是生物体生命活动的功能执行者，支撑着细胞内所有代谢和调节过程。蛋白质组(Proteome)的概念最早由Wilkins和Williams于1994年提出，是指特定时间、特定空间下，一个细胞器、细胞、器官、组织、甚至生物体内所有的基因表达的蛋白质[4]。而蛋白质组学(Proteomics)则是以一个蛋白质组为对象，研究蛋白质的组成、结构、表达水平、翻译后修饰(Post-translationalmodifications,PTMs)以及相互作用等在时空差异和不同生理病理状态下的动态变化[5]。因此，蛋白质组学研究有利于从蛋白分子水平认识生物体的生理和病理机制，从而极大地促进功能基因组学的发展，已经成为后基因组时代最热门和最重要的领域。蛋白质组学研究主要包括三个领域：(1)蛋白质微观结构表征用于大规模鉴定蛋白质及其翻译后修饰；(2)“差异显示”蛋白质组学用于蛋白质水平的比较；(3)利用质谱技术或酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用。然而，和基因组学相比，尽管蛋白质组学发展迅速，各种蛋白质鉴定方法被开发和升级，蛋白质组学研究仍面临巨大挑战。其原因主要和蛋白质复杂的生成过程有关。蛋白质是通过基因转录产生信使RNA，然后由信使RNA翻译生成的，这其中还会发生信使RNA的可变剪接和蛋白质的翻译后修饰，产生蛋白质变体(Proteoforms)（预计高达106种）[6,7]。所以，人体内的蛋白质种类和数量异常庞大。同时，同一基因产生的蛋白质，在不同的生物体、组织、器官和细胞内都不一样，执行的生物功能也不一样，且随时间的推移而发生变化，造就了蛋白质组的时空分布多样性和功能复杂性[8,9]。其次，细胞中基因所表达的蛋白之间的浓度差异高达106倍[10]，而在人血浆中，该差异甚至可以达到1010倍以上[11]，因此，蛋白质的丰度具有极宽的动态范围。综合以上因素，和静态的基因组(Genome)完全不同的是，蛋白质组具有特殊的复杂性，使得蛋白质组学研究的难度更大，人类蛋白质组计划(HumanProteomeProject,HPP)的任务更艰巨。1.2基于生物质谱的蛋白质组学研究为应对蛋白质组的复杂性所带来的严峻挑战，近年来，各种蛋白质组学的基础理论和研究方法不断革新升级，例如蛋白质和多肽的分离分析方法、质谱鉴定技术、同位素标记定量法和生物信息学数据分析技术等。其中，具有高通量、高分辨率、高灵敏度的生物质谱技术的飞速发展，使蛋白质组学研究的发展产生了质的飞跃。目前，围绕生物质谱鉴定技术，蛋白质组学研究的策略主要分为三种：Top-down，Bottom-up和Middle-down策略[12]，其具体工作流程如图1-1所示。图1-1基于生物质谱技术的三种蛋白质组学研究策略的工作流程[12]Figure1-1TheworkflowofthreestragetiesforbioMass-basedproteomics.[12]Top-down策略即“自上而下”策略[13]。在蛋白质组学领域，Top-down的概念包含两种不同的技术。当用于高纯度的蛋白质鉴定时，技术方案类似于DNA测序(DNAsequencing)，所以称为“自上而下”测序(Top-downsequencing)。然而，当其用于蛋白质分析时，被称为“自上而下”蛋白质组学(Top-downproteomics)，主要是通过液相色谱和2-D凝胶电泳等传统分离技术，对复杂生物样品中的蛋白质预先分离，然后，进入质谱或者凝胶成像平台进行蛋白质差异表达分析。该策略是从蛋白质水平进行分析，保留了蛋白质更多的结构和PTMs信息，因此具有更高的蛋白质鉴定覆盖率。Top-downproteomics策略的样品制备流程简单，无需蛋白质酶解等复杂操作，更适合于临床诊断中疾病标志蛋白的快速筛查。但由于前端蛋白质分离技术的瓶颈和大分子蛋白质高效电离质谱的缺乏，该策略目前仅限于简单样品中小分子量蛋白质的分析。Bottom-up策略即“自下而上”策略，又称鸟枪法[14]，是当下蛋白质组学研究领域的主流方法。通过蛋白质内切酶(通常为Trypsin)将样品中所有的蛋白质以特定的酶切位点酶解为小分子量的肽段，进入液相色谱-串联质谱联用平台(LC-MS/MS)分析，数据库检索后，对检测到的肽段打分匹配，得到可信度高的蛋白质序列信息。若酶解前，对蛋白质进行同位素标记，即可依靠Bottom-up策略实现蛋白质的差异表达分析。该策略极度依赖液相分离和质谱鉴定技术，高灵敏度、高分辨率和高通量的先进LC-MS/MS平台，可以实现痕量蛋白质的全面和深度覆盖分析。但是，样品的酶解效率会严重影响Bottom-up策略的分析结果，酶解不完全，酶切后的肽段信息较少，质谱鉴定覆盖率低，使得蛋白质分析的准确率下降。