CN114127272B 工程化亚胺还原酶和用于酮和胺化合物的还原胺化的方法 （科德克希思公司）

2021.12.30PCT/US2020/0295072020.04.23WO2020/223102EN2020.11.05工程化亚胺还原酶和用于酮和胺化合物的本申请提供了具有亚胺还原酶活性的工程化多肽和一系列酮和胺底物化合物以制备仲胺21.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的多肽序列与SEQIDNO:4之2.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的多肽序列与SEQIDNO:4之3.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的多肽序列与SEQIDNO:4之4.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的多肽序列与SEQIDNO:4之5.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的多肽序列与SEQIDNO:4之D/V/I/E/L和S306F的氨基酸残基差异，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQIDNO:46.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的多肽序列与SEQIDNO:4之7.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的多肽序列与SEQIDNO:4之8.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的氨基酸序列为SEQIDNO:9.一种工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚胺还原酶的氨基酸3。12.根据权利要求10所述的工程化亚胺还原酶，其中所述改进的活性包括改进的对化。13.根据权利要求10所述的工程化亚胺还原酶，其中所述改进的活性包括改进的对化。415.根据权利要求10所述的工程化亚胺还原酶，其中所述改进的活性包括以下一个或5。16.根据权利要求10所述的工程化亚胺还原酶，其中所述改进的活性包括改进的对映17.根据权利要求1-9和11-16中任一项所述的工程化亚胺还原酶，其中所述工程化亚18.一种组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1-17中任一项提供的工程化19.一种工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸编码根据权利要求1-16中任一项所述20.一种工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸为SEQIDNO:15或37-801中的任一个24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生至少一种根据权利要求25.一种以宿主细胞产生工程化亚胺还原酶的方法，所述方法包括在合适的条件下在6培养基中培养根据权利要求23或24所述的宿主细胞，从而产生至少一种工程化亚胺还原27.根据权利要求25或26所述的方法，所述方法还包括纯化所述至少一种工程化亚胺7Web提交的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入原2-甲基-1-吡咯啉(参见，Mitsukura等人,Biosci.Biotech.Biochem.,75:1778-1782酶还原成无环胺和带有烷基基团的氨基酸(Gand等人,J.Mol.Catal.B:Enzym.,110:126-趣的还原胺化(Grogan,Curr.Opin.Chem.Biol.,2018,43,15-22；France等人,ChemCatChem.,2018,10(3),510-514；Aleku等人,Nat.Chem.,2017,9,961-969和ChemCatChem.,2018,10(3),515-519；Sharma等人,ACSCatalysis2018,8(12),11534-11541以及Adv.Synth.Catal.,2017,359(12),2011-2015；Roiban等人,ChemCatChem.,[0008]本领域对生物催化剂和在工业适用条件下使用它们合成手性仲胺和叔胺的方法[0010]本发明提供了用于通过亚胺底物的直接还原来合成手性仲胺的新型生物催化剂码具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的冠瘿碱脱氢酶(opinedehydrogenase)的野生型基因8[0012]本发明提供了一种工程化多肽，所述工程化多肽包含与参考序列SEQIDNO:4具参考SEQIDNO:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化多IDNO:802中列出的任何偶数编号序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。氨基酸序列，包含选自以下一个或更多个位置处的至少一个取代或取代集：29/94/184/94/184/232/287/293/332、29/94/184/232/288/293/311/324/353、29/94/184/232/288/287/293/311/353、29/94/184/287/311、29/94/184/288/293/324、29/94/184/288/293/9肽包含选自以下的至少一个取代或取代集：29R/94K/184Q/288S/353E、29R/94K/184R/332V/353E、29R/94K/184R/324L、29R/94K/223S/232A/287K、29R/94K/232A/287T/288S/293H/311V/324L、29R/94K/324L/353E、29R/94R/184Q/223S/232A/288S/293F、29R/94R/94R/184R/232A/287K/288S/293F/311V、29R/94R/184R/232A/287T/288S/311V、29R/94R/184R/232A/293F、29R/94R/184R/232A/311V、29R/94R/184R/288S/298A/332V、29R/94R/94R/287K/288S/293F、29R/94R/287T/288S/293F、29R/94R/287T/288S/293F/353E、29R/232A/311V/353E/355K/356K/357C/358C/359-、94R/223S/287K/288S/293F、94R/223S/293F/311V/324L/353E、288S/293F/324L、293F/311V和311V/332V，其中位置参考SEQIDN94K/V184Q/N288S/G353E、S29R/N94K/V184R/S232A/N288S/Y293F/A311V/D324L/G353E、S29R/N94K/V184R/I287T/Y293F、S29R/N94K/V184R/N288S/Y293Q/T332V/G353E、S29R/N94K/V184R/D324L、S29R/N94K/L223S/S232A/I287K、S29R/N94K/S232