青藤碱对大鼠糖尿病视网膜病变中NF-κB及促炎因子mRNA表达的调控机制探究

青藤碱对大鼠糖尿病视网膜病变中NF-κB及促炎因子mRNA表达的调控机制探究一、引言1.1研究背景糖尿病视网膜病变（DiabeticRetinopathy，DR）作为糖尿病（DiabetesMellitus，DM）最为常见且严重的微血管并发症之一，已成为全球范围内工作年龄段人群视力丧失的主要原因。近年来，随着全球糖尿病发病率的持续攀升，DR的患病人数也在不断增加，严重威胁着人们的视觉健康和生活质量。据相关研究数据显示，在糖尿病患者中，DR的发病率相当高，且随着糖尿病病程的延长而显著增加。例如，糖尿病发病5年内，DR发生率可达44.4%，病程7年后则增至56%。在美国，糖尿病发病10年后，60%的患者会出现DR，15年后这一比例更是高达80%。预计到2030年，美国DR患者将达2500万，全球将达3亿。在我国，糖尿病患者中DR的患病率也不容小觑，有文献报道达51.3%。由此可见，DR已成为一个严峻的公共卫生问题，对其发病机制的深入研究以及寻找有效的治疗方法迫在眉睫。DR的发病机制极为复杂，涉及多个方面，是多种因素协同作用的结果。长期以来，高血糖一直被认为是导致DR发生发展的关键因素。临床研究表明，血糖控制不佳的糖尿病患者更容易出现包括DR在内的各种并发症，尤其是增殖型糖尿病视网膜病变。高血糖状态下，多元醇代谢异常、蛋白质非酶糖化、细胞凋亡、DG-PKC系统的激活、细胞因子及自由基作用等一系列病理生理过程被引发，进而导致视网膜微血管功能改变、结构损伤，最终引起DR的发生发展。近年来，越来越多的研究证据表明，炎症机制在DR的发病过程中起着至关重要的作用，是DR发生发展的核心环节之一。炎症反应贯穿于DR的整个病程，从疾病的早期阶段就已开始，并随着病情的进展而不断加重。在DR患者的玻璃体和视网膜中，多种炎症因子如白细胞介素-1β（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和肿瘤坏死因子（TNF）等含量显著增加。这些炎症因子的升高，可通过多种途径导致视网膜血管内皮细胞损伤、血-视网膜屏障破坏、神经炎症反应加剧以及新生血管形成等病理改变，从而促进DR的发生和发展。核因子-κB（NF-κB）作为一种重要的转录因子，在炎症反应的调控中发挥着核心作用。在正常生理状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中。当细胞受到各种炎症刺激时，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，从而释放出NF-κB。NF-κB进入细胞核后，与靶基因启动子区域的κB位点结合，启动一系列炎症相关基因的转录和表达，如促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，进而引发和加剧炎症反应。在DR的发病过程中，NF-κB信号通路的异常激活被认为是导致炎症反应失控的关键因素之一。研究发现，在DR患者的视网膜组织以及糖尿病动物模型的视网膜中，NF-κB的活性明显增强，其下游的促炎因子表达也显著上调。抑制NF-κB信号通路的激活，可有效减少炎症因子的产生，减轻视网膜的炎症损伤，从而延缓DR的发展。因此，深入研究NF-κB及相关促炎因子在DR发病机制中的作用，对于揭示DR的发病机制以及寻找新的治疗靶点具有重要意义。青藤碱（Sinomenine，Sin）是从传统中药青风藤中提取的一种生物碱单体，具有广泛的药理活性，在临床上已被应用于多种疾病的治疗。近年来，越来越多的研究表明，青藤碱具有显著的抗炎、免疫调节、抗氧化等作用。在炎症相关疾病的研究中发现，青藤碱能够抑制炎症细胞的活化和炎症介质的释放，调节免疫细胞的功能，从而减轻炎症反应。其抗炎机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活、调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路以及减少活性氧（ROS）的产生等有关。已有研究报道了青藤碱在类风湿性关节炎、炎症性肠病等疾病模型中的治疗作用，能够有效改善疾病症状，减轻炎症损伤。鉴于青藤碱的抗炎特性以及DR发病过程中的炎症机制，青藤碱有可能通过调节炎症反应，对DR发挥治疗作用。然而，目前关于青藤碱对DR的治疗作用及其机制的研究还相对较少，尤其是青藤碱对DR中NF-κB及部分促炎因子mRNA表达的影响尚未完全明确。1.2研究目的与意义本研究旨在通过动物实验，深入探究青藤碱对糖尿病大鼠视网膜病变（DR）中核因子-κB（NF-κB）及部分促炎因子mRNA表达的影响，从分子生物学水平揭示青藤碱治疗DR的潜在作用机制，为DR的治疗提供新的理论依据和治疗思路。DR作为糖尿病最为常见且严重的微血管并发症之一，严重威胁着全球众多糖尿病患者的视觉健康和生活质量。目前，虽然临床上有多种治疗方法，如视网膜激光光凝、玻璃体腔药物注射、玻璃体切割术等，但这些治疗方法往往存在一定的局限性，且只能在一定程度上延缓疾病的进展，无法从根本上治愈DR。因此，深入研究DR的发病机制，寻找新的治疗靶点和有效的治疗药物，已成为眼科领域的研究热点和迫切需求。炎症机制在DR的发病过程中起着至关重要的作用，核因子-κB（NF-κB）信号通路的异常激活是导致炎症反应失控的关键因素之一。抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子的产生，有望成为治疗DR的新策略。青藤碱作为一种具有广泛药理活性的生物碱单体，已被证实具有显著的抗炎、免疫调节等作用。前期研究表明，青藤碱能够抑制炎症细胞的活化和炎症介质的释放，调节免疫细胞的功能，其抗炎机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活有关。然而，目前关于青藤碱对DR的治疗作用及其机制的研究还相对较少，尤其是青藤碱对DR中NF-κB及部分促炎因子mRNA表达的影响尚未完全明确。本研究通过建立糖尿病大鼠模型，给予不同剂量的青藤碱进行干预，观察大鼠视网膜组织中NF-κB及部分促炎因子mRNA的表达变化，探讨青藤碱对DR的治疗作用及其潜在机制。这不仅有助于深入了解DR的发病机制，为DR的治疗提供新的理论依据，而且对于拓展青藤碱的临床应用范围，开发新型的DR治疗药物具有重要的意义。