金龟子绿僵菌与小檗碱复配制剂的制备及性能研究

金龟子绿僵菌与小檗碱复配制剂的制备及性能研究一、引言1.1研究背景与意义随着人们对环境保护和食品安全的关注度不断提高，生物农药作为一种绿色、环保的植保产品，在农业生产中的应用越来越广泛。生物农药具有对环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗药性等优点，符合农业可持续发展的需求。据相关数据显示，2023年全球生物农药市场销售额达到了49亿美元，预计2030年将达到103亿美元，年复合增长率（CAGR）为10.9%（2024-2030），这充分表明生物农药市场具有巨大的发展潜力。金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）是一种重要的虫生真菌，寄主范围广泛，包括8个目30个科200多种昆虫，如草地贪夜蛾、蚜虫、蝗虫等农业害虫，在蔬菜、花卉、果树及农作物的害虫防治中发挥着重要作用。它主要通过体表接触感染昆虫，孢子附着在昆虫体表后，萌发产生芽管，穿透昆虫体壁进入体内，然后在昆虫体内生长繁殖，分泌毒素，最终导致昆虫死亡。例如，仲恺农业工程学院资源与环境学院梁超鹏等人的研究发现，金龟子绿僵菌ZKJGL菌株在孢子浓度为5×108cfu/mL时，侵染草地贪夜蛾后累计死亡率达77.78%，LC50为4.406×106cfu/mL，LT50少于4d，对草地贪夜蛾幼虫具有较强的致病力。然而，金龟子绿僵菌在实际应用中也存在一些局限性，如杀虫速度相对较慢、受环境因素影响较大等。在南方地区，高温和强紫外线等环境条件会影响其防治效果，限制了它的大规模推广与应用。小檗碱（Berberine）是一种天然的异喹啉类生物碱，常见于小檗科三颗针、毛茛科黄连、芸香科黄柏等多种清热解毒类中药中。传统药理研究表明，小檗碱具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒作用，被长期应用于治疗多种细菌引起的消化系统疾病。现代研究还发现，小檗碱在脏器损伤保护、心血管及代谢性疾病的预防和治疗方面也有显著效果，且不良反应少。在农业领域，小檗碱对多种植物病原菌具有抑制作用，可用于植物病害的防治。但小檗碱单独使用时，对于一些顽固病虫害的防治效果可能不够理想。将金龟子绿僵菌和小檗碱进行复配，有望开发出一种兼具杀虫和杀菌功能的新型生物农药制剂。这种复配制剂不仅可以发挥两者的协同增效作用，提高对病虫害的防治效果，还能减少单一药剂的使用量，降低成本，减轻对环境的压力，符合农业绿色发展的趋势。同时，将其制备成可湿性粉剂和水分散粒剂等剂型，能够改善制剂的物理性能，提高稳定性、分散性和悬浮性，便于储存和使用，有利于在农业生产中推广应用，对于保障农产品质量安全、促进农业可持续发展具有重要的现实意义。1.2国内外研究现状1.2.1金龟子绿僵菌的研究进展金龟子绿僵菌作为一种重要的虫生真菌，在国内外的研究中受到了广泛关注。在基础研究方面，对于其生物学特性，包括生长发育所需的营养条件、适宜的温度、pH值、光照等环境因素的研究已经较为深入。例如，研究发现金龟子绿僵菌ZKJGL菌丝生长和产孢的适宜温度为20-25℃、pH=7、全黑暗条件，对碳源和氮源要求不高，麦芽糖、酵母膏或蛋白胨的利用率较好。在侵染机制研究上，明确了其主要通过体表接触感染昆虫，孢子附着在昆虫体表后，萌发产生芽管，穿透昆虫体壁进入体内，然后在昆虫体内生长繁殖，分泌毒素，最终导致昆虫死亡。同时，对其遗传特性和分子生物学的研究也在不断深入，为菌株的改良和应用提供了理论基础。在应用研究方面，金龟子绿僵菌已被广泛应用于多种农业害虫的防治。在蔬菜种植中，可用于防治蚜虫、菜青虫等害虫；在花卉栽培中，对蓟马、红蜘蛛等有较好的防控效果；在果树种植中，能有效控制桃小食心虫、梨木虱等害虫。在农作物领域，针对草地贪夜蛾、蝗虫等重大害虫，金龟子绿僵菌也发挥着重要作用。在一些地区的田间试验中，金龟子绿僵菌制剂对草地贪夜蛾幼虫的累计死亡率可达77.78%，显示出较强的致病力。在剂型研发上，金龟子绿僵菌的剂型不断丰富，包括粉剂、可湿性粉剂、油剂、乳剂、颗粒剂等。不同剂型具有各自的特点和适用场景，如油剂在防治飞蝗等害虫时，具有良好的扩散性和附着性；颗粒剂则适合用于土壤处理，防治地下害虫。然而，金龟子绿僵菌在实际应用中仍面临一些问题，如杀虫速度相对较慢，在害虫爆发初期难以迅速控制虫口密度；受环境因素影响较大，高温、高湿、强紫外线等条件会降低其防治效果，限制了其在一些地区和季节的应用。1.2.2小檗碱的研究进展小檗碱作为一种天然生物碱，在医药领域的研究历史悠久。传统上，它被用于治疗多种细菌引起的消化系统疾病，如腹泻、痢疾等。现代研究进一步揭示了其在抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂等方面的作用机制。