A/I287T/N288S/A311V、S29R/N94K/S232A/N288S/Y293F、S29R/N94K/I287K/A311V、S29R/N94K/I287T/N288S/Y293F、S29R/N94K/Y293H/A311V/D324L、S29R/N94K/D324L/G353E、S29R/N94R/V184Q/L223S/S232A/N288S/Y293F、S29R/N94R/V184Q/S232A/I287T/Y293F/T332V、S29R/N94R/V184Q/S232A/N288S/A311V/D324L/T332V、S29R/N94R/V184Q/I287K/Y293F/A311V/G353E、S29R/N94R/V184Q/I287K/A311V、S29R/N94R/V184Q/N288S/Y293F/D324L、S29R/N94R/V184R/S232A/I287K/N288S/Y293F/A311V、S29R/N94R/V184R/S232A/I287T/N288S/A311V、S29R/N94R/V184R/S232A/Y293F、S29R/N94R/V184R/S232A/A311V、S29R/N94R/V184R/N288S/V298A/T332V、S29R/N94R/V184R/Y293F/A311V、S29R/N94R/L223S/N288S/Y293F、S29R/N94R/L223T/S232A/Y293H/A311V/D324L、S29R/N94R/I287K/N288S/Y293F、S29R/N94R/I287T/N288S/Y293F、S29R/N94R/I287T/N288S/Y293F/G353E、S29R/N94R/Y293F/T332V/G353E、S29R/N94R/A311V、S29R/V184Q/L223S/N288S/Y293F/D324L、S29R/S29R/G353E、A72V/N94R/V184R/N288S/A311V、I86Q、N94K/A96V/L223T/I287K/N288S/N288S/Y293F、N94K/N288S/Y293F/D324L、N94K/A311V/D324L、N94R/I99T/V184R/Y293F/N94R/V184Q/Y293F/T332V/G353E、N94R/V184R/L223S、N94R/V184R/L223S/Y293F、N94R/N94R/V184R/Y293F、N94R/L223S/S232A/A311V/G353E/R355K/S356K/A357C/V358C/E359-、N94R/L223S/I287K/N288S/Y293F、N94R/L223S/N288S/Y293F/A311V、N94R/S232A/I287K/V184Q/S232A/I287K/N288S/Y293F/A311V、V184Q/S232A/I287K/N288S/D324L/G353E、V184Q/I287K/Y293F、V184R/L223T、V184R/S232A/I287K/Y293F/T332V、V184R/I287K/Y293F/A311V、V184R/I287T/N288S、V184R/I287T/N288S/Y293F、V184R/I287T/N288S/Y293F/D324L/G353E、V184R/I287T/N288S/Y293Q、V184R/N288S/Y293H/A311V/D324L、V184R/T332V/G353E、P205I、P205V、L223S/S232A/I287K/N288S/T332V/G353E、L223S/I287K/N288S/Y293F/A311V、L223S/I287K/A311V/G353E、L223S/I287T/N288S、L223S/N288S/Y293F、S232A/I287K/N288S/Y293F、S232A/I287K/N288S/Y293F/A311V、S232A/I287K/A311V、S232A/I287T/N288S/Y293F/A321V、S232A/N288S/Y293F、S232A/N288S/Y293F/T332V、A234V/I287K/N288S/Y293F/A311V、I287K/N288S/Y293F、I287K/Y293F、I287K/A311V/T332V、I287K/D324L、I287T/N288S/A311V/D324L、I287T/A311V、N288S/Y293F、N288S/Y293F/A311V/D324L/G353E、N288S/Y293F/D324L、Y293F/A311V和A311V/57/184/205/259/261/265/287、29/57/205/259/261/265、29/57/205/259/261/265/287、205/259/261/287、29/94/153/205/259/261/287/353、29/94/184/205/259/261、29/94/153/205/261/265、57/94/153/259/261/265、57/94/153/261/265、57/94/184/205/261/的实施方案中，工程化多肽包含选自以下的至少一个取代或取代集：29S/57G/94K/153F/184R/205C/261L/265I/287T、29S/57G/94K/153L/205A/265I、29S/57G/94K/184R/205C/29S/57G/153L/205A/265I/277V、29S/57G/184R/205C/259F/261L/265I/277V/287K/357S、29S/57G/184R/205C/259F/261V/265I/287T、29S/57G/205A/259F/261L/265I/287T、29S/57G/205A/259F/261S/265I、29S/57G/205C/261S/265I/353E、29S/94K/153F/205A/259F/94K/153L/205C/259F/261R/265I、29S/94K/184R/205C/259F/261S、29S/94K/184R/205C/259F/261L、57G/94K/153F/205A/261L/265I、57G/94K/153F/259F/261V/265I、57G/94K/57G/94K/205A/259F、57G/94K/205A/259F/261V/265I/277V/287T、57G/94K/205A/277V、57G/94K/205C/259F、57G/94K/205C/261S/265I、57G/153F/205A/261L/265I、57G/153F/205A/259F/261L/265I/277V/287K/353E、57G/205A/259F/261L/287T/353E、57G/205A/126C/184R/205A/259F/261L/265I、94K/153F/184R/259F/261S/265I、94K/153F/205A/153L/184R/205C、94K/153L/205C/259F/261S/265I/353E、94K/184R/205A/259F/261L/259F/261L/265I/277V/287K、94K/205A/259F/261R/265I、94K/205A/259F/261V/287K/P205C/E261L/Q265I/I287T、R29S/A57G/N94K/N153L/P205A/Q265I、R29S/A57G/N94K/Q184R/P205C/N277V/G353E、R29S/A57G/N94K/P205C/Y259F