重组枯草芽孢杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱的研究

重组枯草芽孢杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱的研究摘要为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis中的表达并通过细胞内的葡萄糖脱氢酶完成辅酶的再生，以枯草芽孢杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD为表达元件，将羰基还原酶基因mldh连接至构建好的载体pHY300plk-PrpsD-TrpsD中获得重组质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD，然后将其电转化至枯草芽孢杆菌Wb600中获得重组菌B.subtilisWb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)；对此重组菌进行全细胞生物转化反应实验发现，在葡萄糖存在的情况下，其可转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(简称MAK)生成d-伪麻黄碱，产量最高达97.5mg/L，底物摩尔转化率为24.1%。研究结果为利用重组B.subtilis生物转化生产d-伪麻黄碱进行了有益探索。关键词重组枯草芽孢杆菌；d-伪麻黄碱；生物转化；羰基还原酶一、引言麻黄碱(Ephedrine)，化学名为1-苯基-2-甲胺基丙醇，是一种从天然植物麻黄草中分离而得到的芳胺醇类生物碱。麻黄碱及其立体异构体伪麻黄碱(Pseudoephedrine)具有多种药理活性，如松弛支气管平滑肌、收缩血管、兴奋中枢神经等，在医药领域有着广泛的应用。目前，在工业生产中，麻黄碱主要来源于麻黄植物直接提取或化学合成。然而，从麻黄植物提取麻黄碱受到植物资源有限、生长周期长以及对生态环境破坏等因素的限制；化学合成法虽然能够大规模生产，但存在反应步骤繁琐、环境污染严重以及产物光学纯度不高等问题。因此，开发一种高效、绿色、可持续的麻黄碱生产方法具有重要的现实意义。生物转化法作为一种新兴的生产方法，具有反应条件温和、选择性高、环境友好等优点，逐渐成为研究的热点。在生物转化制备麻黄碱的过程中，羰基还原酶能够催化1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)不对称还原生成d-伪麻黄碱。然而，该反应需要辅酶NAD(P)H的参与，而辅酶价格昂贵且在反应中容易消耗，因此如何实现辅酶的有效再生成为生物转化法生产麻黄碱的关键问题之一。已有研究表明，利用酶耦联法可以解决生物转化制备麻黄碱的过程中辅酶的再生问题。本研究通过构建枯草芽孢杆菌游离表达质粒，将羰基还原酶基因mldh导入枯草芽孢杆菌Wb600(蛋白酶缺陷型菌株)中使得羰基还原酶能够在枯草芽孢杆菌中表达，并利用枯草芽孢杆菌细胞内自身的葡萄糖脱氢酶(GDH)实现辅酶NAD(P)H的再生，从而对重组枯草芽孢杆菌专一性转化产d-伪麻黄碱进行了初步探讨。二、材料与方法2.1材料2.1.1菌株与质粒大肠杆菌EscherichiacoliDH5α、枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWb600为本实验室保存；肠-枯草杆菌穿梭载体pHY300plk由江南大学工业生物技术教育部重点实验室惠赠；含有羰基还原酶基因mldh的质粒pMD18-T-mldh为本实验室构建。2.1.2主要试剂与仪器限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA连接酶、pfuDNA聚合酶、DNAMarker、ProteinMarker等均购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxoid公司；1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)、d-伪麻黄碱标准品购自Sigma公司；其他常规化学试剂均为国产分析纯。PCR仪(Eppendorf公司)、高速冷冻离心机(Eppendorf公司)、恒温摇床(NewBrunswick公司)、电泳仪(Bio-Rad公司)、高效液相色谱仪(Agilent公司)、超高效液相色谱-质谱联用仪(Waters公司)等。2.2方法2.2.1引物设计与合成根据GenBank中枯草芽孢杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD的序列以及羰基还原酶基因mldh的序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物，引物序列如下：PrpsD-F：5'-CGCGGATCCATGAGAGAAAAAGAGAAGAAG-3'(下划线部分为BamHⅠ酶切位点)PrpsD-R：5'-CCGAAGCTTTTATTTCTCTTCTTTTCCTCT-3'(下划线部分为HindⅢ酶切位点)TrpsD-F：5'-CGCGGATCCAAATATTTTACGAGTGAGCG-3'(下划线部分为BamHⅠ酶切位点)TrpsD-R：5'-CCGAAGCTTCTACAGCAGCAGCAGCAGC-3'(下划线部分为HindⅢ酶切位点)mldh-F：5'-CGCGGATCCATGAAGATCATCGACGACG-3'(下划线部分为BamHⅠ酶切位点)mldh-R：5'-CCGAAGCTTTTACTTGTAGTTGCCGTCG-3'(下划线部分为HindⅢ酶切位点)引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2.2.2目的基因的扩增以枯草芽孢杆菌Wb600基因组DNA为模板，分别扩增PrpsD和TrpsD片段；以质粒pMD18-T-mldh为模板，扩增mldh片段。PCR反应体系(50μL)：10×PCRBuffer5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，模板DNA1μL，pfuDNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，ddH₂O37.5μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用胶回收试剂盒回收目的片段。2.2.3载体pHY300plk-PrpsD-TrpsD的构建用BamHⅠ和HindⅢ双酶切载体pHY300plk和回收的PrpsD片段，酶切体系(20μL)：10×Buffer2μL，BamHⅠ(10U/μL)0.5μL，HindⅢ(10U/μL)0.5μL，载体或DNA片段10μL，ddH₂O7μL。37℃酶切3h后，用胶回收试剂盒回收酶切产物。将回收的PrpsD片段与酶切后的载体pHY300plk用T4DNA连接酶进行连接，连接体系(10μL)：10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase(350U/μL)0.5μL，载体片段2μL，PrpsD片段5μL，ddH₂O1.5μL。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含有氯霉素(34μg/mL)的LB平板上，37℃培养12-16h。