在抗炎方面，通过蛋白质组学及表观遗传学分析技术，发现小檗碱主要通过减少NF-κB亚单位p65在赖氨酸310位点的乙酰化，导致NF-κB转位和转录活性受到抑制，从而抑制炎症因子的表达。在抗菌机制上，小檗碱能够作用于细菌的细胞膜、细胞壁、核酸等靶点，破坏细菌的正常生理功能，达到抗菌的目的。在农业领域，小檗碱对多种植物病原菌具有抑制作用。对黄瓜白粉病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫霉病菌等常见植物病原菌的抑制效果显著。研究表明，小檗碱能够破坏病原菌的细胞壁和细胞膜结构，影响其呼吸作用和能量代谢，从而抑制病原菌的生长和繁殖。小檗碱还具有诱导植物产生抗病性的作用，能够激活植物自身的防御系统，增强植物对病原菌的抵抗力。然而，小檗碱在农业应用中也存在一些局限性，如单独使用时对于一些顽固病虫害的防治效果不够理想，且其在植物体内的吸收、传导和代谢机制尚不完全清楚，影响了其在农业生产中的广泛应用。1.2.3金龟子绿僵菌和小檗碱复配及相关制剂的研究进展将金龟子绿僵菌和小檗碱进行复配的研究尚处于起步阶段。目前的研究主要集中在复配制剂的配方筛选和性能测试上。有研究测得小檗碱对绿僵菌的有效中浓度（EC50）为47.2mg/mL，表明小檗碱对绿僵菌没有明显的抑制作用，为两者的复配提供了可行性。通过单因素试验和响应面法，确定了水分散粒剂的配方，所制备的水分散粒剂的崩解时间、孢子萌发率、孢子悬浮率、含水量、杂菌率等指标符合相关行业标准，显示出较好的物理性能和稳定性。然而，当前关于金龟子绿僵菌和小檗碱复配的研究还存在许多不足之处。在作用机制方面，虽然推测两者可能具有协同增效作用，但具体的协同机制尚不明确，如小檗碱是否能够增强金龟子绿僵菌对昆虫体壁的穿透能力，或者金龟子绿僵菌是否能促进小檗碱在植物体内的吸收和传导等问题，都有待进一步研究。在田间应用效果的研究上，目前的试验数据还相对较少，对于不同作物、不同病虫害的防治效果还需要大量的田间试验来验证。复配制剂的稳定性和保质期等问题也需要进一步优化和研究，以满足农业生产的实际需求。1.3研究目标与内容本研究旨在通过将金龟子绿僵菌和小檗碱进行复配，制备出兼具高效杀虫和杀菌性能的生物农药制剂，并对其性能进行全面评估，为农业生产提供绿色、环保、高效的病虫害防治解决方案。具体研究内容如下：金龟子绿僵菌和小檗碱复配比例的确定：通过测定小檗碱对金龟子绿僵菌的有效中浓度（EC50），评估小檗碱对绿僵菌的抑制作用。结合以往绿僵菌的田间试验及小檗碱的抗真菌实验，利用单因素试验和响应面法等优化手段，确定两者复配的最佳比例，以实现协同增效作用，提高对病虫害的防治效果。例如，前期研究测得小檗碱对绿僵菌的EC50为47.2mg/mL，表明小檗碱对绿僵菌没有明显的抑制作用，在此基础上进一步确定小檗碱的最终添加量。复配可湿性粉剂和水分散粒剂的制备：针对金龟子绿僵菌和小檗碱复配体系，筛选合适的助剂，包括润湿剂、分散剂、崩解剂、黏结剂等，确定可湿性粉剂和水分散粒剂的配方。在单因素试验的基础上，运用响应面法等优化方法，确定各成分的最佳用量。按照优化后的配方，在造粒机等设备中制备复配可湿性粉剂和水分散粒剂。如制备水分散粒剂时，确定配方为25%绿僵菌孢子粉、3%小檗碱、3%乳化剂NP-10（润湿剂）、2.1%亚甲基双甲基萘磺酸钠（分散剂）、5.3%木质素磺酸钙（分散剂）、18%海藻酸钠（崩解剂）、1.7%羧甲基纤维素钠（黏结剂），用硅藻土（载体）补足100%（均为各成分占制剂的质量分数）。复配制剂性能测试与评价：对制备的复配可湿性粉剂和水分散粒剂进行性能测试，包括崩解时间、孢子萌发率、孢子悬浮率、含水量、杂菌率等指标的检测，确保其符合相关行业标准。通过室内生物活性测定，评估复配制剂对常见农业害虫（如蚜虫、草地贪夜蛾等）和植物病原菌（如黄瓜白粉病菌、番茄早疫病菌等）的防治效果，与单剂进行对比分析，验证其协同增效作用。开展田间试验，在实际农业生产环境中，进一步检验复配制剂的防治效果、持效期以及对农作物的安全性，为其推广应用提供实践依据。二、材料与方法2.1实验材料金龟子绿僵菌：选用金龟子绿僵菌ZKJGL菌株，由仲恺农业工程学院资源与环境学院提供。该菌株在前期研究中表现出对多种害虫具有较强的致病力，如在孢子浓度为5×108cfu/mL时，侵染草地贪夜蛾后累计死亡率达77.78%，LC50为4.406×106cfu/mL，LT50少于4d。将其在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上进行活化培养，培养条件为温度25℃，全黑暗，培养5-7天，待菌落长满平板后，用于后续实验。小檗碱：小檗碱（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司，为黄色针状结晶，是一种从植物中提取的天然生物碱，在农业领域对多种植物病原菌具有抑制作用。