CN114340687B 无洗涤剂去细胞化细胞外基质的制备方法和3d打印用生物墨水 （波尔比奥尼卡公司）

2022.01.24PCT/IB2020/0568562020.07.21WO2021/014359EN2021.01.28US2015050247A1,2015.0无洗涤剂去细胞化细胞外基质的制备方法本发明涉及一种无洗涤剂去细胞化ECM的制化ECM、初级生物墨水的制备方法、初级生物墨含初级生物墨水和/或脉管生物墨水的三维结构2-在包含1×PBS的缓冲洗涤剂溶液中温育碎片器官，其中所述缓冲洗涤剂溶液包含拌的条件下在低于室温的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将所述碎片器官转移到-在包含1×PBS的第一缓冲洗涤溶液中温育所述碎片器官，其中所述第一缓冲洗涤溶-在包含1×PBS的第二缓冲洗涤溶液中温育所述碎片器官，其中所述第二缓冲洗涤溶-通过混合制备包含5％至50％(g/ml)的根据权利要求1限定的方法获得的dECM粉末和-在7℃至10℃的温度温育糊料至少24小时；水的层粘连蛋白，浓度为0.001至0.100mg/mL初级生物墨水的胶原I，浓度为0.005至0.175mg/mL初级生物墨水的胶原IV，浓度为3至300μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至3的维生素A，浓度为50μM至100μM的维生素B1，浓度为1μM至10μM的维生素B3，浓度为10至长因子：浓度为10至30ng/mL初级生物墨水的VEGF，浓度为10至20ng/mL初级生物墨水的6.根据权利要求4或5所述的初级生物墨水，所述墨水包含至少一种选自以下的添加a)制备补充有CMC的微生物明胶溶液，包括在PBS形式的缓冲溶液中制备1％至2％(g/ml)的微生物明胶溶液，此制备是通过在搅拌的条件下在50℃和65℃之间的温度将微生物b)制备5％至10％(g/ml)的dECM溶液，此制备是通过在轻柔搅拌的条件下将根据权利要求1限定的方法获得的dECM粉末，添加到(i)在步骤a)中获得的补充有CMC的微生物明胶溶液或(ii)缓冲溶液或(iii)细胞c)将所得溶液在不超过37℃的温度超声处理0.5小时至2.0小时；a)制备补充有CMC的微生物明胶溶液，包括在PBS形式的缓冲溶液中制备1％至2％(g/ml)的微生物明胶溶液，此制备是通过在搅拌的条件下在50℃和65℃之间的温度将微生物b)制备5％至10％(g/ml)的dECM溶液，此制备是通过在轻柔搅拌的条件下将根据权利要求1限定的方法获得的dECM粉末，添加到(i)在步骤a)中获得的补充有CMC的微生物明胶溶液或(ii)缓冲溶液或(iii)细胞c)将混合物在100℃煮15分钟至30分钟；9.一种脉管生物墨水，所述墨水包含经超声处理或经煮制处理的根据权利要求2限定49所述的脉管生物墨水层布置在根据权利要求4限5[0001]本发明涉及一种无洗涤剂去细胞化ECM的制备方法、粉末形式和液体形式的无洗[0004]文献包括许多关于选择具有最佳性质的适当生物墨水组合物用于组织工程应用[0005]随后的研究小组试图使用添加甲基丙烯酸明胶(GelMa)和光引发剂(即LAP)(苯[0006]专利说明KR20180125776描述了一种包含dECM粉末和水凝胶的生物墨水组合物。[0007]Falguni等人(2014)开发了组织特异性dECM生物墨水，包含脂肪、软骨和心脏组[0008]许多研究小组已经对涉及器官去细胞化以获得dECM作为生物墨水成分的实验进6活性剂和超活性溶液的去饱和溶液处理。0.5％的TritonX-100(TritonX-100)可用作表[0009]MohamedAli及其同事构建了包含ECM源性生物墨水的光交联肾脏[1]。猪的整个肾脏结构体显示了天然肾组织的结构和功能特征。组织特异性ECM源性生物墨水可增强细[0010]Mirmalek-Sani等人(2013年)介绍了猪胰腺的去细胞化过程，以创建人类干细胞通过去细胞化获得的ECM中洗涤剂残留量或其含量测定方法的结果。