Middle-down策略即“自中而下”策略[15]。Middle的概念主要来源于检测对象，蛋白质通过特异性的内切酶(比如Asp-N和Glu-C)酶解为Middle-range(3-9kDa)分子量的肽段片段，然后进入LC-MS/MS平台分析鉴定。足够长度序列的肽段，既能避免蛋白质间肽段碎片化冗余和后修饰信息的丢失，增加蛋白质鉴定覆盖率，同时，肽段的序列增长后，所带电荷增多，有利于二级质谱电离效率的增强。因此，该策略兼具以上两种策略的优点，是蛋白质组学研究领域新兴的研究策略。1.3翻译后修饰蛋白质组学概述蛋白质翻译后修饰(PTMs)通过共价修饰功能基团、调节蛋白质亚基的水解切割或者蛋白质的整体降解，改变蛋白质的分子质量、所带电荷、结构以及构象等性质，从而赋予蛋白质特殊的功能多样性。蛋白质的翻译后修饰不仅影响蛋白质本身的活性状态、定位、折叠、稳定性以及蛋白质间相互作用，还在细胞识别、信号传导、生长、分化和新陈代谢等生物过程中发挥着至关重要的作用[16-18]。据估计，目前已发现的蛋白质PTMs有400多种，在这些修饰中，常见的有磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化等（如图1-2所示），几乎影响着细胞生物过程和发病机制的所有方面[7,19,20]。因此，蛋白质的翻译后修饰分析对于细胞生物学的理解、疾病的发病机制以及预防和诊疗研究具有极其重要的意义，已经成为蛋白质组学研究最重要的组成部分[19,20]。磷酸化翻译后修饰是最为常见的蛋白质翻译后修饰之一，受控于蛋白激酶和磷酸酶，发生蛋白质的磷酸化和去磷酸化的动态可逆过程[21]。蛋白质磷酸化在细胞整个生命周期的几乎所有生物学过程中发挥着重要的调控作用，其中包括细胞的增殖、分裂、分化、信号传导、凋亡等[22-24]。在哺乳动物的细胞生命周期中，约有三分之一的蛋白质发生过磷酸化修饰；而因为蛋白质磷酸化的动态可逆性，在特定时间下，只有1%-2%的蛋白质发生磷酸化，所以，磷酸化修饰蛋白的含量极低。目前，真核细胞中发现的磷酸化修饰方式共有4种，包括O-磷酸化、N-磷酸化、S-磷酸化和酰基磷酸化。其中，O-磷酸化主要发生在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，是最常见且研究最广泛的磷酸化修饰方式，约占磷酸化修饰总数的98%[25]。N-磷酸化主要发生在蛋白质的精氨酸、组氨酸和赖氨酸残基上，S-磷酸化主要发生在半胱氨酸残基上，而酰基磷酸化主要发生在天冬氨酸和谷氨酸残基上。研究表明，蛋白质的异常磷酸化和许多疾病的发生发展密切相关，比如癌症[26]、阿尔茨海默症[27]、帕金森病[28]、糖尿病[29]、心血管疾病[30]和神经退行性疾病[31]等。因此，蛋白质的磷酸化修饰分析，对于阐明疾病的发生发展机制以及寻找相关的疾病诊疗方案具有重要的指导意义[32]。图1-2文献报道的蛋白质翻译后修饰Figure1-2Thepost-translationalmodificationsreportedinreferences.糖基化翻译后修饰是另外一种最为常见且最重要的蛋白质翻译后修饰。蛋白质的糖基化主要包括N-糖基化、O-糖基化、GPI-锚定糖基化和C-糖基化，其中N-糖基化和O-糖基化研究最为广泛[33,34]。N-糖基化蛋白的糖链连接在Asn-X-Ser/Thr固定序列的天冬酰胺(Asn)中的酰胺氮(N)原子上，其中，X为除脯氨酸之外的任意氨基酸。同时，N-糖基化蛋白的糖链都具有五糖核心结构(Man3GalNAc2)，但是，该糖链结构的剩余部分各不相同，具体包括高甘露糖型、复合型以及杂合型[33]。O-糖基化则是发生在蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上，通过羟基中的氧(O)原子连接，其糖基化蛋白的糖链结构不存在共有核心结构[34]。蛋白质的糖基化翻译后修饰会改变蛋白质的二级结构，影响多种生物学过程，如蛋白质的折叠/运输/定位、细胞粘附、细胞分裂、免疫反应等[35]。蛋白质糖基化翻译后修饰的异常往往与癌症的发生发展有关，临床上已知的癌症诊断标志物或者治疗靶标多数都为糖基化蛋白，比如甲胎蛋白、癌胚抗原和前列腺特异性抗原等[36]。因此，蛋白质糖基化翻译后修饰分析，在癌症标志物的发现和癌症早期临床诊断、预防以及治疗中具有重大的意义。近年来，结合蛋白质组学的研究策略，翻译后修饰蛋白质组学研究(Modification-specificproteomics)取得了一定的研究进展[37,38]。