CN113993527B 包含间充质细胞的细胞群、包含其的医药组合物及其制造方法 （株式会社钟化）

2021.12.14PCT/JP2020/0232082020.06.12WO2020/251020JA2020.12.17FormationviaE-cadherinPrTherapeuticPotencyofMesenchymaCellsDerivedFromHumanUmbilBloodforMyocardialInfarction.M本发明的问题在于提供包含能够形成可自发地从基材剥离的细胞片的间充质细胞的细胞细胞群中，呈CD324阳性的细胞的比率为70％以23从所述包含间充质细胞的细胞群中筛选贴壁培养时具有以下所示的(a)及(g)的特性所述医药组合物为细胞团块或片状结构的移植用制4[0002]再生医疗是通过将在体外人工培养的干细胞等施用至患者体内，使损伤的器官、以严重心力衰竭的患者作为对象的骨骼肌成肌细胞片已经作为再生医疗等的产品而在日[0004]另外，专利文献2公开了使用将细胞粘附性随温度而发生变化的温度响应型高分5[0023]从上述包含间充质细胞的细胞群中筛选具有以下所示的(a)及(b)的特性的细胞[0031](11)(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群在医药组合物的制造中的用6[0032](12)(1)～(4)中任一项的包含间充质细胞的细胞群在细胞治疗剂的制造中的用[0044]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请编号2019-111470号的公[0046]本发明的一个以上实施方式的细胞群即使不使用化学方法和/或物理方法也会自[0047]本发明的一个以上实施方式的细胞群的制造方法可以高效地制造具有上述效果[0049]图1是评价1中的由供体#1制备的比较例1的第5次传代的细胞群在培养第21天的[0050]图2是评价2中的由供体#1制备的实施例1的第5次传代的细胞群在培养第10天的[0051]图3是评价2中的由供体#3制备的实施例2的第2次传代的细胞群在培养第10天的[0052]图4是评价2中的由供体#3制备的实施例2的第2次传代的细胞群在培养第11天的7细胞形态的观察像(倍率40倍)。观察到了从基材剥离的细胞片凝聚成的块状结构物(细胞覆盖并分泌羊水。羊膜的内层(也被称为上皮细胞层)被具有分泌功能的一层上皮细胞包8中，呈CD324阳性的细胞的比率为70％以上，且呈CD90阳性的间充质细胞的比率为90％以[0070]表面抗原的CD324是指分化群324，是已知为上皮钙粘蛋白(E-cadherin)的蛋白[0074]本发明的一个以上实施方式的细胞群优选呈CD326阳性的细胞的比率为10％以[0076]在上述细胞群中，呈CD326阳性的细胞的比率可以更优选为5％以下(阴性率95%以上)、4％以下(阴性率96％以上)、3％以下(阴性率97％以上)、2％以下(阴性率98％以9[0081]CD45是指分化群45，是已知为PTPRC(Proteintyrosinephosphatase,receptortype,C)或LCA(LeukocytecoCD45及CD34的表达为阳性的细胞或[0089]在本发明的一个以上实施方式中，作为指标的表达标记(CD324、CD90、CD326、荧光标记抗体的流式细胞术中，在检测到比阴性对照(同型对照)发出更强荧光的细胞时，的间充质细胞群成为单个细胞的形态而以细胞片的形足上述(a)及(b)中一者或两者的特性的细胞群的特定条件下对包含间充质细胞的细胞群[0097]本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群的制造方法可以优选进[0099]包含从胎儿附属物采集到的细胞的细胞群更优选为对从胎儿附属物采集到的试[0100]从胎儿附属物采集到的试样(优选为包含上皮细胞层和含有间充质细胞的细胞外基质层的试样)的酶处理优选为利用能够使胎儿附属物的细胞外基质层中包含的间充质细[0101]胶原酶的活性浓度优选为50PU/ml以上、更优选为100PU/ml以上、进一步优选为[0102]金属蛋白酶(例如，嗜热菌蛋白酶和/或分散酶)的活性浓度优选为50PU/ml以上、金属蛋白酶的活性浓度优选为1000PU/ml以下、更优选为900PU/ml以下、进一步优选为好地游离。