/E261S/Q265I、R29S/A57G/N94K/P205C/E261L/G353E、R29S/A57G/N153F/Q184R/P205C/Y259F/E261V/Q265I/N277V、R29S/A57G/N153F/P205C/E261L/Q265I/N277V、R29S/A57G/N153F/P205C/E261V/Q265I、R29S/A57G/N153F/P205C/N277V/G353E、R29S/A57G/N153L/Q184R/P205A/G353E、R29S/A57G/N153L/P205A/Q265I/N277V、R29S/A57G/Q184R/P205C/Y259F/E261L/Q265I/N277V/I287K/A357S、R29S/A57G/Q184R/P205C/Y259F/E261V/Q265I/I287T、R29S/A57G/P205A/Y259F/E261L/Q265I/I287T、R29S/A57G/P205A/Y259F/E261S/Q265I、R29S/A57G/P205C/E261S/Q265I/G353E、R29S/N94K/N153F/P205A/Y259F/E261S/I287T/G353E、R29S/N94K/N153F/P205C/Y259F/E261L/I287K、R29S/N94K/N153L/Q184R/P205C、R29S/N94K/N153L/P205C/Y259F/E261R/Q265I、R29S/N94K/Q184R/P205C/Y259F/E261S、R29S/N94K/Q184R/P205C/E261V、R29S/N94K/P205A、R29S/N94K/P205A/E261V、R29S/N94K/P205C/Y259F/E261L/I287T、R29S/N94K/E261R/Q265I/I287T/G353E、R29S/N153F/Q184R/P205C、R29S/R29S/P205C/E261L/Q265I/G353E、R29S/P205C/E261R/G353E、R29S/P205C/E261S、R29S/R29S/P205C/I287T/G353E、R29S/Y259F/E261L/Q265I、R29S/E261V/G353E、A57G/N94K/N153F/Q184R/P205A/Y259F/E261L、A57G/N94K/N153F/P205A/E261L/Q265I、A57G/N94K/N153F/Y259F/E261V/Q265I、A57G/N94K/N153F/E261V/Q265I、A57G/N94K/Q184R/P205C/E261V/Q265I/I287T、A57G/N94K/Q184R/E261S/Q265I/I287T、A57G/N94K/P205A/Y259F、A57G/N94K/P205A/Y259F/E261V/Q265I/N277V/I287T、A57G/N94K/P205A/N277V、A57G/N94K/P205C/Y259F、A57G/N94K/P205C/E261S/Q265I、A57G/N153F/P205A/E261L/Q265I、A57G/N153F/P205A/E261S、A57G/N153F/P205C/Y259F/E261L/Q265I/I287T、A57G/N153F/N94K/P205A/Y259F/E261V/I287K/G353E、N94K/P205A/N277V、N94K/P205C、N94K/P205C/P205A/E261L/N277V/I287T、N153F/Q184R/E261S/Q265I/I287T、N153F/P205A、N153F/P205A/E261R/Q265I/I287T、N153F/P205C、N153F/P205C/E261L、N153F/P205C/E261V、N153F/Y259F/E261V/Q265I、N153F/Y259F/Q265I/I287K、N153F/E261L/Q265I、N153F/E261R/Q265I、N153F/E261S/Q265I/I287T/G353E、N153F/Q265I、N153F/Q265I/N277V/I287T/G353E、Q184R/P205A/E261R/Q265I、Q184R/P205A/I287T/G353E、Q184R/P205C、Q184R/P205C/Y259F/E261L/I287K、Q184R/P205C/E261L、Q184R/P205C/E261R/I287K、Q184R/P205C/N277V、Q184R/E261L/Q265I/I287T、H202L、H202M、P205A、P205A/Y259F/E261V/Q265I、P205A/Y259F/Q265I、P205A/E261L、P205A/E261R/Q265I/I287K、P205C、P205C/Y259F/E261L、P205C/Y259F/E261R/Q265I/N277V/I287T/G353E、P205C/Y259F/E261S、P205C/Y259F/E261S/Q265I、P205C/Y259F/E261V/N277V/I287T、P205C/Y259F/Q265I、P205C/E261L/Q265I/V274A、P205C/E261L/N277V、P205C/E261L/G353E、P205C/E261R、P205C/E261R/Q265I/I287K/G353E、P205C/E261S、P205C/E261V/Q265I、P205C/C256V、Y259F/E261L/Q265I、Y259F/E261V/Q265I、E261R/Q265I/I287K、E261S/Q265I/[0015]本发明提供了一种工程化多肽，所述工程化多肽包含与参考序列SEQIDNO:306的氨基酸序列，包含选自以下一个或更多个位置处的至少一个取代或一个取代集：197/集：197T/198S/201L/259V、198A/201L/259V/280L、202L/205S/221S/223G/225Y/261Y、202L/221H/223G/225F/283M/294I、202M/205S/221H/223G/261Y/294I、202M/205T/221L/223G/225Y/261R、202M/221S/222I/225Y/256L/261R/294I、205S/221S/223G/225F/256L/以下的至少一个取代或取代集：V197T/H198S/M201L/Y259V、H198A/M201L/Y259V/Y280L、H202L/A205S/Y221S/S223G/G225Y/V261Y、H202L/Y221H/S223G/G225F/I283M/F294I、H202M/A205S/Y221H/S223G/V261Y/F294I、H202M/A205T/Y221L/S223G/G225Y/V261R、H202M/Y221S/F222I/G225Y/C256L/V261R/F294I、A205S/Y221S/S223G/G225F/C256L/V261T/I283M、A205T/Y221H/F222I、F219L、Y221H/F222I/S223G/G225Y、Y221H/S223G/G225L、Y221H/G225F、Y221L/S223G/G225L/C256T/V261R、Y221L/G225F/C256V、Y221S/S223G、Y221S/S223G/G225L/C256L/V261R、Y221S/S223G/G225L/V261R、Y221S/S223G/G225L/F294I、Y221S/G225F/C256T