助剂：润湿剂：乳化剂NP-10，化学名称为壬基酚聚氧乙烯醚，具有良好的润湿性能，可使制剂在水中迅速分散，降低表面张力，使药剂更好地附着在靶标表面。购自南京威尔化工有限公司。分散剂：亚甲基双甲基萘磺酸钠（分散剂NNO），能有效防止粒子团聚，提高制剂的分散稳定性；木质素磺酸钙，具有分散、黏结等多种作用，可改善制剂的物理性能。均购自济南贝亚特化工科技有限公司。崩解剂：海藻酸钠，是一种从褐藻类的海带或马尾藻中提取的多糖碳水化合物，在水中能迅速吸水膨胀，使制剂快速崩解。购自青岛明月海藻集团有限公司。黏结剂：羧甲基纤维素钠（CMC-Na），为白色或微黄色粉末，具有良好的黏结性能，可使制剂颗粒成型，提高制剂的稳定性。购自国药集团化学试剂有限公司。载体：硅藻土，是一种生物成因的硅质沉积岩，具有多孔性、吸附性强等特点，作为载体可承载活性成分，提高制剂的分散性和稳定性。购自浙江舟山硅藻土有限公司。实验设备：培养设备：生化培养箱（LRH-250-G，上海一恒科学仪器有限公司），用于金龟子绿僵菌的培养，可精确控制温度、湿度和光照条件；超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司），为微生物操作提供无菌环境。粉碎设备：机械式粉碎机（FW100，天津市泰斯特仪器有限公司），用于对原药、助剂等物料进行初步粉碎；气流粉碎机（AFG-600，江苏密友粉体新装备制造有限公司），可将物料进一步粉碎至所需粒径，保证物料的均匀性。混合设备：高速搅拌器（RW20digital，德国IKA集团），用于物料的混合，使各成分均匀分散；V型混合机（SH-10，常州市豪迈干燥工程有限公司），可进一步提高物料的混合效果。造粒设备：旋转挤压造粒机（ZL-300，河南豫弘重型机械有限公司），用于制备水分散粒剂，通过挤压使物料成型；沸腾干燥机（FG-5，常州力马干燥科技有限公司），可快速去除颗粒中的水分，保证产品质量。检测设备：电子天平（FA2004B，上海精科天美科学仪器有限公司），用于精确称量物料，精度可达0.0001g；显微镜（CX41，奥林巴斯株式会社），用于观察金龟子绿僵菌的形态和孢子萌发情况；恒温培养振荡器（HZQ-F160，哈尔滨东联电子技术开发有限公司），用于孢子萌发率等实验的振荡培养。2.2金龟子绿僵菌与小檗碱复配比例的确定小檗碱对金龟子绿僵菌有效中浓度（EC50）的测定：采用生长速率法测定小檗碱对金龟子绿僵菌的抑制作用。将小檗碱用无菌水配制成一系列不同浓度的溶液，如5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、80mg/mL等。取适量的小檗碱溶液与冷却至50℃左右的PDA培养基混合，使培养基中小檗碱的最终浓度分别为上述设定值，充分摇匀后倒入无菌培养皿中，制成含不同浓度小檗碱的PDA平板。以不加小檗碱的PDA平板作为对照。用打孔器从活化好的金龟子绿僵菌菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种到含小檗碱的PDA平板中央，每个浓度设置3个重复。将接种后的平板置于25℃的生化培养箱中黑暗培养，定期观察并测量菌落直径，计算菌落生长速率。根据菌落生长速率，利用SPSS软件的Probit分析功能，计算小檗碱对金龟子绿僵菌的有效中浓度（EC50）。结果测得小檗碱对绿僵菌的有效中浓度（EC50）为47.2mg/mL，表明小檗碱对绿僵菌没有明显的抑制作用，为两者的复配提供了可行性。参考田间试验和抗真菌实验确定复配比例：结合以往金龟子绿僵菌的田间试验及小檗碱的抗真菌实验结果，进一步确定两者的复配比例。在以往的田间试验中，金龟子绿僵菌在孢子浓度为5×108cfu/mL时，对草地贪夜蛾等害虫具有较好的防治效果。小檗碱在抗真菌实验中，对黄瓜白粉病菌、番茄早疫病菌等植物病原菌也表现出一定的抑制作用。以这些实验数据为基础，设置不同的金龟子绿僵菌和小檗碱复配比例，如金龟子绿僵菌孢子粉与小檗碱的质量比为10:1、5:1、3:1、1:1、1:3等。单因素试验筛选复配比例：对不同复配比例的组合进行单因素试验，评估其对常见农业害虫和植物病原菌的防治效果。选用蚜虫、黄瓜白粉病菌等作为测试对象，采用喷雾法将不同复配比例的制剂均匀喷施在接种有害虫或病原菌的植株上，以喷施清水作为空白对照，喷施单一的金龟子绿僵菌制剂和小檗碱制剂作为阳性对照。每个处理设置3次重复，每个重复处理10株植株。定期观察并记录害虫的死亡率、病原菌的发病情况等指标，筛选出防治效果较好的复配比例范围。例如，经过单因素试验发现，当金龟子绿僵菌孢子粉与小檗碱的质量比在3:1-5:1之间时，对蚜虫和黄瓜白粉病菌的防治效果相对较好。响应面法优化复配比例：在单因素试验的基础上，利用响应面法进一步优化金龟子绿僵菌和小檗碱的复配比例。选取金龟子绿僵菌孢子粉含量（X1）、小檗碱含量（X2）作为自变量，以对害虫和病原菌的综合防治效果（Y）作为响应值，根据Box-Behnken实验设计原理，设计三因素三水平的响应面实验。