胶原酶和/或金属蛋白酶的优选的浓度的组合可以通过酶处理后的胎儿附属物用含有胶原酶及金属蛋白酶的酶液对胎儿附属物仅进行一次处理而简便地获得间充质细另外，搅拌速度没有特别限定，在使用了搅拌器或振动器的情况下，例如为100rpm以下、和/或回收游离的间充质细胞。优选利用过滤器对包含游离的间充质细胞的酶溶液进行过上皮细胞层无法通过过滤器而残留在过滤器上，因此不仅能够容易地分离和/或回收游离[0108]通过过滤器的包含间充质细胞的细胞群可以在用倍量或其以上量的培养基或平衡盐缓冲液将滤液稀释之后，通过离心分离进行回收。作为平衡盐缓冲液，可以使用以以例如500～10,000细胞/cm2的密度进行接种。作为上述接种密度的下限，例如优选为[0113]上述的培养所使用的培养基可以通过以任意的动物细胞培养用液体培养基作为MEM培养基、ImprovedMEMZincOption培养基、IMDM培养基(Iscove’sModifiedofMinimumEssentialMediumEagle)培养基、DMEM培养基(Dulbecco’sModified基、以及它们的混合培养基(例如，DMEM/F12培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’s小板溶解物在培养基中的浓度的下限，可以列举例如以最终浓度计为1重量％以上、2重例如STK1、STK2(DSPHARMABIOMEDICAL公司)、EXPREPMSCMedium(BioMimetics不进行进一步传代培养而将培养细胞回收的情况下，可以将细胞培养至达到汇合度100%[0119]本发明的一个以上实施方式的制造方法可以包括筛选具有以下所示的(a)及(b)上所述用细胞分选仪筛选满足上述(a)和/或(b)的特性的细胞群的工序，进一步根据需要包括在能够筛选满足上述工序中未筛选的特性的细胞群的条件下进行培养的工序。另外，70％以上且呈CD90阳性的间充质细胞的比率为90％以上的细胞群进行剥离/回收的方法。的细胞群中通过培养呈CD324阳性且呈CD90阳性的间充质细胞来进行筛选的时机没有特别中筛选呈CD324阳性且呈CD90阳性的间充胞群中筛选呈CD324阳性且呈CD90阳[0129]在细胞群的筛选中，优选进一步筛选呈CD326阳性的细胞的比率为10％以下的细例如可以以-2℃/分以上且-1℃/分以下的冷冻速度将温度降至-50℃以上且-30℃以下之[0135]本发明的一个以上实施方式的包含间充质细胞的细胞群可以作为医药组合物使[0142]根据本发明的一个以上的实施方式，可以提供对患者或受试者移植细胞的方法、[0149]本发明的一个以上实施方式的医药组合物也可以以用于其它疾病治疗的注射用[0150]本发明的一个以上实施方式的医药组合物的作为对象的患者或受试者代表性地[0151]本发明的一个以上实施方式的医药组合物可以在冷冻状态下保存至即将使用前。[0153]可以对患者或受试者使用包含间充质细胞的细胞群进行治疗的疾病等的其它例590577号公报、日本特表2010-518096号公报、日本特表2012-509087号公报、日本特表日本特表2010-505764号公报、日本特表2011-514901号公报、日本特开2013-064003号公[0158]从获得知情同意的择期剖宫产病例的孕妇(供体#1)无菌采集作为胎儿附属物的[0160]将包含上皮细胞层和含有间充质细胞的细胞外基质层的羊膜浸渍于含有240PU/胞的细胞群接种于培养容器CellSTACK(注册商标)(Corning公司制)。接种密度为6,000cells/cm2的密度。在细胞接种后，在包含mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的αMEM(AlphaModificationofMinimumEssentialMediumEagle)中贴壁培养至近汇合(subconfluence)。在培养后，每1层规模的CellSTACK(注册商标)，由此在包含最终浓度10％的FBS及10ng/mL的bFGF的αMEM中进行了传代培养。