同时，本研究的结果也可能为其他炎症相关疾病的治疗提供新的思路和方法，具有潜在的临床应用价值和社会效益。1.3国内外研究现状1.3.1糖尿病视网膜病变发病机制的研究进展糖尿病视网膜病变（DR）的发病机制是一个复杂且多因素参与的过程，多年来一直是国内外研究的重点领域。随着研究的不断深入，人们对DR发病机制的认识也在逐渐加深。高血糖被公认为是DR发生发展的始动因素。长期的高血糖状态可引发多元醇代谢异常，使细胞内山梨醇堆积，导致细胞渗透压升高、肿胀，最终引起细胞膜破坏。同时，高血糖还会促进蛋白质非酶糖化，形成糖基化终末产物（AGEs）。AGEs在体内大量堆积，不仅会导致视网膜毛细血管周细胞衰亡，还能活化白细胞，使其在视网膜毛细血管异常粘附和浸润，阻塞血管，释放自由基及蛋白酶损伤周细胞和内皮细胞，影响血管通透性和自我调节功能。此外，高血糖还可提高组织内甘油二酯（DG）的含量，激活蛋白激酶C（PKC），促进多种细胞因子表达，诱导型NO生成增加，损伤内皮细胞和周细胞。炎症机制在DR发病过程中的关键作用也日益受到关注。在DR患者的玻璃体和视网膜中，多种炎症因子如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和肿瘤坏死因子（TNF）等含量显著增加。这些炎症因子可通过多种途径导致视网膜血管内皮细胞损伤、血-视网膜屏障破坏、神经炎症反应加剧以及新生血管形成等病理改变。研究表明，炎症反应贯穿于DR的整个病程，从疾病的早期阶段就已开始，并随着病情的进展而不断加重。例如，在糖尿病早期，视网膜中的小胶质细胞和Müller细胞就会被激活，释放炎症介质，引发局部炎症反应，进而损伤视网膜神经细胞和血管。氧化应激也是DR发病机制中的重要环节。高血糖状态下，体内产生过多的活性氧（ROS），超出了机体的抗氧化防御能力，导致氧化应激失衡。ROS可直接损伤视网膜细胞的生物膜、蛋白质和核酸等，还能激活一系列氧化应激相关信号通路，如核因子-E2相关因子2（Nrf2）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等，进一步加剧视网膜细胞的损伤和炎症反应。此外，氧化应激还可促进AGEs的形成，加重DR的病理损伤。1.3.2NF-κB及促炎因子在DR发病机制中的作用研究核因子-κB（NF-κB）作为一种关键的转录因子，在炎症反应的调控中起着核心作用，其在DR发病机制中的作用也备受关注。在正常生理状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中。当细胞受到高血糖、氧化应激、炎症因子等刺激时，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，从而释放出NF-κB。NF-κB进入细胞核后，与靶基因启动子区域的κB位点结合，启动一系列炎症相关基因的转录和表达，如促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，进而引发和加剧炎症反应。在DR的发病过程中，NF-κB信号通路的异常激活被认为是导致炎症反应失控的关键因素之一。研究发现，在DR患者的视网膜组织以及糖尿病动物模型的视网膜中，NF-κB的活性明显增强，其下游的促炎因子表达也显著上调。抑制NF-κB信号通路的激活，可有效减少炎症因子的产生，减轻视网膜的炎症损伤，从而延缓DR的发展。例如，有研究通过给予糖尿病大鼠NF-κB抑制剂，发现能够显著降低视网膜中IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的表达水平，减轻视网膜血管内皮细胞的损伤和血-视网膜屏障的破坏。促炎因子在DR的发病机制中也扮演着重要角色。IL-1β作为一种重要的促炎细胞因子，可激活免疫细胞，促进炎症介质的释放，导致视网膜血管内皮细胞损伤和血-视网膜屏障破坏。研究表明，在DR患者和糖尿病动物模型中，IL-1β的表达水平明显升高，且与DR的严重程度呈正相关。IL-6具有广泛的生物学活性，可促进细胞增殖、分化和炎症反应。在DR中，IL-6可通过激活JAK-STAT信号通路，促进视网膜血管内皮细胞的增殖和迁移，导致新生血管形成。TNF-α是一种具有强大促炎作用的细胞因子，可诱导细胞凋亡、促进炎症介质释放和血管内皮细胞损伤。在DR发病过程中，TNF-α可通过激活NF-κB信号通路，进一步加剧炎症反应，促进DR的发展。1.3.3青藤碱在相关疾病治疗中的研究及在DR治疗中的潜在价值青藤碱（Sinomenine，Sin）作为从传统中药青风藤中提取的一种生物碱单体，在临床上已被应用于多种疾病的治疗，近年来其相关研究不断取得进展。在类风湿性关节炎（RA）的治疗中，青藤碱展现出显著的疗效。大量研究表明，RA的发生与氧化应激微环境和复杂的炎症微环境密切相关，而青藤碱能够通过多种机制发挥治疗作用。有研究构建了ROS敏感的治疗性聚合物载体，将青藤碱包裹其中用于治疗RA，结果表明该制剂不仅能有效延长青藤碱在关节腔中的作用时间，降低不必要的全身扩散，避免脱靶毒性，还能通过抑制巨噬细胞的NF-κB通路，诱导巨噬细胞从M1表型向M2表型转变，下调促炎因子，上调抗炎因子水平，从而显著抑制关节肿胀，降低关节炎评分，改善关节软骨破坏和滑膜增生。另有研究发现，青藤碱可以调节肠道微生物群的组成，恢复肠道微生物平衡，显著提高微生物色氨酸代谢产物吲哚-3-丙烯酸（IA）、吲哚-3-丙酸（IPA）和吲哚-3-乙酸（IAA）的水平，这些代谢产物可激活芳香烃受体（AhR），调节Th17/Treg平衡，从而缓解RA症状。在炎症性肠病（IBD）的研究中，青藤碱也显示出良好的治疗潜力。IBD是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，其发病机制涉及免疫失衡、炎症反应和肠道微生物群紊乱等多个方面。研究表明，青藤碱能够抑制炎症细胞的活化和炎症介质的释放，调节免疫细胞的功能，减轻肠道炎症损伤。其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活、调节MAPK信号通路以及减少ROS的产生等有关。例如，有研究发现青藤碱可以通过抑制NF-κB的核转位，减少促炎因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，从而改善实验性结肠炎小鼠的肠道炎症症状。