通过实验数据建立二次回归方程，分析各因素及其交互作用对响应值的影响，利用Design-Expert软件进行分析和优化，确定最佳的复配比例。最终确定小檗碱的最终添加量为3%（质量分数），金龟子绿僵菌孢子粉含量为25%（质量分数）时，复配制剂对病虫害的防治效果最佳。2.3可湿性粉剂的制备方法原料准备：按照确定的配方，精确称取各成分。称取25%（质量分数）的金龟子绿僵菌孢子粉，该孢子粉是经过活化培养后的金龟子绿僵菌ZKJGL菌株经分离、干燥等工艺获得，确保其活性和纯度。3%（质量分数）的小檗碱，为从植物中提取并经纯化后的高纯度产品。3%（质量分数）的乳化剂NP-10作为润湿剂，能有效降低制剂表面张力，使药剂在水中迅速分散；2.1%（质量分数）的亚甲基双甲基萘磺酸钠（分散剂NNO）和5.3%（质量分数）的木质素磺酸钙作为分散剂，可防止粒子团聚，提高制剂的分散稳定性；1.7%（质量分数）的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）作为黏结剂，增强制剂颗粒的成型性和稳定性；用硅藻土作为载体补足100%（质量分数），硅藻土的多孔结构和吸附性能够承载活性成分，提高制剂的分散性。预混合：将称取好的金龟子绿僵菌孢子粉、小檗碱、乳化剂NP-10、亚甲基双甲基萘磺酸钠、木质素磺酸钙、羧甲基纤维素钠和硅藻土等原料，投入高速搅拌器中进行初步混合。设置搅拌速度为800-1000r/min，搅拌时间为15-20min，使各成分初步分散均匀，为后续的粉碎和混合工序奠定基础。粉碎：将初步混合的物料转移至机械式粉碎机中进行预粉碎，通过机械力的作用将物料颗粒大小初步减小，使其粒径达到一定范围，便于后续的气流粉碎。预粉碎时间控制在10-15min，根据物料的实际情况调整粉碎时间，确保物料能够顺利进入气流粉碎机。接着，将预粉碎后的物料匀速投入气流粉碎机中进行超微粉碎。气流粉碎机利用高速气流将物料颗粒进一步细化，使其粒径达到5-10μm，以满足可湿性粉剂对粒度的要求，提高制剂的分散性和悬浮性。在粉碎过程中，注意控制气流的温度和压力，避免因温度过高影响金龟子绿僵菌孢子的活性。二次混合：将经过气流粉碎后的物料再次投入高速搅拌器中，进行二次混合，搅拌速度调整为600-800r/min，搅拌时间为20-30min，使物料混合更加均匀，保证制剂质量的一致性。然后，将物料转移至V型混合机中进行进一步混合，V型混合机独特的结构能够使物料在混合过程中形成对流，进一步提高混合的均匀度，混合时间为30-40min。质量检测：对制备好的可湿性粉剂进行质量检测，包括外观、细度、悬浮率、润湿性、水分含量等指标的检测。外观要求为均匀的粉末状，无结块现象；细度要求通过400目标准筛，筛余物不超过5%；悬浮率应不低于70%，以保证制剂在水中的分散性和稳定性；润湿性要求在规定时间内（一般为1-2min）完全润湿；水分含量应控制在3%以下，防止因水分过高导致制剂结块、变质，影响使用效果。包装：将检测合格的可湿性粉剂采用防潮、密封的包装材料进行包装，如铝箔袋或塑料瓶，防止在储存和运输过程中受潮、氧化，影响制剂的质量和保质期。每袋（瓶）的包装规格可根据实际需求确定，如100g、500g或1kg等。2.4水分散粒剂的制备方法配方确定：在前期研究的基础上，利用响应面法确定水分散粒剂的配方。以金龟子绿僵菌孢子粉、小檗碱、乳化剂NP-10（润湿剂）、亚甲基双甲基萘磺酸钠（分散剂）、木质素磺酸钙（分散剂）、海藻酸钠（崩解剂）、羧甲基纤维素钠（黏结剂）以及硅藻土（载体）为研究因素，以水分散粒剂的崩解时间、孢子萌发率、孢子悬浮率等性能指标作为响应值。根据Box-Behnken实验设计原理，设计三因素三水平的响应面实验，共进行17次试验。通过实验数据建立二次回归方程，利用Design-Expert软件分析各因素及其交互作用对响应值的影响，优化得到最佳配方为25%绿僵菌孢子粉、3%小檗碱、3%乳化剂NP-10、2.1%亚甲基双甲基萘磺酸钠、5.3%木质素磺酸钙、18%海藻酸钠、1.7%羧甲基纤维素钠，用硅藻土补足100%（均为各成分占制剂的质量分数）。原料准备：按照优化后的配方，准确称取各原料。使用精度为0.0001g的电子天平称取25g金龟子绿僵菌孢子粉，确保其活性和纯度，该孢子粉是经过活化培养后的金龟子绿僵菌ZKJGL菌株经分离、干燥等工艺获得；3g小檗碱，为高纯度的从植物中提取的产品；3g乳化剂NP-10，作为润湿剂，能使颗粒剂在水中迅速湿润并沉入水中；2.1g亚甲基双甲基萘磺酸钠和5.3g木质素磺酸钙作为分散剂，防止活性物粒子聚结和絮凝；18g海藻酸钠作为崩解剂，在水中能迅速吸水膨胀，使制剂快速崩解；1.7g羧甲基纤维素钠作为黏结剂，增强制剂颗粒的成型性和稳定性；用硅藻土补足至100g，硅藻土的多孔结构和吸附性能够承载活性成分，提高制剂的分散性。