CN114341926B 用于高性能电子显微镜的方法 （得克萨斯大学体系董事会）

2022.03.07PCT/US2020/04567320WO2021/030297EN2021.02.18US2019129026A1,2019.05.02该方法包括获得具有一个或多个已知特性的内述多个电子显微镜图像是针对多个光学条件和针对多个协调的波束-图像移位而获得的。除了析(KCCA)来预测被成像的区域中的每个点的像21.一种用于校正电子显微镜(EM)图像中的一个或多个图像像差的方法，其特征在于，获得内部参考网格样本的多个EM图像，所述多个EM图像是使用电子通过校正所述多个EM图像的样本漂移以产生EM显通过使用一个或多个去卷积系数对变换的图像去卷积来生成去卷积的通过计算所述经滤波的去卷积的图像的逆傅里叶变换以产生校正了像差的EM显微照使用一个或多个去卷积系数执行迭代优化过程，直到基于核规范相关分析来确定能够操作地预测像差获得校准检查网格样本的一个或多个EM图像，所述校准检查网格通过将所述像差校正函数应用于所述一个或多个EM图像以产生校正了像将所述校正了像差的EM图像中的一个或多个特征与校准检查网格样本的一个或多个所述迭代优化过程包括至少重复逆傅里叶变换的计算，直到基于生成所述EM显微照片包括对准以及运动校所述内部参考网格样本包括分布在支撑体上的无定立分量分析(ICA)进行优化的函数来量化强度34[0002]本发明是在由美国国立卫生研究院授予的拨款号R01GM117080和R01GM118619下[0004]本申请要求于2019年8月9日提交的美国临时申请序列No.62/885,154的优先权权生物物质的高分辨率结构的结构生物学的方法所需的高度组织形式的分子物质(例如，晶自动化。电子显微镜对准所固有的是这些像差和失真最小化的成像特性仅在小区域内实[0009]当前公开的方法、系统和装置提供了在包括cryo-EM在内的电子显微镜(EM)中的使得一台仪器可以在数据获取吞吐量上实现多倍的提升；(3)消除在显微镜对准方面经验不足的用户的挫败感或消除对于高水平专业知识的需求；以及(4)启用涉及相位板和波束5及其任何组合；(b)通过对准和运动校正多个EM图像来校正多个EM图像的样本漂移以产生[0013]该方法还可以包括(j)使用在(i)中获得的最优去卷积系数和(a)中使用的多个光学条件和多个协调的波束-图像移位的内核规范相关分析(KCCA)来确定为成像区域中的每微镜(EM)图像，该多个电子显微镜图像是针对多个光学条件和针对多个协调的波束-图像定形材料包括五个或更少原子层的厚度；(b)通过对准和运动校正多个EM图像来校正多个间的所有信息以产生经滤波的FT图像；(f)计算经滤波的FT图像的逆FT以产生经滤波的EM[0015]该方法还可以包括(j)使用在(i)中获得的度量张量的内核规范相关分析(KCCA)6和(a)中使用的多个光学条件来确定为成像区域中的每个点预测几何失真的像差校正函本具有与内部参考网格样本的一个或多个已知特性中的至少一个不同的一个或多个已知图像；以及(m)基于校正了像差的EM图像中的一个或多个特征对应于校准检查网格样本的一个或多个已知特性的比较来确定像差校正函[0018]图2描绘了示出根据本发明性构思的实施例的257张显微照片的波束倾斜细化的倾斜导致的未校正的彗形像差严重到足以将分辨率限[0020]图4描绘了根据本发明性构思的实施例的在预览图像和用于数据收集的更高放大[0021]图5描绘了根据本发明性构思的实施例的对具有彗差、三叶形和各向异性放大倍率校正的电子显微镜公共图像档案(EMPIAR)沉积物10185和1018[0022]图6是示出根据本发明性构思的实施例的独立参数(即，观察条件及其非线性函数)与观察到的相移和几何失真像差之间的内核规范相关分析(KCCA)的元素的示意图；以及[0023]图7是描绘根据本发明性构思的实施例的用于校正电子显微镜图像中的一个或多可以包括在多个光学条件下和在多个协调的波束图像移位处获得具有一个或多个已知特7成可操作以接收具有适合用作根据当前公开的方法的内部参考网格样本的特性的无定形[0027]分布在固体支撑体上的无定形材料可以具有五个或更少原子层的厚度。优选地，并且层厚度可以通过电流和真空来控制。