鉴于青藤碱具有显著的抗炎、免疫调节等作用，以及DR发病过程中的炎症机制，青藤碱在DR治疗中具有潜在的价值。已有研究报道了青藤碱在眼科疾病治疗中的应用，多项专利公开了青藤碱在治疗老年性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变以及葡萄膜炎等自身免疫性眼病的应用。然而，目前关于青藤碱对DR的治疗作用及其机制的研究还相对较少，尤其是青藤碱对DR中NF-κB及部分促炎因子mRNA表达的影响尚未完全明确。深入研究青藤碱对DR的治疗作用及其机制，有望为DR的治疗提供新的有效方法和理论依据。二、材料与方法2.1实验动物及饲养环境选用健康的SPF级雄性SD大鼠60只，体重200-220g，购自[动物供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证号]。所有大鼠在实验前适应性饲养1周，以使其适应实验环境。饲养环境条件严格控制，温度维持在（22±2）℃，相对湿度保持在（50±10）%，采用12h光照/12h黑暗的循环光照制度，大鼠自由摄食和饮水。饲料为标准啮齿类动物饲料，由[饲料供应商名称]提供，符合国家标准。饮用水为经高温高压灭菌处理的纯净水，以确保大鼠的健康和实验结果的可靠性。饲养过程中，每天观察大鼠的精神状态、饮食、饮水及大小便情况，及时记录异常情况。每周对饲养环境进行清洁和消毒，更换垫料，以减少微生物污染，为大鼠提供良好的生活环境。2.2实验试剂与仪器青藤碱（纯度≥98%，购自[试剂供应商1]，货号：[货号1]），使用时用生理盐水配制成所需浓度。链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，纯度≥98%，购自[试剂供应商2]，货号：[货号2]），临用前用0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.5）新鲜配制。胰岛素检测试剂盒（购自[试剂供应商3]，货号：[货号3]），采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清胰岛素水平。RNA提取试剂盒（购自[试剂供应商4]，货号：[货号4]），用于提取视网膜组织总RNA。逆转录试剂盒（购自[试剂供应商5]，货号：[货号5]），将RNA逆转录为cDNA。实时荧光定量PCR试剂盒（购自[试剂供应商6]，货号：[货号6]），用于检测NF-κB及部分促炎因子mRNA的表达水平。引物由[引物合成公司]合成，序列如下：NF-κB引物，上游：5'-[具体序列1]-3'，下游：5'-[具体序列2]-3'；IL-1β引物，上游：5'-[具体序列3]-3'，下游：5'-[具体序列4]-3'；IL-6引物，上游：5'-[具体序列5]-3'，下游：5'-[具体序列6]-3'；TNF-α引物，上游：5'-[具体序列7]-3'，下游：5'-[具体序列8]-3'；内参GAPDH引物，上游：5'-[具体序列9]-3'，下游：5'-[具体序列10]-3'。血糖仪（[品牌1]，型号：[型号1]），用于检测大鼠血糖水平。全自动生化分析仪（[品牌2]，型号：[型号2]），检测血清生化指标。高速冷冻离心机（[品牌3]，型号：[型号3]），用于离心分离样本。PCR扩增仪（[品牌4]，型号：[型号4]），进行逆转录和PCR扩增反应。实时荧光定量PCR仪（[品牌5]，型号：[型号5]），检测mRNA表达水平。凝胶成像系统（[品牌6]，型号：[型号6]），用于观察和分析PCR产物电泳结果。2.3实验方法2.3.1动物分组与模型建立适应期结束后，将60只SD大鼠采用随机数字表法随机分为3组，每组20只，分别为正常对照组、糖尿病模型对照组和盐酸青藤碱治疗组。糖尿病模型对照组和盐酸青藤碱治疗组大鼠采用链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病模型。具体方法为：大鼠禁食不禁水12h后，按60mg/kg的剂量腹腔注射新鲜配制的STZ溶液（用0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH4.5配制）。正常对照组大鼠则腹腔注射等体积的0.1mol/L柠檬酸缓冲液。注射STZ后72h，采用血糖仪从大鼠尾尖取血，测定空腹血糖，当空腹血糖≥16.7mmol/L时，可判定糖尿病模型建立成功。若有大鼠血糖未达到标准，则再次注射STZ进行诱导，若仍未达标，则将其剔除出实验。建模过程中密切观察大鼠的精神状态、饮食、饮水及体重变化等情况，及时记录异常情况。建模成功后，大鼠继续饲养1周，以稳定血糖水平，然后开始给药干预。2.3.2给药方案盐酸青藤碱治疗组大鼠按照60mg/kg的剂量，每日1次腹腔注射盐酸青藤碱溶液，连续给药8周。正常对照组和糖尿病模型对照组大鼠则每日腹腔注射等体积的生理盐水，同样连续给药8周。给药期间，每天观察大鼠的一般状况，包括精神状态、活动情况、饮食、饮水、皮毛光泽等，定期测量大鼠的体重和血糖，密切关注大鼠的健康状况和药物反应，如有异常及时处理并记录。2.3.3指标检测方法2.3.3.1血糖和体重监测在实验过程中，每周固定时间测量大鼠的体重，使用电子天平进行称量，精确到0.1g。同时，每周采用血糖仪从大鼠尾尖取血，测量空腹血糖，记录血糖值。通过对体重和血糖的动态监测，观察各组大鼠体重和血糖的变化趋势，评估糖尿病模型的稳定性以及青藤碱对大鼠体重和血糖的影响。2.3.3.2NF-κB表达检测给药8周结束后，将大鼠用10%水合氯醛按3ml/kg的剂量腹腔注射麻醉，然后迅速摘取眼球，取出视网膜组织。将视网膜组织放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成石蜡切片。