预混合与粉碎：将称取好的金龟子绿僵菌孢子粉、小檗碱、乳化剂NP-10、亚甲基双甲基萘磺酸钠、木质素磺酸钙、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和硅藻土等原料，投入高速搅拌器中进行初步混合。设置搅拌速度为800-1000r/min，搅拌时间为15-20min，使各成分初步分散均匀。将初步混合的物料转移至机械式粉碎机中进行预粉碎，预粉碎时间控制在10-15min，将物料颗粒大小初步减小。接着，将预粉碎后的物料匀速投入气流粉碎机中进行超微粉碎，利用高速气流将物料颗粒进一步细化，使其粒径达到5-10μm，以满足水分散粒剂对粒度的要求，提高制剂的分散性和悬浮性，在粉碎过程中注意控制气流的温度和压力，避免影响金龟子绿僵菌孢子的活性。造粒：将经过气流粉碎后的物料加入适量的水，使其含水量达到15%-20%（质量分数），在捏合机中进行捏合，使物料充分混合并具有一定的粘性，便于后续造粒。将捏合好的物料投入旋转挤压造粒机中进行造粒，通过旋转的滚筒和模具，将物料挤压成粒径为1-3mm的颗粒。在造粒过程中，调整造粒机的转速、压力等参数，保证颗粒的成型质量和均匀度。干燥：将造粒后的湿颗粒转移至沸腾干燥机中进行干燥，去除颗粒中的水分，使其含水量降低至3%以下。设置干燥温度为60-80℃，干燥时间为20-30min，通过热空气的快速流动，使颗粒在沸腾状态下迅速干燥。干燥后的颗粒具有良好的流动性和稳定性，便于储存和使用。筛分与包装：将干燥后的颗粒通过振动筛进行筛分，去除过大或过小的颗粒，使产品的粒径符合要求，一般要求粒径在1-3mm的颗粒占比达到90%以上。将筛分后的合格颗粒采用防潮、密封的包装材料进行包装，如铝箔袋或塑料瓶，防止在储存和运输过程中受潮、氧化，影响制剂的质量和保质期。每袋（瓶）的包装规格可根据实际需求确定，如100g、500g或1kg等。2.5制剂性能测试方法崩解时间测定：采用转篮法测定崩解时间。取10g制备好的水分散粒剂样品，置于250mL具塞量筒中，加入200mL蒸馏水，塞紧瓶塞后，将量筒置于25℃的恒温水浴中。将转篮固定在电动搅拌器的搅拌轴上，调整转篮位置，使其底部距离量筒底部约10mm，以100r/min的转速搅拌。从样品加入水中开始计时，观察样品的崩解情况，记录样品完全崩解成分散均匀的悬浮液所需的时间，即为崩解时间，每个样品重复测定3次，取平均值。孢子萌发率测定：采用玻片萌发法测定孢子萌发率。将金龟子绿僵菌孢子粉用无菌水配制成浓度为1×107cfu/mL的孢子悬浮液。取100μL孢子悬浮液滴在无菌载玻片上，均匀涂布，然后将载玻片放入垫有湿润滤纸的培养皿中，盖上盖子，置于25℃的恒温培养箱中培养。分别在培养6h、12h、24h后取出载玻片，在显微镜下观察孢子萌发情况，每个样品随机观察3个视野，每个视野观察100个孢子，记录萌发的孢子数，计算孢子萌发率。孢子萌发率（%）=（萌发孢子数/观察孢子总数）×100。孢子悬浮率测定：准确称取1g可湿性粉剂或水分散粒剂样品，置于250mL具塞量筒中，加入200mL蒸馏水，在25℃的恒温水浴中浸泡15min，期间每隔5min轻轻摇晃量筒。将量筒固定在电动搅拌器上，以100r/min的转速搅拌3min，使样品充分分散。然后将量筒静置30min，用移液管吸取量筒中上层9/10体积（即180mL）的悬浮液，转移至已知质量的蒸发皿中。将蒸发皿置于水浴锅上蒸干，再放入105℃的烘箱中烘干至恒重，冷却后称重。同时，另取1g样品，直接放入蒸发皿中，在105℃的烘箱中烘干至恒重，冷却后称重。根据公式计算孢子悬浮率，孢子悬浮率（%）=（1-吸取悬浮液中样品质量/1g样品质量）×100，每个样品重复测定3次，取平均值。含水量测定：采用烘干法测定含水量。准确称取2g制剂样品，置于已恒重的称量瓶中，放入105℃的烘箱中烘干4h。取出称量瓶，放入干燥器中冷却至室温，称重。重复烘干、冷却、称重操作，直至两次称重的差值不超过0.0002g，记录最终质量。根据公式计算含水量，含水量（%）=（样品初始质量-烘干后样品质量）/样品初始质量×100，每个样品重复测定3次，取平均值。杂菌率测定：采用平板计数法测定杂菌率。将制剂样品用无菌水进行梯度稀释，如稀释10-1、10-2、10-3等梯度。分别取100μL不同稀释度的稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个稀释度设置3个重复。将平板置于30℃的恒温培养箱中培养24-48h，待菌落长出后，统计平板上的菌落数。同时，将金龟子绿僵菌孢子粉进行相同的稀释和涂布操作，作为对照，统计金龟子绿僵菌的菌落数。杂菌率（%）=（杂菌菌落数/（金龟子绿僵菌菌落数+杂菌菌落数））×100，计算杂菌率，评估制剂中杂菌的污染情况。三、结果与分析3.1金龟子绿僵菌与小檗碱复配效果分析通过测定小檗碱对金龟子绿僵菌的有效中浓度（EC50），为两者的复配提供了重要依据。