在至少一些情况下，无定形材料可以是例如金、[0028]可以使用波束-图像移位方法收集多个协调的波束-图像移位。波束-图像移位方[0029]目前公开的用于校正电子显微镜图像中的一个或多个图像像差的方法还可以包[0030]然后使用从一系列去卷积系数值中选择的预定去卷积系数8[0032]该方法还可以包括计算经滤波的去卷积的FT图像的逆FT以产生校正了像差的EM[0035]该方法还可以包括使用最优去卷积系数和多个光学条件和多个协调的波束-图像移位的内核规范相关分析(KCCA)来确定为成像区域中的每个点预测像差的像差校正函数，线性函数)与观察到的相移和几何失真像差之间的KCCA元素。分析的结果是预测针对任何参数(例如，多个光学条件和协调的波束-图像移位)是独立变量并且它们可以被用于创建[0037]可以针对特定区域使用波束-图像移位方法收集数据来评估由该方法确定的当前校准检查网格样本具有与内部参考网格样本的一个或多个已知特性中的至少一个已知特征对应于校准检查网格样本的一个或多个已知特性的比较来确定像差校正函数的适用性。9自初始校准的输入可以被用于获得特定于实验的像差校正，然后这些结果可以被用于[0039]可以使用当前公开的方法校正的图像像差可以是影响图像的傅立叶变换的相位的方法。几何失真也称为角度失真和椭圆失真。该方法涉及基于原子参考(诸如石墨烯晶格)获得图像中几何失真的校准。该方法可以包括获得具有一个或多个已知特性的内部参考网格样本的多个EM图像，其中针对多个光学条件并针对多个协调的波束-图像移位获得其是那些能够形成可操作以接收具有适合用作根据当前公开的方法的内部参考网格样本[0042]该方法还可以包括通过对准和运动校正多个EM图像来校正多个EM图像的样本漂方法包括选择经过滤的EM显微照片的一部分并计算与该部分对应的FT图像以产生FT子图得可以确定衍射峰的子组的晶胞参数。然后失真矩阵(M)被确定并用于确定一个或多个晶胞参数是否与内部参考网格样本的结晶支撑体的已知晶胞维度一致。失真(M)矩阵包含对[0045]该方法还可以包括使用度量张量以及多个光学条件和多个协调的波束-图像移位格样本具有与内部参考网格样本的一个或多个已知特性中的至少一个已知特性不同的一网格样本的一个或多个已知特性的比较来确定像差校正[0046]图7描绘了根据本发明性构思的实施例的用于校正电子显微镜图像中的一个或多个图像或子图像确定像差校准。在720处使用失真校准和在750使用像差校准来执行KCCA。在725处解释KCCA分析的结果，并且如果在730处没有收敛，那么从步骤710开始重复该过可以对包含来自两条路径的信息的输入执行[0047]当前公开的方法比现有的用于校正像差的基于功率谱的真，然后用KCCA执行全局拟合以生成用于图像失真的校正的数据并促进显微镜的完全对分析了先前通过波束-图像移位方法收集并通过校准图像和相位失真然后对其进行校正而存储在EMPIAR数据库中的数据。因此，我们将蛋白酶体重构的分辨率从提高到对于在200kVTalosArctica上收集的数据，这一变化表示从平庸(按照今天的标位移并且因此彗差失真非常高的样本执行高分辨率重[0050]在cryo-EM单粒子重构中使用的明场(相位对比度)成像条件下，图像失真不会导在被认为对高分辨率工作相当具有挑战性条件下实现了非常高的分辨率(2.4A),如图3中所示，即，使用TalosArctica，无相位板，无能量滤波器，200kV，并且粒子尺寸为的仪器在较小的移位范围内用波束-图像移位方法收集的蛋白酶体数据。这个沉积物报告数据收集放大倍率下结合使用波束-图像移位方法时的不确定性拆分使我们能够将数据收用使用为此目的的中间放大倍率的当前协议在每个孔对中[0055]该方法包括光学失真映射和针对结构生物学实验者优化的实验控制的客户端-服四个的分辨率优于使用要求在数据收集之前进行全电子束校准的cryo-EM仪器。为了[0056]Cryo-EM中的吞吐量低效还来自于收集显微照片之间的长停滞时间以及来自对准[0057]Cryo-EM数据获取中的许多低效是由于预览图像在其剪辑(montage)中的不良对正方形内精确对准网格，我们使用波束-图像移位组，这样我们就可以获得精确的定位信快速网格搜索以稳健地建立它们的索引。