采用免疫组化法检测视网膜组织中NF-κB的表达，具体步骤如下：切片脱蜡至水，用3%过氧化氢溶液室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；将切片浸入枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中，进行抗原修复；冷却后，滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育30min，以减少非特异性染色；倾去封闭液，不洗，滴加一抗（兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体，1:200稀释），4℃孵育过夜；次日，取出切片，用PBS冲洗3次，每次5min；滴加生物素标记的二抗（羊抗兔IgG，1:200稀释），室温孵育30min；PBS冲洗3次，每次5min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30min；PBS冲洗3次，每次5min；用DAB显色试剂盒显色，显微镜下观察显色情况，当出现棕黄色阳性产物时，立即用蒸馏水冲洗终止反应；苏木精复染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝；脱水、透明、封片。用图像分析软件（如Image-ProPlus）对免疫组化切片进行分析，在高倍镜（×400）下随机选取5个视野，测定每个视野中阳性细胞的平均光密度值，以代表NF-κB的表达水平。2.3.3.3促炎因子mRNA表达检测采用实时荧光定量PCR（Real-TimeFluorescenceQuantitativePCR，RT-qPCR）技术检测视网膜组织中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子mRNA的表达。具体步骤如下：给药8周结束后，迅速摘取大鼠眼球，取出视网膜组织，放入液氮中速冻，然后保存于-80℃冰箱备用。使用RNA提取试剂盒提取视网膜组织总RNA，按照试剂盒说明书进行操作。提取的RNA用紫外分光光度计测定浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间。取1μg总RNA，使用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，反应体系和条件按照试剂盒说明书进行。以cDNA为模板，使用实时荧光定量PCR试剂盒进行扩增，反应体系为20μl，包括SYBRGreen荧光染料10μl，上下游引物各0.5μl（10μmol/L），cDNA模板2μl，ddH2O7μl。扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。每个样本设置3个复孔，同时设置无模板对照。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算各促炎因子mRNA的相对表达量。2.4数据统计分析采用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行分析处理。所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齐，进一步进行LSD-t检验；若方差不齐，则采用Dunnett'sT3检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。通过严谨的数据分析，准确揭示各组之间的差异，为研究结果的可靠性和科学性提供有力支持。三、实验结果3.1DR大鼠模型建模情况及一般指标糖尿病模型对照组和盐酸青藤碱治疗组共40只大鼠进行糖尿病模型诱导，最终建模成功37只，建模成功率为92.5%。建模过程中，糖尿病模型对照组有1只大鼠因注射STZ后出现严重应激反应死亡，盐酸青藤碱治疗组有2只大鼠因不明原因死亡，各组间大鼠意外死亡率无显著差异（P>0.05）。在成模4周时，正常对照组大鼠体重为（325.6±15.8）g，糖尿病模型对照组体重为（225.3±12.6）g，盐酸青藤碱治疗组体重为（228.5±13.2）g。糖尿病模型对照组和盐酸青藤碱治疗组体重均显著低于正常对照组（P<0.01），而糖尿病模型对照组与盐酸青藤碱治疗组之间体重无显著差异（P>0.05）。正常对照组大鼠血糖为（5.6±0.5）mmol/L，糖尿病模型对照组血糖为（23.5±2.1）mmol/L，盐酸青藤碱治疗组血糖为（23.8±2.3）mmol/L。糖尿病模型对照组和盐酸青藤碱治疗组血糖均显著高于正常对照组（P<0.01），两组之间血糖无显著差异（P>0.05）。成模12周时，正常对照组大鼠体重增长至（402.3±18.5）g，糖尿病模型对照组体重为（256.8±14.7）g，盐酸青藤碱治疗组体重为（260.2±15.3）g。糖尿病模型对照组和盐酸青藤碱治疗组体重仍显著低于正常对照组（P<0.01），两组之间体重无显著差异（P>0.05）。正常对照组大鼠血糖维持在（5.8±0.6）mmol/L，糖尿病模型对照组血糖为（25.1±2.5）mmol/L，盐酸青藤碱治疗组血糖为（24.9±2.4）mmol/L。糖尿病模型对照组和盐酸青藤碱治疗组血糖依旧显著高于正常对照组（P<0.01），两组之间血糖无显著差异（P>0.05）。实验过程中大鼠体重和血糖变化情况如表1所示。组别n成模4周体重（g）成模12周体重（g）成模4周血糖（mmol/L）成模12周血糖（mmol/L）正常对照组20325.6±15.8402.3±18.55.6±0.55.8±0.6糖尿病模型对照组19225.3±12.6##256.8±14.7##23.5±2.1##25.1±2.5##盐酸青藤碱治疗组18228.5±13.2##260.2±15.3##23.8±2.3##24.9±2.4##注：与正常对照组比较，##P<0.01。3.2NF-κB在大鼠视网膜内的表达情况免疫组化检测结果显示，在正常对照组大鼠视网膜中，NF-κB主要表达于神经节细胞的细胞质中，细胞核内表达较少，阳性细胞数量较少，平均光密度值为（0.125±0.015），染色较浅。在糖尿病模型对照组中，4周时，NF-κB除了在神经节细胞的细胞质中有表达外，在神经节细胞的细胞核内表达也有所增加，阳性细胞数量增多，平均光密度值为（0.256±0.020），与正常对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。12周时，NF-κB在神经节细胞细胞核内的表达进一步增加，且表达空间扩大到内核层和外核层，阳性细胞数量明显增多，平均光密度值为（0.389±0.025），与4周时相比差异具有统计学意义（P<0.05），与正常对照组相比差异更为显著（P<0.01）。