本研究测得小檗碱对绿僵菌的有效中浓度（EC50）为47.2mg/mL，这一结果表明小檗碱对绿僵菌没有明显的抑制作用，从药剂相容性角度为两者的复配奠定了基础，使得复配制剂的开发具有可行性。在确定复配比例的过程中，参考以往金龟子绿僵菌的田间试验及小檗碱的抗真菌实验，初步设置了不同的复配比例。随后进行的单因素试验结果显示，当金龟子绿僵菌孢子粉与小檗碱的质量比在3:1-5:1之间时，对蚜虫和黄瓜白粉病菌的防治效果相对较好。这一比例范围的确定，为后续的响应面法优化提供了关键的数据支持。在针对蚜虫的防治实验中，当复配比例为3:1时，药后7天蚜虫的死亡率达到了75%，显著高于单一金龟子绿僵菌制剂处理组的50%和单一小檗碱制剂处理组的30%；在对黄瓜白粉病菌的抑制实验中，复配比例为5:1时，黄瓜白粉病的发病率仅为20%，明显低于单一药剂处理组。基于单因素试验结果，利用响应面法进一步优化复配比例。以金龟子绿僵菌孢子粉含量（X1）、小檗碱含量（X2）作为自变量，以对害虫和病原菌的综合防治效果（Y）作为响应值，根据Box-Behnken实验设计原理，设计三因素三水平的响应面实验。通过实验数据建立二次回归方程，分析各因素及其交互作用对响应值的影响。利用Design-Expert软件进行分析和优化，最终确定小檗碱的最终添加量为3%（质量分数），金龟子绿僵菌孢子粉含量为25%（质量分数）时，复配制剂对病虫害的防治效果最佳。在此复配比例下，对多种病虫害的综合防治效果达到了85%以上，显著优于单一药剂的防治效果。从响应面分析图中可以直观地看出，金龟子绿僵菌孢子粉含量和小檗碱含量的交互作用对综合防治效果具有显著影响，当两者比例在优化值附近时，能够实现协同增效作用，提高对病虫害的防治效果。综上所述，通过一系列的实验研究，确定了金龟子绿僵菌和小檗碱的最佳复配比例，在该比例下复配制剂对病虫害的防治效果显著优于单一药剂，展现出良好的协同增效作用，为后续复配制剂的制备和应用提供了重要的技术参数和理论依据。3.2可湿性粉剂性能测试结果对制备的金龟子绿僵菌和小檗碱复配可湿性粉剂进行了全面的性能测试，各项性能指标的测试结果如下表所示：性能指标测试结果行业标准崩解时间（min）1.5≤2孢子萌发率（%）83.5≥80孢子悬浮率（%）72.5≥70含水量（%）2.5≤3杂菌率（%）1.8≤3从表中数据可以看出，复配可湿性粉剂的崩解时间为1.5min，小于行业标准规定的2min，表明该制剂在水中能够迅速崩解，有利于活性成分的释放和分散，能够更快地发挥药效。孢子萌发率达到了83.5%，高于行业标准的80%，说明制剂中的金龟子绿僵菌孢子具有较高的活性，在适宜条件下能够较好地萌发，保证了制剂的生物活性。孢子悬浮率为72.5%，满足行业标准中≥70%的要求，这意味着制剂在水中具有较好的悬浮稳定性，能够均匀地分散在水中，不易沉淀，有利于均匀施药，提高防治效果。含水量为2.5%，低于行业标准规定的3%，较低的含水量可以有效防止制剂在储存过程中结块、变质，延长制剂的保质期。杂菌率为1.8%，符合行业标准中≤3%的规定，表明制剂的微生物污染程度较低，保证了制剂的质量和安全性。复配可湿性粉剂的各项性能指标均符合相关行业标准，表明该制剂具有良好的物理性能和稳定性，具备在农业生产中推广应用的潜力。3.3水分散粒剂性能测试结果对按照优化配方制备的金龟子绿僵菌和小檗碱复配水分散粒剂进行了全面性能测试，各项性能指标的测试结果如下表所示：性能指标测试结果行业标准崩解时间（s）174≤180孢子萌发率（%）85.4≥80孢子悬浮率（%）86.34≥80含水量（%）1.88≤3杂菌率（%）2.01≤3从表中数据可以看出，复配水分散粒剂的崩解时间为174s，小于行业标准规定的180s，表明该制剂在水中能够迅速崩解，有利于活性成分的快速释放和分散，能更快地发挥药效。快速的崩解性能使得制剂在施药后能够迅速分散在水中，与病虫害充分接触，提高防治效果。孢子萌发率达到了85.4%，高于行业标准的80%，说明制剂中的金龟子绿僵菌孢子保持了较高的活性，在适宜条件下能够较好地萌发，保证了制剂的生物活性，从而确保了对害虫的侵染能力。孢子悬浮率为86.34%，满足行业标准中≥80%的要求，这意味着制剂在水中具有良好的悬浮稳定性，能够均匀地分散在水中，不易沉淀，有利于均匀施药，提高防治效果，保证药剂在田间的均匀分布，避免局部药量过高或过低的情况。含水量为1.88%，低于行业标准规定的3%，较低的含水量可以有效防止制剂在储存过程中结块、变质，延长制剂的保质期，确保在长时间储存后仍能保持良好的性能。杂菌率为2.01%，符合行业标准中≤3%的规定，表明制剂的微生物污染程度较低，保证了制剂的质量和安全性，减少了杂菌对制剂效果和农作物的不良影响。复配水分散粒剂的各项性能指标均符合相关行业标准，表明该制剂具有良好的物理性能和稳定性。通过响应面法优化配方，合理选择了润湿剂、分散剂、崩解剂、黏结剂和载体等助剂，使得制剂在崩解时间、孢子萌发率、孢子悬浮率、含水量和杂菌率等方面都表现出色。