在先前公布的各种组[0015]-在优选包含1×PBS的第一缓冲洗涤溶液中温育碎片器官，其中第一缓冲洗涤溶[0016]-在包含DNA酶的脱氧核糖核酸酶溶液中温育碎片器官，优选浓度为0.0001％至[0017]-在优选包含1×PBS的第二缓冲洗涤溶液中温育碎片器官，其中第二缓冲洗涤溶7[0020]-在0.0010mbar(0.1Pa)且-7[0033]-在7℃至10℃的温度温育糊料至少24小时；8[0037]dECM的使用能够复制机体的细胞外条件，因此提供具有天然组织特征的生物打内的热交联的额外可能性来获得适当的生物墨水粘度并维持打印结构体的稳定三维结构优选0.084mg/mL生物墨水的层粘连蛋白，浓度为0.001至0.100mg/mL生物墨水、优选的生长因子：浓度为10至30ng/mL生物墨水、优选30ng/mL生物墨水的VEGF，浓度为10至生物墨水的TGF-β,浓度为0至100ng/mL生物墨水、优选10ng/mL生物墨水的白细胞介素[0044]维生素A-ATRA(全反式维甲酸)作为维生素A的代谢物之一，具有促血管生成作9[0045]维生素B1-苯磷硫胺(硫胺素衍生物)抑制蛋白依赖性B激酶途径(PKB/Akt)上的细[0050]成纤维细胞生长因子(FGF)增加内皮细胞迁移并促进毛细血管形态发生。它还增[0055]胰岛负责产生胰岛素。添加内皮细胞以在打印的三维结构中更快地形成脉管网[0057]a)可选地制备补充有CMC的微生物明胶溶液，包括在优选PBS的缓冲溶液中制备物明胶溶液或(ii)缓冲溶液或(iii)细胞培[0059]c)将所得溶液在不超过37℃[0060]d)可选地添加至少一种选自以下的动物源性或人源性添加剂：浓度为3至300μg/[0062]a)可选地制备补充有CMC的微生物明胶溶液，包括在优选PBS的缓冲溶液中制备生物墨水中获得0.2％至2％(v/v)CMC的最终浓度，并将溶液冷却至等于或低于40℃的温胶溶液或(ii)缓冲溶液或(iii)细胞培[0065]d)可选地添加至少一种选自以下的动物源性或人源性添加剂：浓度为3至300μg/在确保在相对较低的温度(15℃至20℃)打印时，生物墨水的粘度适当，并在37℃的培养温[0068]微生物明胶提供了理想的稠度并提高了细胞存活率。CMC增加粘度并稳定生物墨生物墨水和根据本发明第八方面的脉管生物墨水在3D生物打印过程中以5mm/s至50mm/s的[0073]本发明能够获得27×17×2.5mm大小的小叶加不同比例的GelMa和HAMA的混合[0095]下一阶段-去细胞化-主要包括施用脱氧核糖核酸酶溶液(1×PBS中0.0002％(w/[0096]去细胞化过程结束后，将获得的支架片。将材料在-32℃的温度和0.31mbar(31Pa)压力下冷冻干燥26小时。最终干燥过程在喷雾的辅助吸入室的激光衍射光谱仪Spraytec(Malvern，英国)测试流动梯度中的粉末粒有小于或大于中值的颗粒都具有相同的体积[0102]D[4][3]-被定义为颗粒直径的四次幂之和与颗粒直径的三次幂之和的比率的直样品总体积10％的最小颗粒的直径为小于28.23±1.48μm(Dv(10))，而区分总min和270dm3/min不会显著影响体积粒径分布中值或Dv(10)值。仅观察到最大颗粒的尺寸(对于100dm3/min的气流)增加到3.3±0.4(对于2的遗传物质浓度的QuantiTPicoGreendsDNA试剂和试[0125]鉴于溶解的dECM呈白色，样品用三种浓度的胶原酶处理：4.3953PZ活性单位/g[0126]样品在1000rpm的恒定振动作用的条件下在37℃搅拌24小时。对获得的溶液进行[0127]重要的是，在经浓度为43.953PZ/gdECM的胶原酶处理的dECM溶液中发现剩余明dECM的43.953PZ/g的浓度足以从样品中提取所有剩余的Trito[0133]在第一步中，分析了去细胞化基质中脂肪组成在胰腺去细胞制备功能中的差[0136]使用机械挤压研磨法允许显著降低所获得的细胞外基质中的TritonX-100含在4℃的温度在PBS中洗涤去细胞化材料72小时。[0141]为了获得dECM溶液(dECM(r))，建立了使用胃蛋白酶和盐酸(HCl)的dECM粉末[0160]获得的初级生物墨水的组成如下：40％至50％(v/v)的dECM(r)、2.763％至2分钟额外搅拌一次溶液。根据变型，将先前制备的PBS基羧甲基纤维素(CMC)溶液(2％至的瓶子放在配有加热至100℃的加热板的磁力搅拌器上，在这里将混合物煮制处理15分钟[0177]表3.温度(25℃至37℃)对dECM(r)浊度的影响02109.7<η<5611.913026.9<η<4040.73287.6<η<4691.3液的粘度值低于非无菌粉末溶液。