目前，翻译后修饰蛋白质组学研究的主要方法是基于生物质谱的Bottom-up策略，利用各种分离方法、质谱鉴定技术和生物信息学手段对蛋白质的翻译后修饰进行分析。然而，在目前的蛋白质组学分析技术下，基于生物质谱的翻译后修饰蛋白质组学研究仍面临严峻的挑战，其原因主要体现在（1）翻译后修饰蛋白大部分为低丰度蛋白，化学计量水平极低，需要高灵敏度的质谱仪器的支撑；（2）蛋白质的翻译后修饰具有动态可逆性，研究特定时空的蛋白翻译后修饰难度很大；（3）高丰度的非翻译后修饰蛋白/多肽会强烈干扰和抑制翻译后修饰的蛋白/多肽在质谱中的电离和信号响应。因此，探索高效、高选择性的分离富集方法，对复杂生物样品中的翻译后修饰多肽进行质谱鉴定前的高效、高选择性分离富集，是实现翻译后修饰蛋白组学高覆盖率鉴定的基础和关键，已成为翻译后修饰蛋白组学研究的热点与难点问题[39,40]。参考文献[1]BaakJPA,JanssenEAM,SoreideK,etal.Genomicsandproteomics—thewayforward[J].AnnalsofOncology,2005,16:ii30-ii44.[2]SauerS,LangeBMH,GobomJ,etal.Miniaturizationinfunctionalgenomicsandproteomics[J].NatureReviewsGenetics,2005,6(6):465-476.[3]AggarwalK,LeeHK.Functionalgenomicsandproteomicsasafoundationforsystemsbiology[J].BriefingsinFunctionalGenomics,2003,2(3):175-184.[4]PandeyA,MannM.Proteomicstostudygenesandgenomes[J].Nature,2000,405(6788):837-846.[5]CoxJ,MannM.IsProteomicstheNewGenomics?[J].Cell,2007,130(3):395-398.[6]SmithLM,KelleherNL,LinialM,etal.Proteoform:asingletermdescribingproteincomplexity[J].NatureMethods,2013,10(3):186-187.[7]AebersoldR,AgarJN,AmsterIJ,etal.Howmanyhumanproteoformsarethere?[J].NatureChemicalBiology,2018,14(3):206-214.[8]JiangY,SunA,ZhaoY,etal.Proteomicsidentifiesnewtherapeutictargetsofearly-stagehepatocellularcarcinoma[J].Nature,2019,567(7747):257-261.[9]ShimogawaMM,SaadaEA,VashishtAA,etal.Cellsurfaceproteomicsprovidesinsightintostage-specificremodelingofthehost-parasiteinterfaceintrypanosomabrucei[J].Molecular&CellularProteomics,2015,14(7):1977-1988.[10]PicottiP,BodenmillerB,MuellerLN,etal.FulldynamicrangeproteomeanalysisofS.cerevisiaebytargetedproteomics[J].Cell,2009,138(4):795-806.[11]HortinGL,SviridovD.Thedynamicrangeproblemintheanalysisoftheplasmaproteome[J].JournalofProteomics,2010,73(3):629-636.[12]MoradianA,KalliA,SweredoskiMJ,etal.Thetop-down,middle-down,andbottom-upmassspectrometryapproachesforcharacterizationofhistonevariantsandtheirpost-translationalmodifications[J].Proteomics,2014,14(4-5):489-497.[13]ChenB,BrownKA,LinZ,etal.Top-downproteomics:readyforprimetime?