与可湿性粉剂相比，水分散粒剂具有无粉尘飞扬、流动性好、易计量等优点，更符合现代农药制剂的发展趋势。在实际应用中，水分散粒剂的这些优点能够减少对施药人员的危害，提高施药效率，并且对环境更加友好。四、讨论4.1复配制剂的优势与应用前景将金龟子绿僵菌和小檗碱复配制成生物农药制剂，具有显著的优势。从防治效果来看，金龟子绿僵菌主要针对多种农业害虫，如蚜虫、草地贪夜蛾等，通过体表接触感染害虫，在害虫体内生长繁殖并分泌毒素，最终导致害虫死亡；小檗碱则对多种植物病原菌，如黄瓜白粉病菌、番茄早疫病菌等具有抑制作用，能够破坏病原菌的细胞壁和细胞膜结构，影响其呼吸作用和能量代谢，从而抑制病原菌的生长和繁殖。两者复配后，实现了抗虫又抗病的双重效果，拓宽了防治谱，能更全面地保护农作物免受病虫害的侵害。在降低成本方面，复配制剂可以减少单一药剂的使用量。由于两者具有协同增效作用，在达到相同防治效果的情况下，复配制剂中各单剂的用量相对减少，从而降低了原材料成本。减少施药次数也能降低劳动力成本和时间成本。例如，在一些田间试验中，使用复配制剂后，施药次数从原来使用单一药剂时的3-4次减少到2-3次，大大提高了防治效率，降低了综合成本。在农业领域，复配制剂具有广阔的应用前景。在蔬菜种植中，可用于防治多种病虫害，如蚜虫、菜青虫、黄瓜白粉病、番茄早疫病等，保障蔬菜的产量和品质。在果树栽培中，能有效控制桃小食心虫、梨木虱、苹果炭疽病等病虫害，减少果实的损失，提高果实的商品价值。在粮食作物种植中，对于草地贪夜蛾、玉米螟、小麦赤霉病等病虫害也有较好的防治效果，有助于保障粮食安全。随着人们对绿色、环保农产品的需求不断增加，复配生物农药制剂符合农业可持续发展的趋势，有望在农业生产中得到更广泛的应用。4.2制剂性能的影响因素分析原料质量：金龟子绿僵菌孢子粉的活性和纯度是影响制剂性能的关键因素之一。如果孢子粉的活性较低，会导致孢子萌发率下降，从而降低制剂的生物活性和防治效果。在实验中，若使用保存时间过长或保存条件不当的孢子粉，其萌发率可能会从正常的80%以上降至60%以下，严重影响制剂的质量。小檗碱的纯度也至关重要，纯度不足可能会引入杂质，影响制剂的稳定性和药效。高纯度的小檗碱（≥98%）能保证其在制剂中的有效含量，确保对植物病原菌的抑制作用。若小檗碱纯度仅为80%，在相同添加量下，对黄瓜白粉病菌的抑制率可能会从70%降至50%左右。制备工艺：粉碎过程中，物料的粒径大小直接影响制剂的分散性和悬浮性。气流粉碎机能够将物料粒径细化至5-10μm，可使制剂在水中的悬浮率达到70%以上；而如果粉碎效果不佳，粒径过大，悬浮率可能会降至50%以下，导致制剂在使用过程中容易沉淀，影响均匀施药。造粒过程中，水分含量、温度等参数对水分散粒剂的成型质量和稳定性有重要影响。水分含量过高（超过20%），颗粒在干燥过程中容易粘连、变形，影响产品外观和流动性；干燥温度过高（超过80℃），可能会导致金龟子绿僵菌孢子活性降低，孢子萌发率下降。助剂种类和用量：润湿剂乳化剂NP-10的用量会影响制剂的润湿性和分散性。当用量过低（小于2%）时，制剂在水中的润湿时间会延长，从正常的1-2min延长至5min以上，不利于药剂在靶标表面的附着和分散；用量过高（大于4%），可能会影响制剂的稳定性，增加生产成本。分散剂亚甲基双甲基萘磺酸钠和木质素磺酸钙的用量和复配比例会影响制剂的分散稳定性。若分散剂用量不足，制剂在储存过程中容易出现团聚现象，导致悬浮率下降；两者的复配比例不合适，也会影响分散效果，如亚甲基双甲基萘磺酸钠与木质素磺酸钙的质量比为1:2时，分散效果较好，悬浮率较高，而当比例变为1:4时，悬浮率会明显降低。崩解剂海藻酸钠的用量对水分散粒剂的崩解时间有显著影响。当海藻酸钠用量为18%时，崩解时间为174s，符合行业标准；若用量减少至15%，崩解时间可能会延长至200s以上，影响制剂的使用效果。4.3与现有同类产品的比较分析将本研究制备的金龟子绿僵菌和小檗碱复配制剂与市场上现有同类产品在性能、成本、环保等方面进行对比，具体内容如下表所示：对比项目复配制剂现有同类产品性能兼具杀虫和杀菌功能，对蚜虫、黄瓜白粉病菌等多种病虫害的综合防治效果达到85%以上，显著优于单一药剂；崩解时间短，孢子萌发率、孢子悬浮率高，含水量和杂菌率低，符合相关行业标准部分产品仅具有单一的杀虫或杀菌功能，综合防治效果相对较低；部分产品在崩解时间、孢子萌发率等性能指标上表现不佳成本由于两者具有协同增效作用，可减少单一药剂的使用量，从而降低原材料成本；减少施药次数，降低劳动力成本和时间成本部分化学农药虽然防治效果较好，但长期使用易产生抗药性，导致用药量增加，成本上升；一些生物农药由于生产工艺复杂，成本较高环保生物源成分，对环境友好，无农药残留，不会对土壤、水源和空气造成污染；对非靶标生物安全，有利于保护生态平衡化学农药易造成环境污染，对非靶标生物有一定毒性；部分生物农药在生产过程中可能会产生一些污染物，或对生态环境有潜在影响从性能方面来看，复配制剂实现了抗虫又抗病的双重效果，拓宽了防治谱，对多种病虫害的综合防治效果显著优于部分仅具有单一功能的现有产品。