培养基更换以2～4天1次的频率实施。在达到近汇合的时刻，每1层合而成的溶液)，以每份1mL转移至冻存小瓶，缓慢冷冻至-80℃,然后在液氮中冷冻保存1及10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的αMEM(AlphaModificationofMinimum基更换以2～4天1次的频率实施。在达到近汇合的时刻，每1层CellSTACK(注册商标)添加15mL的TrypLESelect，在37℃下孵育3分钟，结果是3成左右的细胞群未剥离而以粘附于群。对于上述细胞群，添加RPMI1640使细上述冷冻保存的细胞群解冻，以约6,000cells/cm2的密度将上述第3次传代的细胞群接种于CellSTACK(注册商标)，在包含以最终浓度计10％的胎牛血清(FBS)及10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的αMEM(AlphaModificationofMinimumEssentialMediumEagle)中贴壁培养至近汇合。在培养后，每1层CellSTACK(注册商标)添加15mL的TrypLE1次的频率实施。在达到近汇合的时刻，每1层CellSTACK(注册商标)添加15mL的TrypLE[0164]关于通过上述的培养方法培养的第5次传代的细胞群，使用流式细胞仪对各种表的间充质细胞的比率为90％以上的条件，但不满足呈CD324阳性的细胞的比率为70％以上[0165]需要说明的是，在本测定中，作为同型对照用抗体，使用了REAControl(S)APC[0169](4)计算出(3)所选择出的门内包含的细胞在利用与表面抗原标记相对应的抗体细胞的细胞群接种于培养容器CellSTACK(注册商标)(Corning公司制)。接种密度为6,MEM中贴壁培养至近汇合。在培养后，每1层CellSTACK(注册商标)添加15mL的TrypLE次的频率实施。在达到近汇合的时刻，每1层CellSTACK(注册商标)添加15mL的TrypLE7冻保存的细胞群解冻，以约15,000～18,00种于CellSTACK(注册商标)，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hPL)的αMEM中贴分钟，使上述细胞群完全剥离。这里得到的细胞群为第3次传代的细胞群。然后，添加解冻，以约6,000cells/cm2的密度将上述第3次传代的细胞群接种于CellSTACK(注册商群接种于与先前培养相同规模的CellSTACK(注册商标)，由此在包含最终浓度为5％的hPL[0178]关于通过上述的培养方法培养的第5次传代的间充质细胞群，使用流式细胞仪对[0182]与比较例1、实施例1不同的是从获得知情同意的择期剖宫产病例的3名孕妇(供[0186]将包含上皮细胞层和含有间充质细胞的细胞外基质层的羊膜浸渍于含有480PU/胞接种后，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hPL)的αMEM中贴壁培养至近汇合。培养基更换以3～5天1次的频率实施。在培养后，每1层CellSTACK(注册商标)添加15mL的将上述冷冻保存的细胞群解冻，以约1,000cells/cm2的密度将第1次传代的细胞群接种于CellSTACK(注册商标)，在包含以最终浓度计5％的人血小板溶解物(hPL)的αMEM中贴壁培理盐水，使得细胞浓度达到2×107cells/mL。向其中加入等量的CP-1(注册商标)溶液(以[0193]将通过比较例1的工序1-3中记载的培养方法培养的第5次传代的细胞群(#1)解10％的胎牛血清(FBS)及10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的αMEM(Alpha[0195]将通过实施例1的工序2-3中记载的培养方法培养的第5次传代的细胞群(#1)及通过实施例2的工序3-3中记载的培养方法培养的第2次传代的细胞群(#3)解冻，以约10,000cells/cm2的密度接种于培[0199]将上述的实施例2中得到的间充质细胞群(#2～4)的一部分供于医药组合物的制