/V261R、Y221S/G225Y/C256T/V261Y/I283M/F294I、[0016]本发明提供了一种工程化多肽，所述工程化多肽包含与参考序列SEQIDNO:648的氨基酸序列，包含在选自以下的一个或更多个位置的至少一个取代或一个取代集：17/S223G/Y259W、V197L/S223G/N277T/Y280K、V197L/Y259W、V197L/N277F、H198A、H198S、H198S/S223G、H198S/S223G/Y259W/N277W/Y280G、H198S/Y259V、H198S/Y259V/N277T、H198S/Y259W/N277F/Y280G、H198S/Y259W/N277T/Y280F、H198S/N277F/Y280F、H198S/N277G/Y280W、H198S/N277P/Y280F、S223G/Y259V/Y280W、S223G/Y259W、W258Y、Y259N/[0017]本发明提供了一种工程化多肽，所述工程化多肽包含与参考序列SEQIDNO:708[0018]本发明还提供了编码至少一种在上文段落中描述的工程化多肽的工程化多核苷编号序列。[0024]尽管本发明的实践中可使用类似或等同于本文描述的那些的任何合适的方法和方案。还应理解，在各种实施方案的描述中使用术语“任选的(optional)”或“任选地ARNDCEQGHILKMFPSTWYV列以一串单字母或三字母缩写(或其混合)呈现时，根据常规惯例将序列呈现为氨基(N)至[0036]“EC”数字是指生物化学和分子生物学国际联合命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology，NC-IUBMB)的酶命名法。该IUBMB生物化学分类是基于酶催化的化学反应的酶数字分类系[0038]“NCBI”是指美国国家生物信息中心(NationalCenterforBiological以及包含D-氨基酸和L-氨基酸以及D-氨基酸和L-氨基酸的混合和中性L-氨基酸(例如L-正缬氨酸)的氨基基团转化为仲胺二羧酸化合物(例如N-[1-(R)-的存在下，酮或醛的羰基基团和伯胺或仲胺的氨基基团(其中羰基基团和氨基基团可以在单独的化合物上或在同一化合物上)被转化为仲胺或胺还原酶不限于源自节杆菌属种菌株1C的野生型冠瘿碱脱氢酶(正缬氨酸脱氢酶，冠瘿碱的章鱼碱脱氢酶(OpDH)、来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)K1的鸟氨酸来自斗笠螺(Cellanagrata)的#-丙氨奥品脱氢酶(#-alanopinedehydrogenase，BADH)、来自居蟹皮海绵(Suberitesdomuncula)的牛磺奥品脱氢酶(tauropinedehydrogenase，(野生型)亚胺还原酶以及通过人类操作产生的非天然存在的工程化多多肽或多核苷酸序列是存在于可以从自然界的来源分离的生物体中并且没有被人工操作的”是指已经以自然中原本不存在的方式修饰的材料或相应于材料的天然(natural)或自两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的序列的已建立的算法。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman,Adv的同源性比对算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443[1970])、通过Pearson和Lipman的搜索相似性方法(Pearson和Lipman,Proc.Natl.通过这些算法的计算机化执行(例如GCGWisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和比的算法的实例包括但不限于BLAST和BLAST2.0算法，其由Altschul等人(分别参见，Altschul等人,J.Mol.Biol.,215:403-3389-3402[1977])描述。公众可通过美国国家生物技术信息中心网站获得用于进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值的阀值评分T。T被称为相邻字评分阈值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul等人，同上)。这些最初的邻近字击中(wordhit)充当启动搜索的种子以找到包含它们的更长HSP。和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认值：字长个多核苷酸或多肽可以各自(1)包含两个序列之间相(2)还可以包含两个序列之间不同的序列，因此两个(或更多个)多核苷酸或多aminoacidsequence)，其中参考序列是可以在一级序列中具有一个或更多个变化的序其中在SEQIDNO:4中X14处的对应残基(酪氨酸)已经改变为缬氨酸的参考序列。考序列的20％或更少的缺失或添加的序列来计算。在应用于多肽的一些具体实施方案中，过引入空位以优化两个序列之间的残基匹配来比对给定氨基酸序列诸如工程化亚胺还原残基差异”是指在对应于SEQIDNO:2的位置25的多肽的位置处除了缬氨酸以外的任何残基的氨基酸取代。在本文的大多数实例中，在一个位置处的具体氨基酸残基差异指示为 出现在指定的残基位置(即，替代氨基酸可以以XnY/Z的形式列出，其中Y和Z表示替代的氨基酸残基差异，其由相对于参考序列进行改变的指定位置的列表指示。在一些另外的实施保守取代可以使用定义的组之间而非定义的组之内的氨基酸，并且影响(a)取代区域中肽[0063]“立体选择性”是指在化学或酶促反应中一种立体异构体相对于另一种立体异构(通常为百分比)：[主要对映异构体-次要对映异构体]/[主要对映异构体+次要对映异构[0064]“高度立体选择性”是指能够以至少约85％立体异构体过量将一种或更多种底物(例如底物化合物(2)和(3))转化为相应的胺产物(例如化合物(1))的化学反应或酶促反酶多肽和/或另一种工程化亚胺还原酶多肽相比呈现出任何酶性质的改进。对于本文描述分比(例如使用指定量的亚胺还原酶，在指定时间段内将起始量的底物转化为产物的转化的改进可以从相应的野生型酶的约1.2倍的酶活性至亚胺还原酶多肽由其衍生的天然存在使用相同的表达系统和相同的宿主细胞以使由宿主细胞产生并存在于裂解物中的酶的量相似活性(超过例如60％至80％)的亚胺还原酶测解链温度的已知方法来计算(参见例如，Baldino等人,Meth.Enzymol.,168:761-777[1989]；Bolton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390[1962]；Bresslauer等人,Nucl.AcidsRes.,18:6409-6412[1990](勘误,Nucl.AcidsRes.,19:698[1991])；Sambrook等人,同上)；Suggs等人,1981,于DevelopmentalBiologyUsingPurifiedGenes,Brown等人.[Eds.],第683-693页,AcademicPress,Cambridge,MA[1981]；和发明的工程化亚胺还原酶的序列的互补序列许靶DNA结合以下互补核酸的条件，所述互补核酸与靶DNA具有约60％同一性，优选地约格度条件是指仅允许在0.018MNaCl中在65℃形成稳定杂交体的那些核酸序列的杂交(即，如果杂交体在0.018MNaCl中在65℃是不稳定的，它在如本文考虑的高严格度条件下是不[0074]“密码子优化”是指编码蛋白的多核苷酸的密码子改变为在特定生物体中优先使[1998]；Stenico等人,Nucl.AcidsRes.,222437-46[1994]；Wright,Gene87:23-29[1990])。