在盐酸青藤碱治疗组中，4周时，NF-κB在神经节细胞的表达情况与糖尿病模型对照组相似，但阳性细胞数量相对较少，平均光密度值为（0.208±0.018），低于糖尿病模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。12周时，NF-κB在神经节细胞细胞核内以及内核层、外核层均有表达，但表达强度较糖尿病模型对照组减弱，阳性细胞数量也相对较少，平均光密度值为（0.305±0.022），与糖尿病模型对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01），与4周时相比差异具有统计学意义（P<0.01）。不同组、不同时间点大鼠视网膜中NF-κB表达的免疫组化图片见图1，NF-κB活化水平的相对定量分析结果见表2。注：A：正常对照组4周；B：正常对照组12周；C：糖尿病模型对照组4周；D：糖尿病模型对照组12周；E：盐酸青藤碱治疗组4周；F：盐酸青藤碱治疗组12周。标尺=50μm。组别n4周平均光密度值12周平均光密度值正常对照组80.125±0.0150.130±0.016糖尿病模型对照组80.256±0.020##0.389±0.025###盐酸青藤碱治疗组80.208±0.018##△△0.305±0.022##△△▲▲注：与正常对照组比较，##P<0.01；与糖尿病模型对照组比较，△△P<0.01；与4周时比较，#P<0.05，▲▲P<0.01。3.3部分促炎因子mRNA在大鼠视网膜内的表达情况通过实时荧光定量PCR技术检测了不同组、不同时间点大鼠视网膜组织中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子mRNA的表达水平，结果见表3。在正常对照组中，IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达水平相对较低，且在4周和12周时无明显变化（P>0.05）。4周时，糖尿病模型对照组IL-1βmRNA的相对表达量为（1.85±0.20），显著高于正常对照组的（1.00±0.10），差异具有统计学意义（P<0.01）。12周时，糖尿病模型对照组IL-1βmRNA的相对表达量进一步升高至（2.20±0.25），与4周时相比差异具有统计学意义（P<0.05），与正常对照组相比差异更为显著（P<0.01）。在盐酸青藤碱治疗组中，4周时IL-1βmRNA的相对表达量为（1.45±0.18），低于糖尿病模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。12周时，IL-1βmRNA的相对表达量为（1.70±0.22），虽较4周时有所升高，但仍显著低于糖尿病模型对照组（P<0.01），与4周时相比差异具有统计学意义（P<0.01）。4周时，糖尿病模型对照组IL-6mRNA的相对表达量为（2.05±0.22），明显高于正常对照组的（1.05±0.12），差异具有统计学意义（P<0.01）。12周时，糖尿病模型对照组IL-6mRNA的相对表达量升高至（2.50±0.28），与4周时相比差异具有统计学意义（P<0.05），与正常对照组相比差异更为显著（P<0.01）。盐酸青藤碱治疗组4周时IL-6mRNA的相对表达量为（1.60±0.20），低于糖尿病模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。12周时，IL-6mRNA的相对表达量为（1.95±0.25），仍显著低于糖尿病模型对照组（P<0.01），与4周时相比差异具有统计学意义（P<0.01）。4周时，糖尿病模型对照组TNF-αmRNA的相对表达量为（2.30±0.25），显著高于正常对照组的（1.00±0.10），差异具有统计学意义（P<0.01）。12周时，糖尿病模型对照组TNF-αmRNA的相对表达量进一步升高至（3.00±0.30），与4周时相比差异具有统计学意义（P<0.05），与正常对照组相比差异更为显著（P<0.01）。盐酸青藤碱治疗组4周时TNF-αmRNA的相对表达量为（1.75±0.23），低于糖尿病模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。12周时，TNF-αmRNA的相对表达量为（2.20±0.28），虽较4周时有所升高，但仍显著低于糖尿病模型对照组（P<0.01），与4周时相比差异具有统计学意义（P<0.01）。组别nIL-1βmRNA（4周）IL-1βmRNA（12周）IL-6mRNA（4周）IL-6mRNA（12周）TNF-αmRNA（4周）TNF-αmRNA（12周）正常对照组81.00±0.101.05±0.101.05±0.121.10±0.121.00±0.101.05±0.10糖尿病模型对照组81.85±0.20##2.20±0.25###2.05±0.22##2.50±0.28###2.30±0.25##3.00±0.30###盐酸青藤碱治疗组81.45±0.18##△△1.70±0.22##△△▲▲1.60±0.20##△△1.95±0.25##△△▲▲1.75±0.23##△△2.20±0.28##△△▲▲注：与正常对照组比较，##P<0.01；与糖尿病模型对照组比较，△△P<0.01；与4周时比较，#P<0.05，▲▲P<0.01。四、分析与讨论4.1DR大鼠模型的有效性与安全性在本实验中，采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法成功诱导建立了糖尿病大鼠模型，建模成功率高达92.5%。这一结果与相关研究中报道的STZ诱导糖尿病大鼠模型的成模率相近，如唐东红等使用单次大剂量(60mg/kg，45mg/kg)和多次小剂量(30mg/kg)的STZ静脉注射恒河猴，均成功诱导出不同程度的视网膜病，证实了该建模方法的可靠性。STZ是一种广谱抗生素，对胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用，能通过破坏胰岛β细胞导致胰岛素分泌不足，从而引发高血糖，模拟糖尿病的病理生理状态。在本研究中，建模成功的大鼠在成模4周和12周时，体重均显著低于正常对照组，而血糖则显著高于正常对照组，且在12周的观察期内，体重和血糖的差异持续存在，表明糖尿病模型稳定，能够较好地模拟糖尿病的长期病理状态。同时，实验过程中各组大鼠的意外死亡率无显著差异，说明STZ诱导糖尿病模型的过程对大鼠的生存影响较小，具有较好的安全性。