在较低dECM(r)浓度下使用经研磨的粉末和经切割的粉[0185]结果总结表明，使用dECM糊料对于获得具有适当稠度的生物墨水基底是必要末对各成分与细胞和胰岛的混合物进行生物打印[0196]向dECM糊料中添加补充化学物质可使细丝表面的形貌变得平滑。此外，当添加[0198]胶凝过程的强度通过使用专门设备在广泛的温度和其效果的暴露时间范围内识[0201]随着所谓驱动力(即葡萄糖浓度)的增加，延迟时间和达[0210]在25℃至37℃范围内的温度升高和37℃温度时的暴露时间变长会导致经煮制处[0213]表10.在温度37℃时的暴露时间对用于有专利导管网络的打印结构体的高度多孔结构中观察到生物墨水细丝的松[0240]测试了添加细胞外基质蛋白对胰岛功能和活力的影响。为此目的，制备了由并将胰岛在其中温育72小时[图10]。在添加GelMa的培养基中生长的胰岛分泌相似或更多[0246]测试了胰岛活力如何可能受到甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸透明质酸的混合物胰岛相比，在添加有G3:2H比率的混合物的培养基中生长的胰岛分泌更多或更少量的胰岛G2:3H比率的混合物的培养基中生长的胰岛分泌的胰岛素明显少于对照胰岛，这表明在给定浓度的GelMa和HAMA混合物对胰岛活力中3.33％v/v的经切割或经研磨的ECM添加到培养基中，并将胰岛在其中温育72小时[图响。添加有经切割的ECM的培养基显著减少胰岛素分泌，这可能表明对胰岛活力有不利影[0251]为此目的，将7.8％v/v的GelMa或0.78％v/v的HAMA或4.68％v/v的GelMa和[0252]用包含GelMa添加的初级生物墨水打印的小叶中的胰岛在打印过程后显示出产生长的对照胰岛(未经3D生物打印)相比，向生物墨水中添加HAMA以及GelMa和HAMA的混合物好的解决方案是使用甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸透明质酸的混合物用于生物打印过程[0254]为了可视化并确认ECM四级结构在包含初级生物墨水的打印结构体中的保存，使[0256][1]MohamedAli,AnilKumarPR,JamesJ.Yoo,FatenZahran,AnthonyAtala,andSangJinLee(2019).APhoto-CrosslinkableKidneyECM-DerivedBioinkAcceleratesRenalTissueFormation,Adv.HealthcareMater,1800992,DOI:10.1002/adhm.201800992[0257][2]PengfeiChen,LinZheng,YiyunWang,MinTao,ZiangXie,ChenXia,ChenhuiGu,JiaxinChen,PengchengQiu,ShengMei,LeiNing,YilingShi,ChenFang,ShunwuFanandXianfengLin(2019).Desktop-stereolithography3Dprintingofaradiallyorientedextracellularmatrix/mesenchymalstemcellexosomebioinkforosteochondraldefectregeneration,Theranostics.9(9):2[0258][3]FalguniPati,JinahJang,Dong-HeonHa,SunJin-HyungShim，Deok-HoKim&Dong-WooCho(2014).Printingthree-dimensionaltissueanalogueswithdecellularizedextracellularmatrixbioink,Naturecommunications,5:3935,DOI:DOI:10.1038/ncomms493510.DevelopmentofLiverDecellularizedExtracellularMatrixBioinkforThree-DimensionalCellPrinting-BasedLiverTissueEngineering.Biomacromolecules,18M.E.,Odorico,J.S.(2018).Extracellularmatrixscaffoldandhydrogelderivedfromdecellularizedanddelipidizedhumanpancreas.Sci