对于许多不同的生物体，密码子使用表是可获得的(参见例如，Wada等人,Duret,等人,同上；Henaut和Danchin,于EscherichiacoliandSalmonella,编码区域的核酸序列(参见例如Mount,Bioinformatics:SequenceandGenomeAnalysis,第8章,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.[2001]；[0078]“启动子序列”是指被宿主细胞识别用于感兴趣的多核苷酸诸如编码序列的表达NAD+或NADP+再生NADH或NADPH的辅因子再生系统是本领域已知的，并且可以用于本文描述和NAD+或NADP+转化为二氧化碳和NADH或NADPH的NAD+指定数目的碳原子的烷基在括号中表示(例如(C1-C6)烷一个或更多个合适的取代基取代的直链或支链的二价γ2-具有1个至6个碳原子(包括端点)且在芳基部分中具有6个至12个碳原子(包括端点)。这样部分中具有1个至6个碳原子(包括端点)并且在环烷基部分中具有3个至12个碳原子(包括Rε和NRεRεRε,其中每个Rε独代烷基”意指包括单卤代烷基、二卤代烷基、三卤代烷基等直到全卤代烷基。例如，表述1[0108]“羟基烷基”是指其中一个或更多个氢原子被一个或更多个羟基基团替代的烷基或呋喃基)或多于一个稠环(例如吲嗪基(部分中具有1个至6个碳原子(包括端点)并且在杂芳基部分中具有5个至12个环原子(包括原子(包括端点)的饱和的或不饱和的基团。这样的杂环基团可以具有单环(例如哌啶基或(carboline)、菲啶(phenanthridine)、吖啶、菲咯啉(phenanthroline)、异噻唑、吩嗪在烷基部分中具有1个至6个碳原子(包括端点)，并且在杂环烃基部分中具有3个至12个环基团可以通过直接形成键或通过与新的杂原子(优选地氧、氮或硫)形成键而连接以形成述为任选地被取代的任何化学基团，仅意图包括空间上可实现的和/或合成上可行的化学[0123]本发明提供了用于通过含羰基和胺的底物的直接还原胺化来合成手性仲胺的新型生物催化剂和相关方法。本公开内容的生物催化剂是来自节杆菌属种(Arthrobacter还原酶。野生型亚胺还原酶的变体(SEQIDNO:4)与SEQ多肽能够催化羰基化合物和胺转化为仲胺。IRED的一般亚胺还原酶活性如下文的方案1所3基团独立地选此，方案2的亚胺还原酶反应可以用于在单个生物催化反应中建立产物的一个或更多个手[0132]化合物(1)是一种被取代的氨甲酰甲基氨基乙酸衍生物，其化学合成是多步骤过[0137]上文描述的工程化多肽的改进的性质藉以进行期望的反应的合适的反应条件可转化为式(I)化合物方面)的具有亚胺还原酶活性的示例性工程化多肽包含与SEQIDNO:4相比在表5.1所示的残基位置处具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。转化为式(I)化合物方面)的具有亚胺还原酶活性的示例性工程化多肽包含与SEQIDNO:16相比在表6.1所示的残基位置处具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。转化为式(I)化合物方面)的具有亚胺还原酶活性的示例性工程化多肽包含与SEQIDNO:50相比在表7.1所示的残基位置处具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。转化为式(I)化合物方面)的具有亚胺还原酶活性的示例性工程化多肽包含与SEQIDNO:306相比在表8.1所示的残基位置处具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。转化为式(I)化合物方面)的具有亚胺还原酶活性的示例性工程化多肽包含与SEQIDNO:648相比在表9.1所示的残基位置处具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。转化为式(I)化合物方面)的具有亚胺还原酶活性的示例性工程化多肽包含与SEQIDNO:708相比在表10.1所示的残基位置处具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。[0144]本发明的示例性非天然存在的(或工程化)多肽的结构和功能信息是基于式(II)IDNO)是指编码由这些表中的偶数编号SEQIDNO所提供的氨基酸序列的核苷酸序列。示[0145]野生型节杆菌属种菌株1C(CENDH)酶用于产生变体SEQIDNO:4(美国专利第9,产生本发明变体的起始序列。亚胺还原酶的氨基酸序列(SEQIDNO:4)被密码子优化以用于在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表文实施例中描述的底物的转化来确定。在一些实施方案中，摇瓶粉末(SFP)被用作二次筛[0147]在一些实施方案中，特定的酶性质与在本文所示的残基位置处与SEQIDNO:4、[0148]鉴于本文提供的指导，还设想包含SEQIDNO:6-802的偶数编号序列的示例性工程化多肽中的任一个通过例如随后轮次的演化可用作用于合成其他工程化亚胺还原酶多在贯穿较早轮次的演化中维持未改变的残基位置处包含氨基酸差[0149]在一些实施方案中，具有亚胺还原酶活性的工程化多肽包含与参考序列SEQID的氨基酸序列以及与SEQIDNO:4相比选自以下的一个或更多个残基差异：145I、145V、方案中，具有亚胺还原酶活性的工程化多肽包含与参考序列SEQIDNO:4具有至少80％、更多的序列同一性的氨基酸序列以及与SEQIDNO:4相比选自以下的一个或更多个残基差[0150]在一些实施方案中，具有亚胺还原酶活性的工程化多肽包含与参考序列SEQID311、29/94/184/232/287/288/311、29/94/184/232/287/293/332、29/94/184/232/288/293/311/324/353、29/94/184/232/288/311/324/332、29/94/184/232/293、29/94/184/184/288/293/324、29/94/184/288/293/332/353、29/94/184/288/298/332、29/94/184/原酶活性的工程化多肽包含与参考序列SEQIDNO:1的氨基酸序列以及与SEQIDNO:16相比选自以下的一个或更多个残基差异：29R/94K/293F、29R/94K/184R/288S/293Q/332V/353E、29R/94K/184R/324L、29R/94K/223S/232A/287K、29R/94K/232A/287T/288S/311V、29R/94K/232A/288S/293F、29R/94K/287K/311V、94R/184Q/288S/293F/324L、29R/94R/184R/232A/287K/288S/293F/311V、29R/94R/184R/232A/287T/288S/311V、29R/94R/184R/232A/293F、29R/94R/184R/232A/311V、29R/94R/184R/288S/298A/332V、29R/94R/184R/293F/311V、29R/94R/223S/288S/293F、29R/94R/94R/287T/288