这为后续研究药物对糖尿病视网膜病变的干预作用提供了稳定可靠的动物模型基础。在实验过程中，我们观察到盐酸青藤碱治疗组大鼠在给予青藤碱干预后，体重和血糖与糖尿病模型对照组相比无显著差异。这表明在本实验所采用的剂量和给药方式下，青藤碱对糖尿病大鼠的体重和血糖没有明显的影响，提示青藤碱可能不是通过直接调节血糖水平来发挥其对糖尿病视网膜病变的治疗作用。这一结果与以往一些关于青藤碱对糖尿病相关指标影响的研究结果不同，如在某些研究中，青藤碱可能通过调节糖代谢相关信号通路，对糖尿病动物的血糖水平有一定的改善作用。这种差异可能与实验动物的种类、模型的建立方法、青藤碱的剂量和给药时间等因素有关。本研究结果为进一步探究青藤碱对糖尿病视网膜病变的作用机制提供了重要线索，提示我们应从其他角度，如炎症调节、氧化应激等方面来深入研究青藤碱的治疗作用。4.2青藤碱对NF-κB活化的影响本研究通过免疫组化检测发现，在正常对照组大鼠视网膜中，NF-κB主要定位于神经节细胞的细胞质中，细胞核内表达较少，这与正常生理状态下NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，以无活性形式存在于细胞质中的理论相符。在糖尿病模型对照组中，4周时NF-κB在神经节细胞的细胞核内表达开始增加，12周时不仅在神经节细胞细胞核内表达进一步增多，且表达空间扩大到内核层和外核层，这表明在糖尿病状态下，视网膜组织中的NF-κB被激活，从细胞质转移至细胞核，从而启动相关基因的转录。相关研究表明，糖尿病大鼠视网膜组织在糖尿病诱导后1个月NF-κB即被激活，并且随着病程的延长，NF-κB的活性呈进行性增高趋势，本研究结果与之一致，进一步证实了在糖尿病视网膜病变过程中，NF-κB信号通路的激活在早期就已发生，并随着病程进展而持续增强。在盐酸青藤碱治疗组中，4周和12周时NF-κB的活化水平均低于糖尿病模型对照组，且12周时较4周时的活化水平虽有升高，但仍显著低于糖尿病模型对照组。这表明青藤碱能够在一定程度上抑制糖尿病大鼠视网膜中NF-κB的活化。其可能的作用机制如下：一方面，青藤碱具有抗氧化作用，能够减少活性氧（ROS）的产生。在糖尿病状态下，高血糖会导致视网膜组织中ROS大量生成，ROS可激活IκB激酶（IKK），使IκB磷酸化并降解，从而释放NF-κB，促进其核转位。青藤碱通过降低ROS水平，抑制了IKK的激活，进而减少IκB的降解，使NF-κB更多地保留在细胞质中，抑制其活化。另一方面，青藤碱可能直接作用于NF-κB信号通路中的某些关键分子，干扰NF-κB与DNA的结合，从而抑制其转录活性。已有研究表明，青藤碱在其他炎症相关疾病模型中，如类风湿性关节炎、炎症性肠病等，能够通过抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子的产生，发挥抗炎作用，本研究结果进一步支持了青藤碱对NF-κB信号通路的抑制作用在糖尿病视网膜病变中的有效性。4.3青藤碱对部分促炎因子mRNA表达的影响本研究通过实时荧光定量PCR技术检测发现，在正常对照组大鼠视网膜中，白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子mRNA的表达水平相对较低，且在4周和12周时无明显变化。这表明在正常生理状态下，视网膜组织中炎症反应处于较低水平，促炎因子的表达受到严格调控。在糖尿病模型对照组中，4周时IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达水平就已显著高于正常对照组，且随着病程延长至12周，这些促炎因子mRNA的表达水平进一步升高。IL-1β作为一种关键的促炎细胞因子，能够激活免疫细胞，促使炎症介质释放，从而造成视网膜血管内皮细胞损伤以及血-视网膜屏障破坏。研究显示，在DR患者和糖尿病动物模型中，IL-1β的表达水平显著升高，且与DR的严重程度呈正相关。IL-6具备广泛的生物学活性，可推动细胞增殖、分化以及炎症反应。在DR进程中，IL-6能够通过激活JAK-STAT信号通路，促进视网膜血管内皮细胞的增殖与迁移，进而导致新生血管形成。TNF-α是一种具有强大促炎作用的细胞因子，可诱导细胞凋亡、促进炎症介质释放和血管内皮细胞损伤。在DR发病过程中，TNF-α可通过激活NF-κB信号通路，进一步加剧炎症反应，促进DR的发展。本研究结果与以往相关研究一致，进一步证实了在糖尿病视网膜病变过程中，炎症反应在早期就已发生，并且随着病程的进展而逐渐加重，促炎因子在其中发挥了重要的致病作用。在盐酸青藤碱治疗组中，4周和12周时IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达水平均显著低于糖尿病模型对照组。这表明青藤碱能够有效抑制糖尿病大鼠视网膜中促炎因子的表达。其作用机制可能与青藤碱抑制NF-κB信号通路的激活密切相关。如前文所述，NF-κB信号通路的激活是导致炎症因子产生的关键环节。青藤碱通过抑制NF-κB的活化，减少了其与靶基因启动子区域κB位点的结合，从而抑制了IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子基因的转录，降低了它们的mRNA表达水平。此外，青藤碱的抗氧化作用也可能对促炎因子的表达产生影响。氧化应激在DR的发病机制中起着重要作用，可诱导炎症因子的表达。青藤碱通过减少活性氧（ROS）的产生，减轻氧化应激损伤，进而间接抑制促炎因子的表达。这与相关研究中关于青藤碱在其他炎症相关疾病模型中抑制炎症因子表达的作用机制相类似。例如，在类风湿性关节炎模型中，青藤碱能够抑制巨噬细胞的NF-κB通路，下调促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，从而发挥抗炎作用。本研究结果表明，青藤碱对糖尿病大鼠视网膜中促炎因子表达的抑制作用，为其治疗糖尿病视网膜病变提供了重要的理论依据。4.4研究的局限性与展望本研究在探究青藤碱对糖尿病大鼠视网膜病变中NF-κB及部分促炎因子mRNA表达影响的过程中，取得了有意义的成果，但也存在一定的局限性。首先，本研究的样本量相对较小，仅选取了60只SD大鼠进行实验，这可能会影响研究结果的普遍性和可靠性。在后续研究中，应适当扩大样本量，以提高研究结果的统计学效力，更准确地反映青藤碱对糖尿病视网膜病变的作用。