DB46T 220-2012 槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范

ICS65.020备案号：33827-2012DB46DB46/T220—2012槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范TechnicalspecificationforPCRdetectionofarecanutyellowleafphytoplasmaofseedling海南省质量技术监督局发布IDB46/T220—2012本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由海南省质量技术监督局提出。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。本标准首次发布于2012年4月。DB46/T220—20121槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范本标准规定了槟榔苗黄化病植原体的检测技术规范。本标准适用于槟榔苗中槟榔黄化病植原体的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1指荧光信号有统计意义显著增长（即穿过阈值线）时的循环次数。3.2槟榔苗用成熟种果育成的实生苗，育苗时间在两年以内的苗。4原理以染色体DNA为基础的分子生物学技术已用来检测和鉴定植原体。根据16SrRNA基因保守序列设计通用引物，应用巢式PCR（nested–PCR）技术检测。根据16SrRNA基因序列设计翠菊黄化组（16SrⅠ组）植原体特异性引物/探针组合，进行实时荧光PCR的检测。5仪器设备台式高速冷冻离心机（最高转速在12000rpm以上）、全自动数码凝胶图像分析系统、PCR仪、全自动荧光定量PCR系统、全自动灭菌器、电子分析天平（万分之一）、旋涡混合器、水平电泳装置，微量可调移液器（0.1-1000μL)。6试剂和缓冲液配制DB46/T220—20122用于巢式PCR和实时荧光PCR检测的试剂和缓冲液配制，参见附录A。7检测方法7.1槟榔心叶总DNA提取称取抽样的槟榔植株刚抽出的心叶0.5g，加入适量液氮研磨呈粉状，再加入1mLDNA提取缓冲液充分研磨，然后加入80µL10%十二烷基肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1~2h，4℃6000rpm离心10min，取上清液；加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻轻混匀，-20℃保持至少30min，4℃8000rpm离心15min，弃上清；加入600µLTE缓冲液、30µL10%十二烷基硫酸钠和12µL蛋白酶K（5mg/ml），轻轻彻底悬浮沉淀，37℃温育30-60min；加100µL5MNaCl混匀，再加入84µLCTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10min；加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，4℃6000rpm离心5min，重复直至无中间白色层；取上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，4℃6000rpm离心5min；取上清液，加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃保持至少30min，4℃12000rpm离心10min，弃上清液；加入500µL70%乙醇洗涤，4℃12000rpm离心10min，洗涤两次；取沉淀，加入50µLTE混匀溶解。加入5μLRNaseA(10μg/μl)，37℃30min,除去RNA。7.2巢式PCR检测下述反应均需同时设植原体16SrDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对照，设灭菌双蒸水作为空白对照。7.2.1引物序列引物采用植原体16SrDNA通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列见表1。表1巢式PCR检测的引物序列引物序列5’-3’7.2.2PCR反应PCR反应体系见表2。PCR反应条件为：94℃,预变性2min；94℃变性1min；45℃退火45s，72℃延伸1min；共进行30个循环，最后72℃延伸10min。以R16mF2/R16mR1作为第一引物对，R16F2n/R16R2作为第二引物对，进行巢式PCR(nested-PCR)扩增，直接PCR以7.1中提取的总DNA为模板，巢式PCR以直接PCR产物稀释50倍后的样品为模板。PCR反应体系和反应条件与直接PCR扩增相同。表2巢式PCR反应体系加样量(μL）3表2（续）加样量(μL）取5µLPCR产物在1％琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）中电泳。利用MarkerDL2000作为分子量标准，在120V电场强度下电泳约20min，最后用全自动数码凝胶图像分析系统照相。7.2.3PCR产物序列RFLP图谱分析将第二轮PCR产物进行序列测定，序列结果利用植原体分类鉴定的在线专用数据库-iPhyClassifier（http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgibin/resource/iphyclassifier.cgi）进行RFLP图谱分析。7.2.4结果判定巢式PCR检测结果判定见表3。表3巢式PCR检测结果判定简表否否是是是否否是是否体否否是否-否否否--否是---是----7.3实时荧光PCR检测下述反应均需同时设植原体16SrDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对照，设灭菌双蒸水作为为空白对照。7.3.1槟榔黄化病植原体引物/探针引物和探针序列见表4。4表4实时荧光PCR检测用引物/探针序列引物/探针序列5’-3’7.3.2实时荧光PCR反应体系、反应条件实时荧光PCR反应体系见表5。表5实时荧光PCR的反应体系TaqManUniversalRCRMaste7.3.3实时荧光PCR检测结果的判定实时荧光PCR检测结果的判定见表6。表6实时荧光PCR检测结果的判定简表检测样品的Ct值否否是是是否否是是否否否是否-否否否--否是---是----DB46/T220—20125（规范性附录）巢式PCR和实时荧光PCR检测试剂和缓冲液配制除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂。实验室用水均为去离子水，按GB/T6682-2008的有关规定。A.1化学试剂十六烷基三甲基溴化铵、三羟基氨基甲烷、十二烷基肌氨酸钠、二水乙二胺四乙酸二钠、苯酚、氯仿、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭。A.2分子生物学试剂TaqDNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP液（2.5mmol/LdATP,dTTP,dCTP,dGTP)、TaqMan○UniversalRCRMasterMix、DNA分子量标记。A.3缓冲液称量121.1gTris置于1L烧杯中，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，用盐酸调节PH值至8.0，将溶液定容至1L,高温高压灭菌后，室温保存。A.3.20.5MEDTA称取186.1gNa2•EDTA•2H2O，置于1L烧杯中，加入约800ml的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节PH值至8.0，加去离子水将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。A.3.3DNA抽提缓冲液量取1MTris-HCl（pH8.0）10ml，0.5MNaCl，充分搅拌，用去离子水将溶液定容至100ml，高温高压灭菌后，室温保存。使用前每毫升提取缓冲液中加入100µg蛋白酶K。A.3.4CTAB/NaCl溶液同时加热并搅拌，用去离子水将溶液定容至100ml，高温高压灭菌，室温保存。A.3.5TE缓冲液(pH8.0)量取1MTris·Cl（pH8.0）1ml和0.5MEDTA（pH8.0）200μl依次加入100ml烧杯中，向烧杯中加入约80ml的去离子水，均匀混合，将溶液定容至100ml后，高温高压灭菌，室温保存。A.3.6TAE电泳缓冲液（50×)（pH约8.5）DB46/T220—20126称取Tris242g和Na2EDTA·2H2O37.2g置于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，再向烧杯中加入57.1ml的CH3COOH，充分搅拌，加去离子水将溶液定容至1L，室温保存。DB46/T220—20127（资料性附录）槟榔黄化病植原体巢式PCR电泳图、16SrDNA序列指纹图谱和实时荧光PCR检测图B.1槟榔黄化病植原体巢式PCR电泳图图B.1槟榔黄化病植原体巢式PCR电泳图B.2槟榔黄化病植原体核糖体