S/293F/353E、29R/94R/293F/332V/353E、29R/94R/311V、29R/184Q/223S/287T/293F/311V/324L/353E、94K/184R/223S/288S/293F、94K/184R/223T/232A/287K/287K/288S/353E、184Q/232A/287K/288S/293F/311V、184Q/232A/287K/288S/324L/353E、Y293F/A311V/D324L/G353E、S29R/N94K/V184R/I287T/Y293F、S29R/N94K/V184R/N288S/Y293Q/T332V/G353E、S29R/N94K/V184R/D324L、S29R/N94K/L223S/S232A/I287K、S29R/N94K/S232A/I287T/N288S/A311V、S29R/N94K/S232A/N288S/Y293F、S29R/N94K/I287K/A311V、S29R/N94K/I287T/N288S/Y293F、S29R/N94K/Y293H/A311V/D324L、S29R/N94K/D324L/G353E、S29R/N94R/V184Q/L223S/S232A/N288S/Y293F、S29R/N94R/V184Q/S232A/I287T/Y293F/T332V、S29R/N94R/V184Q/S232A/N288S/A311V/D324L/T332V、S29R/N94R/V184Q/I287K/Y293F/A311V/G353E、S29R/N94R/V184Q/I287K/A311V、S29R/N94R/V184Q/N288S/Y293F/D324L、S29R/N94R/V184R/S232A/I287K/N288S/Y293F/A311V、S29R/N94R/V184R/S232A/I287T/N288S/A311V、S29R/N94R/V184R/S232A/Y293F、S29R/N94R/V184R/S232A/A311V、S29R/N94R/V184R/N288S/V298A/T332V、S29R/N94R/V184R/Y293F/A311V、S29R/N94R/L223S/N288S/Y293F、S29R/N94R/L223T/S232A/Y293H/A311V/D324L、S29R/N94R/I287K/N288S/Y293F、S29R/N94R/I287T/N288S/Y293F、S29R/N94R/I287T/N288S/Y293F/G353E、S29R/N94R/Y293F/T332V/G353E、S29R/N94R/A311V、S29R/V184Q/L223S/I99T/V184R/Y293F/A311V/T332V/G353E、N94R/V184Q/I287K/N288S/A311V、N94R/V184Q/N94R/S232A/I287K/N288S/Y293F/G353E、N94R/S232A/N288S/Y293F/G353E、N94R/S232A/I287K/N288S/G353E、V184Q/S232A/I287K/N288S/Y293F/A311V、V184Q/S232A/I287K/N288S/D324L/G353E、V184Q/I287K/Y293F、V184R/L223T、V184R/S232A/I287K/Y293F/T332V、V184R/I287K/Y293F/A311V、V184R/I287T/N288S、V184R/I287T/N288S/Y293F、V184R/I287T/N288S/Y293F/D324L/G353E、V184R/I287T/N288S/Y293Q、V184R/N288S/Y293H/A311V/D324L、V184R/T332V/G353E、P205I、P205V、L223S/S232A/I287K/N288S/T332V/G353E、L223S/I287K/N288S/Y293F/A311V、L223S/I287K/A311V/G353E、L223S/I287T/N288S、L223S/N288S/Y293F、S232A/I287K/N288S/Y293F、S232A/I287K/N288S/Y293F/A311V、S232A/I287K/A311V、S232A/I287T/N288S/Y293F/A321V、S232A/N288S/Y293F、S232A/N288S/Y293F/T332V、A234V/I287K/N288S/Y293F/A311V、I287K/N288S/Y293F、I287K/Y293F、I287K/A311V/T332V、I287K/D324L、I287T/N288S/A311V/D324L、I287T/A311V、N288S/Y293F、N288S/Y293F/A311V/D324L/G353E、N288S/Y293F/D324L、Y293F/A311V和A311V/T332[0151]在一些实施方案中，具有亚胺还原酶活性的工程化多肽包含与参考序列SEQID下的一个或更多个残基差异：29/57/94/153/184/205/261/265/287、29/57/94/153/205/29/57/153/184/205/259/261/265/277、29/57/153/184/205/353、29/57/153/205/261/57/184/205/259/261/265/277/287/357、29/57/184/205/259/261/265/287、29/57/205/259/261/265、29/57/205/259/261/265/287、29/57/205/261/265/353、29/94/153/184/205、29/94/153/205/259/261/265、29/94/153/205/259/261/287、29/94/153/205/259/261/353、57/94/153/184/205/259/261、57/94/153/205/261/265、57/94/153/259/261/99％或更多的序列同一性的氨基酸序列以及与SEQIDNO:50相比选自以下的一个或更多个残基差异：29S/57G/94K/153F/184R/205C/261L/265I/287T、29S/57G/94K/153L/205A/94K/205C/261L/353E、29S/57G/153F/184R/205C/259F/261V/265I/277V、29S/57G/153F/29S/57G/153L/184R/205A/353E、29S/57G/153L/205A/265I/277V、29S/57G/184R/205C/29S/94K/153L/184R/205C、29S/94K/153L/205C/259F/261R/265I、29S/94K/184R/205C/353E、57G/94K/153F/184R/205A/259F/261L、57G/94K/153F/205A/261L/265I、57G/94K/57G/94K/184R/261S/265I/287T、57G/94K/205A/259F、57G/94K/205A/259F/261V/265I/277V/287T、57G/94K/205A/277V、57G/94K/205C/259F、57G/94K/205C/261S/265I、57G/205A/259F/261L/353E、94K/184R/205A/259F/261S、94K/184R/205A/261V/265I/287T/的氨基酸序列以及与SEQIDNO:50相比选自以下的一个或更