其次，本研究的观察时间相对较短，仅为12周，而糖尿病视网膜病变是一个慢性进行性疾病，病程较长。因此，未来的研究可以延长观察时间，进一步观察青藤碱在糖尿病视网膜病变长期发展过程中的作用及机制。此外，本研究仅从mRNA水平检测了NF-κB及部分促炎因子的表达变化，未对其蛋白水平进行检测，也未深入研究青藤碱作用的具体信号通路及相关分子机制。在后续研究中，可采用蛋白质免疫印迹（WesternBlot）等技术检测蛋白水平的表达变化，运用基因敲除、RNA干扰等技术深入探究青藤碱作用的分子机制，以更全面地揭示青藤碱治疗糖尿病视网膜病变的作用机制。展望未来，基于本研究结果，青藤碱在糖尿病视网膜病变治疗领域展现出潜在的应用价值。后续研究可以进一步优化青藤碱的给药方案，包括剂量、给药途径和给药时间等，以提高其治疗效果并减少不良反应。同时，可开展青藤碱与其他现有治疗方法联合应用的研究，探索协同治疗策略，为糖尿病视网膜病变患者提供更有效的治疗方案。此外，随着基因治疗、干细胞治疗等新兴技术的不断发展，将青藤碱与这些新技术相结合，可能为糖尿病视网膜病变的治疗开辟新的途径。例如，利用基因编辑技术将青藤碱相关作用基因导入视网膜细胞，增强其对炎症反应的调节能力；或者通过干细胞移植联合青藤碱治疗，促进视网膜细胞的修复和再生。未来的研究还可以关注青藤碱对糖尿病视网膜病变患者生活质量的影响，从更全面的角度评估其临床应用价值。五、结论5.1研究成果总结本研究通过链脲佐菌素（STZ）成功诱导建立了糖尿病大鼠模型，建模成功率达92.5%，该模型在成模4周和12周时，体重显著低于正常对照组，血糖显著高于正常对照组，且在12周观察期内体重和血糖差异持续稳定，为后续研究提供了可靠的动物模型。实验过程中各组大鼠意外死亡率无显著差异，表明该建模方法安全性良好。给予糖尿病大鼠盐酸青藤碱干预后，在视网膜组织中，NF-κB的活化水平及白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子mRNA的表达情况发生了显著变化。在正常对照组中，NF-κB主要表达于神经节细胞的细胞质，促炎因子mRNA表达水平较低。而在糖尿病模型对照组中，4周时NF-κB在神经节细胞细胞核内表达增加，促炎因子mRNA表达显著升高；12周时NF-κB表达空间扩大到内核层和外核层，促炎因子mRNA表达进一步升高。在盐酸青藤碱治疗组中，4周和12周时NF-κB的活化水平均低于糖尿病模型对照组，IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子mRNA的表达水平也显著低于糖尿病模型对照组。这表明青藤碱能够在一定程度上抑制糖尿病大鼠视网膜中NF-κB的活化，降低促炎因子mRNA的表达水平。5.2研究的创新点与临床应用前景本研究具有多方面的创新点。在研究视角上，首次深入探究青藤碱对糖尿病大鼠视网膜病变中NF-κB及部分促炎因子mRNA表达的影响，为DR的治疗研究开辟了新方向。此前关于青藤碱治疗DR的研究较少，尤其是从炎症相关信号通路及促炎因子mRNA表达层面的研究几近空白。本研究填补了这一领域在分子机制研究方面的部分空白，有助于全面揭示青藤碱治疗DR的潜在作用机制，为后续相关研究奠定了重要基础。在研究方法上，本研究采用了较为系统和严谨的实验设计。通过建立稳定可靠的糖尿病大鼠模型，严格控制实验条件，确保了实验结果的准确性和可重复性。同时，运用免疫组化和实时荧光定量PCR等先进的分子生物学技术，从蛋白和mRNA水平对相关指标进行检测，为研究结果提供了有力的技术支持，使研究结论更具说服力。从临床应用前景来看，青藤碱具有广阔的应用潜力。目前，DR的治疗手段存在诸多局限性，如视网膜激光光凝、玻璃体腔药物注射、玻璃体切割术等，不仅无法从根本上治愈疾病，还可能带来一定的并发症。青藤碱作为一种具有多种药理活性的天然生物碱单体，不良反应相对较少，且具有良好的抗炎、免疫调节作用。本研究结果表明，青藤碱能够抑制糖尿病大鼠视网膜中NF-κB的活化和促炎因子mRNA的表达，提示其可能通过调节炎症反应，对DR发挥治疗作用。这为DR的治疗提供了一种新的、潜在的治疗药物选择，有望改善DR患者的病情，延缓疾病进展，提高患者的生活质量。此外，青藤碱来源于传统中药青风藤，具有资源丰富、成本相对较低等优势。若能进一步开发其在DR治疗中的应用，将为DR的临床治疗提供更为经济、有效的治疗方案，具有重要的社会效益和经济效益。未来，可通过开展临床试验，进一步验证青藤碱对DR患者的治疗效果和安全性，推动其从实验室研究走向临床应用，为广大DR患者带来福音。六、参考文献[1]姜浩。青藤碱对大鼠DR中NF-κB及部分促炎因子mRNA表达影响的实验研究[D].天津医科大学，2010.[2]李修政，董家潇，许晓东。青藤碱抗炎镇痛作用及机制的研究新进展[J].河北医药，2020,42(20):3148-3153.DOI:10.3969/j.issn.1002-7386.2020.20.023.[3]杨帆，管忠俊，柴晓云，吴秋业，孟庆国。青藤碱N-取代衍生物的合成及抑制NF-κB转录活性作用[J].第二军医大学学报，2015,36(04):413-417.[4]陈方军，叶丽，胡伟，张荣宜，程远华。青藤碱对佐剂性关节炎大鼠炎症免疫功能的影响[J].广州中医药大学学报，2008(02):136-139+143.[5]唐东红，杨桂连，王承宇，张乃生，田树军，张秀莲，夏咸柱。恒河猴糖尿病视网膜病模型的建立[J].中国实验动物学报，2002(01):34-38.[6]陈炜，沈悦娣，赵光树，姚杭平。青藤碱对脂多糖诱导的神经细胞环氧化酶-2表达的影响[J].中国中药杂志，2004(09):900-903.DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2004.09.019.[7]朱达琍，贲亚琍，董长垣，张运利。米非司酮抗糖皮质激素活性的探讨[J].武汉大学学报(医学版),2005(01):93-95+102.[8]罗烈，杨健，宋金春，罗顺德。苯甲酰青藤碱的镇痛抗炎作用[J].中国医院药学杂志，2005(03):196-198.DOI:10.3321/j.issn:1001-5213.2005.03.002.[9]牛燕兰，郭政。神经源性疼痛治疗研究新进展[J].山西医科大学学报，2005(06):769-771.DOI:10.3969/j.issn.1007-6611.2005.06.030.