我们导航的新颖方面是将位置不确定性拆分成[0060]数据收集在会话中执行，其中每个会话表示一个或多个网格正方形上的数据获[0061]图4描绘了根据本发明性构思的实施例的在预览图像之间的多步稳健导航以及用[0062]我们分析了传统收集的数据集和涉及二乘二孔正方形的有限范围、波束-图像移情况被反转，这导致传统获取的数据集的分辨率为2.5h,而在有限距离上应用波束-图像移位方法收集的数据集的分辨率为我们还实现了用于在整个会话期间监视长期样个放大倍率的数据获取会话具有相对高的稳定性，但我们的规程还检查漂移的过度累积，[0063]我们的目标是使跨不同放大倍率的位置导航足够精确，我们的CTF估计器应用于在碳上稀疏分布(～10到20)区域收集的数据并且针对显著不同的相互作用。我们将波束倾斜参数化为对相对于光轴和波束方向的位置具有螺旋扭曲依赖和其它具有高阶项的像差。在光轴之外，我们在我们的数据集之一中以及在蛋白酶体EMPIAR沉积物10185和10186中发现了显著的三叶形。我们通过基于参考的高质量样本(如脱铁铁蛋白)的细化来确定这种失真对与光轴的距离的依赖性。因为它们源于物镜的形状从数据收集中确定的CTF进行分析也可以被用于找出全局失真图及其潜在漂移。可以通过[0066]这种方法的结果包括收集预览图像的时间高效规程和放大倍数之间的精确导[0067]当前公开的方法的特征包括：分析更高阶轴向像差而不仅仅是五个“标准的”操作执行：(1)全局细化描述覆盖许多潜在的显微照片的整个成像场的像差的函数参数；(2)将针对整个成像场细化的参数传播到每个分离的显微照片并将非轴向像差[0068]当前公开的方法的其它特征包括：用内核规范相关方法细化复杂的非轴向像差基于有效、有限采样的断层扫描的网格的三维剪辑(使用样本倾斜来表征三维特性以准备析傅立叶变换空间中的信号调制和物镜孔径图像的形状。这种传统的校准方法会产生问另一个创新是我们在cryo-EM中使用高阶像差，从而使我们提高分辨率并启用倾斜波束的工业问题，诸如不会产生宏观(多微米)晶体的化学物质的绝对构型确定。提高分辨率是前数据分析软件无法处置的非平行波束照明来实现；Krios可以在平行模式下调整被照亮[0073]目前公开的方法中使用的校准步骤在其使用最大熵相关方法以及适合该方法的为它可以依靠相对少量的观察/校准数据点来恢复子提供透明和稳定的支持，并且晶体周期性用作高放大倍率处距离标度和角度失真(技术对于其相对距离被校准，就可以用作多个低倍放大倍率处放大倍率和失真校准的距离特应用波束-图像移位方法，那么放大倍率和椭圆失真确实会随着显微镜内位置的改变而改的结晶周期性优先在1A或更小的实际像素尺寸下执行。实际像素尺寸是指检测器的物理位置、波束倾斜等-分析图像的CTF-用Laguerre-Gauss函数提供实分量和分析图像的更高所有参数(像差)之间的非线性相关性-因此它提供了非常准确的局部轴向像差值的恢复。[0077]电子光学器件的设计固有地在波束-图像移位的可能范围内引起复杂的非轴向像收集之间和数据收集期间发生的较小改变，较大改变发生在显微镜组件机械重新对准之附加解释变量重复利用KCCA重复完全校微镜以用于稳定和时间相关(动态)分量–这在实践中是有用的和重要的，并且还可以应用由于大波束-图像移位引起的非轴向像差(使用波束-图像移位方法，但不处于我们的方法位置(孔)连续收集数据-在创建包含许多帧的非常长的电影方面是连续的，一部电影与几方法比仅依靠工作台倾斜的当前方法更快且更精确；(6)使得能够以成像模式从晶体中收义为粒子质心在z方向(波束方向)上与光学器件焦点的距离。对于大分子(显著大于200kDa)，散焦可以通过分别对每个粒子进行直接基于参考的细化来确定。对于较小的粒准电子显微镜，该网格提供方法兼容的信号和方法兼容的计算行为(例如，已知尺寸的原的像差的图案以导航(虽然校准整个可用的z高度范围并不总是实践当前公开的技术所需[0081]当前公开的方法可以应用于TEM显微镜的波束-图像移位方法和/或自动校准。目照片之间的连续推进(我们不会在一张显微照片期间推进它，但我们在显微照片之间进行射最大值等)，其中校准数据是在光学系统的多个但不是所有点(例如，数百个点)处收集同z高度而引起的焦点调整(我们通常校准由倾斜的样本的图像移位引起的z距离范围的像[0085]KCCA使用从单个显微