多个残基差异：R29S/A57G/N94K/N153F/Q184R/P205C/E261L/Q265I/I287T、R29S/A57G/N94K/N153L/P205A/Q265I、R29S/A57G/N94K/Q184R/P205C/N277V/G353E、R29S/A57G/N94K/P205C/Y259F/E261S/Q265I、R29S/A57G/N94K/P205C/E261L/G353E、R29S/A57G/N153F/Q184R/P205C/Y259F/E261V/Q265I/N277V、R29S/A57G/N153F/P205C/E261L/Q265I/N277V、R29S/A57G/N153F/P205C/E261V/Q265I、R29S/A57G/N153F/P205C/N277V/G353E、R29S/A57G/N153L/Q184R/P205A/G353E、R29S/A57G/N153L/P205A/Q265I/N277V、R29S/A57G/Q184R/P205C/Y259F/E261L/Q265I/N277V/I287K/A357S、R29S/A57G/Q184R/P205C/Y259F/E261V/Q265I/I287T、R29S/A57G/P205A/Y259F/E261L/Q265I/I287T、R29S/A57G/P205A/Y259F/E261S/Q265I、R29S/A57G/P205C/E261S/Q265I/G353E、R29S/N94K/N153F/P205A/Y259F/E261S/I287T/G353E、R29S/N94K/N153F/P205C/Y259F/E261L/I287K、R29S/N94K/N153L/Q184R/P205C、R29S/N94K/N153L/P205C/Y259F/E261R/Q265I、R29S/N94K/Q184R/P205C/Y259F/E261S、P205C/Y259F/E261L/I287T、R29S/N94K/E261R/Q265I/I287T/G353E、R29S/N153F/Q184R/A57G/N94K/N153F/Q184R/P205A/Y259F/E261L、A57G/N94K/N153F/P205A/E261L/Q265I、A57G/N94K/N153F/Y259F/E261V/Q265I、A57G/N94K/N153F/E261V/Q265I、A57G/N94K/Q184R/P205C/E261V/Q265I/I287T、A57G/N94K/Q184R/E261S/Q265I/I287T、A57G/N94K/P205A/Y259F、A57G/N94K/P205A/Y259F/E261V/Q265I/N277V/I287T、A57G/N94K/P205A/N277V、A57G/N94K/P205C/Y259F、A57G/N94K/P205C/E261S/Q265I、A57G/N153F/P205A/A57G/N153F/P205C/Y259F/Q265I/N277V、A57G/N153F/P205C/Q265I、A57G/N153F/E261L/A57G/E261L/Q265I/G353E、N94K/G126C/Q184R/P205A/Y259F/E261L/Q265I、N94K/N153F/N94K/N153F/P205C/I287K、N94K/N153F/P205C/I287T/G353E、N94K/N153L/Q184R/P205C、N94K/N153L/P205C/Y259F/E261S/Q265I/G353E、N94K/Q184R/P205A/Y259F/E261L/G353E、N94K/Q184R/P205A/Y259F/E261S、N94K/Q184R/P205A/E261V/Q265I/I287T/G353E、N94K/N94K/P205C/Y259F/E261S/Q265I、N94K/P205C/Y259F/E261S/Q265I/G353E、N94K/P205C/N94K/P205C/E261V/Q265I/G353E、N94K/Y259F/E261S/Q265I、N94K/Y259F/E261V/Q265I、N153F/Q184R/P205A/E261L/N277V/I287T、N153F/Q184R/E261S/Q265I/I287T、N153F/P205A、N153F/P205A/E261R/Q265I/I287T、N153F/P205C、N153F/P205C/E261L、N153F/P205C/E261V、N153F/Y259F/E261V/Q265I、N153F/Y259F/Q265I/I287K、N153F/E261L/Q265I、N153F/E261R/Q265I、N153F/E261S/Q265I/I287T/G353E、N153F/Q265I、N153F/Q265I/N277V/I287T/G353E、Q184R/P205A/E261R/Q265I、Q184R/P205A/I287T/G353E、Q184R/P205C、Q184R/P205C/Y259F/E261L/I287K、Q184R/P205C/E261L、Q184R/P205C/E261R/I287K、Q184R/P205C/N277V、Q184R/E261L/Q265I/I287T、H202L、H202M、P205A、P205A/Y259F/E261V/Q265I、P205A/Y259F/Q265I、P205A/E261L、P205A/E261R/Q265I/I287K、P205C、P205C/Y259F/E261L、P205C/Y259F/E261R/Q265I/N277V/I287T/G353E、P205C/Y259F/E261S、P205C/Y259F/E261S/Q265I、P205C/Y259F/E261V/N277V/I287T、P205C/Y259F/Q265I、P205C/E261L/Q265I/V274A、P205C/E261L/N277V、P205C/E261L/G353E、P205C/E261R、P205C/E261R/Q265I/I287K/G353E、P205C/E261S、P205C/E261V/G225Y、C256L、C256V、Y259F/E261L/Q265I、Y259F/E261V/Q265I、E261R/Q265I/I287K、[0152]在一些实施方案中，具有亚胺还原酶活性的工程化多肽包含与参考序列SEQID221S/223G/225Y/261Y、202L/221H/223G/225F/283M/294I、202M/205S/221H/223G/261Y/SEQIDNO:306相比选自以下的一个或更多个残基差异：V197T/H198S/M201L/Y259V、H198A/M201L/Y259V/Y280L、H202L/A205S/Y221S/S223G/G225Y/V261Y、H202L/Y221H/S223G/G225F/I283M/F294I、H202M/A205S/Y221H/S223G/V261Y/F294I、H202M/A205T/Y221L/S223G/G225Y/V261R、H202M/Y221S/F222I/G225Y/C256L/V261R/F294I、A205S/Y221S/S223G/G225F/C256L/V261T/I283M、A205T/Y221H/F222I、F219L、Y221H/F222I/S223G/G225Y、Y221H/S223G/G225L、Y221H/G225F、Y221L/S223G/G225L/C256T/V261R、Y221