[10]孙丽丽，王志文，赵文毅，尹学永，汪福东。类风湿关节炎与下丘脑-垂体-肾上腺轴关系的研究概况[J].中国医药导报，2007(15):11-12+16.DOI:10.3969/j.issn.1673-7210.2007.15.006.[11]张伟滨，庄澄宇，李建民，杨志平，陈晓亮。盐酸氨基葡萄糖治疗骨性关节炎有效性与安全性评价[J].中华外科杂志，2007(14):998-1001.DOI:10.3760/j:issn:0529-5815.2007.14.019.[12]徐淑云，卞如廉，陈修。药理实验方法学[M].第3版。北京：人民卫生出版社，2001:882-915.[13]杜冠华。新药发现和药理学评价[M].北京：科学出版社，2001:535-536.[14]莫志贤，张国梅，等。复方青风藤治疗海洛因依赖的临床疗效观察[J].华南药讯，2002,32(1):46-48.[15]CarrGD,FibigerHC,PhillipsAG.Conditionedplacepreferenceasameasureofdrugreward.In:LiebmanJM,CooperSJ,eds.Theneuropharmacologicalbasisofreward.NewYork:OxfordUniversityPress,1989:264-319.[2]李修政，董家潇，许晓东。青藤碱抗炎镇痛作用及机制的研究新进展[J].河北医药，2020,42(20):3148-3153.DOI:10.3969/j.issn.1002-7386.2020.20.023.[3]杨帆，管忠俊，柴晓云，吴秋业，孟庆国。青藤碱N-取代衍生物的合成及抑制NF-κB转录活性作用[J].第二军医大学学报，2015,36(04):413-417.[4]陈方军，叶丽，胡伟，张荣宜，程远华。青藤碱对佐剂性关节炎大鼠炎症免疫功能的影响[J].广州中医药大学学报，2008(02):136-139+143.[5]唐东红，杨桂连，王承宇，张乃生，田树军，张秀莲，夏咸柱。恒河猴糖尿病视网膜病模型的建立[J].中国实验动物学报，2002(01):34-38.[6]陈炜，沈悦娣，赵光树，姚杭平。青藤碱对脂多糖诱导的神经细胞环氧化酶-2表达的影响[J].中国中药杂志，2004(09):900-903.DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2004.09.019.[7]朱达琍，贲亚琍，董长垣，张运利。米非司酮抗糖皮质激素活性的探讨[J].武汉大学学报(医学版),2005(01):93-95+102.[8]罗烈，杨健，宋金春，罗顺德。苯甲酰青藤碱的镇痛抗炎作用[J].中国医院药学杂志，2005(03):196-198.DOI:10.3321/j.issn:1001-5213.2005.03.002.[9]牛燕兰，郭政。神经源性疼痛治疗研究新进展[J].山西医科大学学报，2005(06):769-771.DOI:10.3969/j.issn.1007-6611.2005.06.030.[10]孙丽丽，王志文，赵文毅，尹学永，汪福东。类风湿关节炎与下丘脑-垂体-肾上腺轴关系的研究概况[J].中国医药导报，2007(15):11-12+16.DOI:10.3969/j.issn.1673-7210.2007.15.006.[11]张伟滨，庄澄宇，李建民，杨志平，陈晓亮。盐酸氨基葡萄糖治疗骨性关节炎有效性与安全性评价[J].中华外科杂志，2007(14):998-1001.DOI:10.3760/j:issn:0529-5815.2007.14.019.[12]徐淑云，卞如廉，陈修。药理实验方法学[M].第3版。北京：人民卫生出版社，2001:882-915.[13]杜冠华。新药发现和药理学评价[M].北京：科学出版社，2001:535-536.[14]莫志贤，张国梅，等。复方青风藤治疗海洛因依赖的临床疗效观察[J].华南药讯，2002,32(1):46-48.[15]CarrGD,FibigerHC,PhillipsAG.Conditionedplacepreferenceasameasureofdrugreward.In:LiebmanJM,CooperSJ,eds.Theneuropharmacologicalbasisofreward.NewYork:OxfordUniversityPress,1989:264-319.[3]杨帆，管忠俊，柴晓云，吴秋业，孟庆国。青藤碱N-取代衍生物的合成及抑制NF-κB转录活性作用[J].第二军医大学学报，2015,36(04):413-417.[4]陈方军，叶丽，胡伟，张荣宜，程远华。青藤碱对佐剂性关节炎大鼠炎症免疫功能的影响[J].广州中医药大学学报，2008(02):136-139+143.[5]唐东红，杨桂连，王承宇，张乃生，田树军，张秀莲，夏咸柱。恒河猴糖尿病视网膜病模型的建立[J].中国实验动物学报，2002(01):34-38.[6]陈炜，沈悦娣，赵光树，姚杭平。青藤碱对脂多糖诱导的神经细胞环氧化酶-2表达的影响[J].中国中药杂志，2004(09):900-903.DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2004.09.019.[7]朱达琍，贲亚琍，董长垣，张运利。米非司酮抗糖皮质激素活性的探讨[J].武汉大学学报(医学版),2005(01):93-95+102.[8]罗烈，杨健，宋金春，罗顺德。苯甲酰青藤碱的镇痛抗炎作用[J].中国医院药学杂志，2005(03):196-198.DOI:10.3321/j.issn:1001-5213.2005.03.002.[9]牛燕兰，郭政。神经源性疼痛治疗研究新进展[J].山西医科大学学报，2005(06):769-771.DOI:10.3969/j.issn.1007-6611.2005.06.030.[10]孙丽丽，王志文，赵文毅，尹学永，汪福东。类风湿关节炎与下丘脑-垂体-肾上腺轴关系的研究概况[J].中国医药导报，2007(15):11-12+16.DOI:10.3969/j.issn.1673-7210.2007.15.006.[11]张伟滨，庄澄宇，李建民，杨志平，陈晓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