挑取单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定，阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序正确的重组质粒命名为pHY300plk-PrpsD。用同样的方法，将回收的TrpsD片段与BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pHY300plk-PrpsD质粒进行连接、转化、鉴定，获得重组质粒pHY300plk-PrpsD-TrpsD。2.2.4重组质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD的构建用BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pHY300plk-PrpsD-TrpsD和回收的mldh片段，酶切、回收方法同2.2.3。将回收的mldh片段与酶切后的pHY300plk-PrpsD-TrpsD质粒用T4DNA连接酶进行连接、转化、鉴定，获得重组质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD。2.2.5重组菌B.subtilisWb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)的构建将重组质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD电转化至枯草芽孢杆菌Wb600感受态细胞中。电转化条件：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω。电转化后，立即加入1mL复苏培养基(含0.5mol/L蔗糖的LB培养基)，37℃、200r/min振荡培养1h。将复苏后的菌液涂布于含有氯霉素(34μg/mL)的LB平板上，37℃培养12-16h。挑取单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定，阳性克隆即为重组菌B.subtilisWb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)。2.2.6重组菌的诱导表达及全细胞生物转化反应将重组菌B.subtilisWb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)接种于含有氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，按1%的接种量转接至新鲜的LB液体培养基(含氯霉素34μg/mL)中，继续培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达，诱导时间为4h。诱导结束后，5000r/min离心10min收集菌体，用0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤菌体2次，并重悬菌体至一定浓度。取1mL菌体悬液，加入9mg葡萄糖和0.05mg的MAK，在37℃、200r/min条件下进行全细胞生物转化反应。分别在反应0、2、4、6、8、10、12h时取反应液，12000r/min离心10min，取上清液用于高效液相色谱法(HPLC)检测d-伪麻黄碱的产量。2.2.7分析方法采用高效液相色谱法(HPLC)检测d-伪麻黄碱的产量。色谱条件：HanbonVenusilXBPC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)(30:70，v/v)；流速为1.0mL/min；检测波长为210nm；柱温为30℃。进样量为20μL。以外标法计算d-伪麻黄碱的含量。为了进一步确定转化产物，采用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)对转化产物进行分析。色谱条件：WatersAcquityUPLCBEHC18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(30:70，v/v)；流速为0.3mL/min；检测波长为210nm；柱温为30℃。进样量为2μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压为35V；离子源温度为120℃；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流量为600L/h；锥孔气流量为50L/h。三、结果与分析3.1目的基因的扩增以枯草芽孢杆菌Wb600基因组DNA为模板，扩增得到的PrpsD片段大小约为500bp，TrpsD片段大小约为300bp；以质粒pMD18-T-mldh为模板，扩增得到的mldh片段大小约为820bp，与预期大小相符(图1)。3.2重组质粒的构建与鉴定将PrpsD、TrpsD和mldh片段分别连接至载体pHY300plk中，构建得到重组质粒pHY300plk-PrpsD-TrpsD和pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD。对重组质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，结果如图2所示。PCR鉴定结果显示，以重组质粒为模板扩增出的条带大小与目的基因片段大小一致；双酶切鉴定结果显示，重组质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，得到与预期大小相符的片段，表明重组质粒构建成功。将重组质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与目的基因序列一致，进一步证明重组质粒构建正确。3.3重组菌的鉴定将重组质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD电转化至枯草芽孢杆菌Wb600感受态细胞中，挑取单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定，结果如图3所示。PCR鉴定结果显示，重组菌中扩增出了与目的基因mldh大小一致的条带；双酶切鉴定结果显示，重组菌质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，得到与预期大小相符的片段，表明重组菌构建成功。3.4重组菌的诱导表达及全细胞生物转化反应对重组菌B.subtilisWb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD)进行诱导表达，SDS分析结果如图4所示。与未诱导的重组菌相比，诱导后的重组菌在相对分子质量约为30kDa处出现了一条明显的蛋白条带，与羰基还原酶的理论相对分子质量相符，表明羰基还原酶基因mldh在重组菌中得到了表达。对重组菌进行全细胞生物转化反应，在反应体系中加入葡萄糖作为辅酶再生底物，利用重组菌细胞内的葡萄糖脱氢酶实现辅酶NAD(P)H的再生。HPLC检测结果如图5所示，随着反应时间的延长，d-伪麻黄碱的产量逐渐增加，在反应12h时，d-伪麻黄碱的产量达到最高，为97.5mg/L，底物MAK的摩尔转化率为24.1%。之后，随着反应时间的进一步延长，d-伪麻黄碱的产量略有下降，可能是由于产物的反馈抑制作用或酶的稳定性下降等原因导致。为了进一步确定转化产物，采用UPLC-MS对转化产物进行分析。选择离子色谱-质谱图如图6所示，在保留时间为3.52min处出现的峰对应的离子峰(m/z)为166，与d