L/G225F/C256V、Y221S/S223G、Y221S/S223G/G225L/C256L/V261R、Y221S/S223G/G225L/V261R、Y221S/S223G/G225L/F294I、Y221S/G225F/C256T/V261R、Y221S/G225Y/C256T/V261Y/I283M/F294I、S223G/G225L/C256V/V261R、G225F/C256T/V261T、Y280D、[0153]在一些实施方案中，具有亚胺还原酶活性的工程化多肽包含与参考序列SEQIDV197L、V197L/H198S、V197L/H198S/S223G/Y259W、V197L/S223G/N277T/Y280K、V197L/Y259W、V197L/N277F、H198A、H198S、H198S/S223G、H198S/S223G/Y259W/N277W/Y280G、H198S/Y259V、H198S/Y259V/N277T、H198S/Y259W/N277F/Y280G、H198S/Y259W/N277T/Y280F、H198S/N277F/Y280F、H198S/N277G/Y280W、H198S/N277P/Y280F、S223G/Y259V/[0154]在一些实施方案中，具有亚胺还原酶活性的工程化多肽包含与参考序列SEQIDSEQIDNO:708相比选自以下的一个或更多个残基差异：T141D、A154G、A154H、V197A、的另外的残基差异可以被掺入到序列以产生具有改进性质的另外的工程化亚胺还原酶多设想了包含所述残基差异的一个或子集并且在本文公开的其他残基位置处另外包含一个至少2倍的活性将底物化合物转化为产物化合物的工程化亚胺还原酶多肽包含选自SEQIDNO:6至802中的偶数编号序列的氨基酸序列。[0159]在一些实施方案中，具有改进的性质的工程化亚胺还原酶多肽具有包含选自SEQ残基位置之外的残基位置)处的其他残基差异。这些其他残基位置处的残基差异可以提供一些实施方案中，除了存在于选自SEQIDNO:6-802范围内的偶数编号序列的工程化亚胺或50个残基位置。在一些实施方案中，与参考序列相比的氨基酸残基差异的数目可以是1中该片段包含本发明的工程化亚胺还原酶多肽的全长氨基酸序列的至少约80％、85％、亚胺还原酶多肽可以具有包含本文描述的工程化亚胺还原酶多肽序列的任一个中的缺失的氨基酸序列，本文描述的工程化亚胺还原酶多肽诸如SEQIDNO:6-802范围内的偶数编程化亚胺还原酶的相关功能活性和/或改进的性质被保持。插入可以是在亚胺还原酶多肽描述的多肽可以全部地或部分地包含天然存在的和/或合成的非编码氨基酸。本文描述的多肽可以包含的某些常见的非编码氨基酸包括但不限于：遗传编码氨基酸的D-立体异构乙酰基赖氨酸(AcLys)；2,4-二氨基丁酸(Dbu)；2,3-二氨基丁酸(Dab)；N-甲基缬氨酸描述的多肽可以包含的另外的非编码氨基酸对于本领域技术人员将是明显的(参见例如Fasman,CRCPracticalHandbookofBiochemistryandMolecularBiology,CRCPress,限于(保护基团列于括号中)：Arg(tos)、Cys(甲基苄基)、Cys(硝基吡啶次磺酰基[0170]可以构成本文描述的多肽的构象上受限制的非编码氨基酸包括但不限于N-甲基他合适的底物向产物的生物催化转化，并且反应完成后容易保留(例如通过保留固定有多肽的珠)并且然后在随后的反应中重新使用或再循环。这样的固定化酶方法允许进一步提 10.1021/op200157c；Hermanson,BioconjugateTechniques,第2版,AcademicPress,Cambridge,MA[2008]；Mateo等人,Biotechnol.Prog.,18(3):629-34[2002]；和“BioconjugationProtocols:StrategiesandMethods,”于MethodsinMolecularBiology,Niemeyer(编著),HumanaPress,NewYork,NY[2004]；将各参考文献的公开内容通过引用并入本文)。可用于固定本发明的工程化亚胺还原酶的固体支持物包括但不限于包含具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有氨基环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有十八烷基官能团的苯乙烯/DVB共聚物或聚甲基丙烯酸酯的珠或树脂。可用于固定本发明的工程化亚胺还原酶多肽的示例性固体支持物包括但不限于壳聚糖珠、EupergitC和SEPABEAD(Mitsubishi)，包括以下不同类型的SEPABEAD：EC-EP、EC-HFA/S、EXA252、EXE119和EXE120。种底物化合物的转化。包含多种工程化多肽的这样的阵列及其使用方法是本领域已知的被引入到适当的宿主细胞以表达相应的亚胺还原酶多的了解提供能够编码主题多肽的所有多核苷酸的描述。遗传密码的简并性(其中相同的氨基酸由可选的密码子或同义密码子编码)允许制备极大量的核酸，所有这些核酸都编码改白的氨基酸序列的方式简单改变一个或更多个密码子的序列来制备任何数目的不同核酸。过引用并入本文的序列表中如SEQIDNO:6-802范围内的偶数编号序列公开的氨基酸序708表示的天然存在的亚胺还原酶多肽氨基酸序列的密码子优化的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸具有包含与编码SEQIDNO:6-802范围内的偶数编号序列的密码子优5-801范围内的奇数编号序列的密码子优化的序列增强了编码的野生型亚胺还原酶的表[0182]在一些实施方案中，多核苷酸能够在高严格条件下与选自SEQIDNO:5-801[0185]在一些实施方案中，编码工程化亚胺还原酶的多核苷酸包含选自SEQIDNO:5-[0186]在一些实施方案中，多核苷酸能够在高严格条件下与选自SEQIDNO:5-801范围序列的亚胺还原酶多肽，该亚胺还原酶多肽具有包含与SEQIDNO:4相比在选自以下的残[0187]在一些实施方案中，多核苷酸能够在高严格条件下与选自SEQIDNO:5-801范围基位置处的一个或更多个残基差异的氨基酸序列：29/94/184/223/232/288/293、29/94/29/94/184/232/288/293/311/324/353、29/94/184/232/288/311/324/332、29/94/184/184/287/311、29/94/184/288/293/324、29/94/184/288/293/332/353、29/94/184/288/[0188]在一些实施方案中，多核苷酸能够在高严格条件下与选自SEQIDNO:5-801范围基位置处的一个或更多个残基差异的氨基酸序列：29/57/94/153/184/205/261/265/287、153/205/261/265、29/57/153/205/261/265/277、29/57/153/205/265/277、29/57/153/259/261/265、57/94/153/261/265、57/94/184/205/261/265/287、57/94/184/261/265/[0189]在一些实施方案中，多核苷酸能够在高严格条件下与选自SEQIDNO:5-801范围格条件下杂交的多核苷酸编码包含与SEQIDNO:306具有至少80％、85％、86％、87％、基酸序列的亚胺还原酶多肽，该亚胺还原酶多肽具有包含与SEQIDNO:306相比在选自以[01