[J].AnalyticalChemistry,2018,90(1):110-127.[14]ZhangY,FonslowBR,ShanB,etal.Proteinanalysisbyshotgun/bottom-upproteomics[J].ChemicalReviews,2013,113(4):2343-2394.[15]WuC,TranJC,ZamdborgL,etal.Aproteasefor'middle-down'proteomics[J].NatureMethods,2012,9(8):822-824.[16]DeribeYL,PawsonT,DikicI.Post-translationalmodificationsinsignalintegration[J].NatureStructural&MolecularBiology,2010,17(6):666-672.[17]GallegoM,VirshupDM.Post-translationalmodificationsregulatethetickingofthecircadianclock[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2007,8(2):139-148.[18]VucicD,DixitVM,WertzIE.Ubiquitylationinapoptosis:apost-translationalmodificationattheedgeoflifeanddeath[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2011,12(7):439-452.[19]KruegerKE,SrivastavaS.Posttranslationalproteinmodifications:currentimplicationsforcancerdetection,prevention,andtherapeutics[J].Molecular&CellularProteomics,2006,5(10):1799-1810.[20]PagelO,LorochS,SickmannA,etal.Currentstrategiesandfindingsinclinicallyrelevantpost-translationalmodification-specificproteomics[J].ExpertReviewofProteomics,2015,12(3):235-253.[21]CohenP.Theoriginsofproteinphosphorylation[J].NatureCellBiology,2002,4(5):E127-E130.[22]KarinM,HunterT.Transcriptionalcontrolbyproteinphosphorylation:signaltransmissionfromthecellsurfacetothenucleus[J].CurrentBiology,1995,5(7):747-757.[23]BourretRB,BorkovichKA,SimonMI.Signaltransductionpathwaysinvolvingproteinphosphorylationinprokaryotes[J].AnnualReviewofBiochemistry,1991,60(1):401-441.[24]HumphreySJ,JamesDE,MannM.Proteinphosphorylation:amajorswitchmechanismformetabolicregulation[J].TrendsinEndocrinology&Metabolism,2015,26(12):676-687.[25]SharmaK,D’SouzaRochelle

CJ,TyanovaS,etal.UltradeephumanphosphoproteomerevealsadistinctregulatorynatureofTyrandSer/Thr-basedsignaling[J].CellReports,2014,8(5):1583-1594.[26]IrishJM,HovlandR,KrutzikPO,etal.Singlecellprofilingofpotentiatedphospho-proteinnetworksincancercells[J].Cell,2004,118(2):217-228.[27]SantiniE,ValjentE,Fisone