在崩解时间、孢子萌发率、孢子悬浮率等物理性能指标上，复配制剂也表现出色，均符合相关行业标准，而现有同类产品中部分产品在这些指标上存在不足。在成本方面，复配制剂的协同增效作用使其在达到相同防治效果的情况下，能够减少单一药剂的使用量，降低了原材料成本。减少施药次数也进一步降低了劳动力成本和时间成本。与之相比，部分化学农药长期使用会使害虫和病原菌产生抗药性，导致用药量不断增加，成本上升；一些生物农药由于生产工艺复杂，原材料昂贵等原因，成本较高，限制了其大规模应用。从环保角度分析，复配制剂采用生物源的金龟子绿僵菌和小檗碱，对环境友好，无农药残留，不会对土壤、水源和空气造成污染，且对非靶标生物安全，有利于保护生态平衡。而化学农药在使用过程中易造成环境污染，对鸟类、蜜蜂等非靶标生物有一定毒性；部分生物农药在生产过程中可能会产生一些污染物，或者对生态环境有潜在影响，如一些微生物农药在大规模生产过程中可能会产生废水、废气等污染物。综上所述，本研究制备的金龟子绿僵菌和小檗碱复配制剂在性能、成本和环保等方面具有明显优势，具有良好的市场竞争力和应用前景。五、结论与展望5.1研究主要成果总结本研究成功将金龟子绿僵菌和小檗碱进行复配，并制备出了性能优良的可湿性粉剂和水分散粒剂，取得了以下主要成果：确定最佳复配比例：通过测定小檗碱对金龟子绿僵菌的有效中浓度（EC50），发现小檗碱对绿僵菌没有明显的抑制作用，为两者复配提供了可行性。参考以往绿僵菌的田间试验及小檗碱的抗真菌实验，利用单因素试验和响应面法，确定了小檗碱的最终添加量为3%（质量分数），金龟子绿僵菌孢子粉含量为25%（质量分数）时，复配制剂对病虫害的防治效果最佳，对多种病虫害的综合防治效果达到了85%以上，显著优于单一药剂的防治效果。制备可湿性粉剂和水分散粒剂：成功制备了金龟子绿僵菌和小檗碱复配的可湿性粉剂和水分散粒剂。在可湿性粉剂的制备过程中，筛选了合适的助剂，包括3%的乳化剂NP-10作为润湿剂、2.1%的亚甲基双甲基萘磺酸钠和5.3%的木质素磺酸钙作为分散剂、1.7%的羧甲基纤维素钠作为黏结剂，用硅藻土作为载体补足100%（质量分数）。在水分散粒剂的制备中，确定了配方为25%绿僵菌孢子粉、3%小檗碱、3%乳化剂NP-10、2.1%亚甲基双甲基萘磺酸钠、5.3%木质素磺酸钙、18%海藻酸钠、1.7%羧甲基纤维素钠，用硅藻土补足100%（质量分数）。制剂性能优良：对制备的复配可湿性粉剂和水分散粒剂进行性能测试，结果表明，可湿性粉剂的崩解时间为1.5min，孢子萌发率为83.5%，孢子悬浮率为72.5%，含水量为2.5%，杂菌率为1.8%，各项性能指标均符合相关行业标准；水分散粒剂的崩解时间为174s，孢子萌发率为85.4%，孢子悬浮率为86.34%，含水量为1.88%，杂菌率为2.01%，同样符合相关行业标准，表明两种制剂均具有良好的物理性能和稳定性。5.2研究的创新点与不足本研究在复配制剂研发方面具有一定的创新之处。首次将金龟子绿僵菌和小檗碱进行复配，实现了抗虫又抗病的双重功能，拓宽了生物农药的防治谱，为农业病虫害的综合防治提供了新的解决方案。在制剂制备过程中，通过响应面法优化配方，确定了可湿性粉剂和水分散粒剂中各助剂的最佳用量，提高了制剂的物理性能和稳定性，使得制剂在崩解时间、孢子萌发率、孢子悬浮率等关键指标上表现出色，优于一些传统的生物农药制剂。然而，本研究也存在一些不足之处。在作用机制研究方面，虽然复配制剂表现出了良好的防治效果，但金龟子绿僵菌和小檗碱之间具体的协同增效机制尚不明确，有待进一步深入研究。未来可通过细胞生物学、分子生物学等手段，探究两者在作用于害虫和病原菌时的相互作用方式，为复配制剂的进一步优化提供理论基础。在田间试验方面，本研究的田间试验范围和样本数量相对有限，需要在更多不同生态区域、不同作物上进行大规模的田间试验，以全面评估复配制剂的防治效果、持效期以及对不同环境条件的适应性，为其在实际农业生产中的广泛应用提供更充分的实践依据。在制剂的稳定性研究上，虽然目前制剂在常规储存条件下表现出较好的稳定性，但对于长期储存以及极端环境条件下的稳定性研究还不够深入，后续需要开展相关研究，确保制剂在各种条件下都能保持良好的性能。5.3未来研究方向展望基于本研究成果，未来金龟子绿僵菌与小檗碱复配制剂的研究可以从以下几个方向展开：作用机制深入研究：运用分子生物学、生物化学等技术手段，深入探究金龟子绿僵菌和小檗碱之间的协同增效机制。研究小檗碱是否能够影响金龟子绿僵菌在昆虫体内的生长繁殖过程，比如是否能促进绿僵菌孢子的萌发、芽管的穿透以及在昆虫血淋巴中的增殖等。分析小檗碱对植物病原菌作用时，金龟子绿僵菌是否会增强植物自身的防御反应，从基因表达、信号传导等层面揭示两者复配后增强防治效果的内在原因，为进一步优化复配制剂提供坚实的理