2021 轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法

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前言

本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《标准化工作导则第１部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ２７１）提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、西宁市蔬菜技术服务中心、

中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国乌鲁木齐海关。

本文件主要起草人：段维军、蔡磊、张慧丽、赵鹏、张晓梅、郭立新、刘芳、李雪莲、张永江、张小菊、

陈先锋。

Ⅰ

书

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轮枝菌属实时荧光犘犆犚检疫鉴定方法

１范围

本文件描述了植物病原真菌轮枝菌属实时荧光聚合酶链式反应（ＰＣＲ）检疫鉴定方法。

本文件适用于携带轮枝菌属病菌的土壤、植物及其产品中轮枝菌属病菌的检测筛查。

２规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于

本文件。

ＳＮ／Ｔ２５８９植物病原真菌检测规范

３术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

４基本信息

中文名：轮枝菌属。

学名：犞犲狉狋犻犮犻犾犾犻狌犿Ｎｅｅｓ。

轮枝菌属隶属于真菌界（Ｆｕｎｇｉ），子囊菌门（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ），盘菌亚门（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ），粪壳菌纲

（Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）中的小不整球壳科（Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）。

传播途径：轮枝菌属病菌主要由种子传播，也可经病残体、土壤、风、灌溉水和昆虫传播。

５鉴定原理

根据轮枝菌属病菌的ＤＮＡ序列特征及实时荧光ＰＣＲ原理，应用所设计引物或探针对轮枝菌属病

菌进行检测鉴定。

６仪器设备和器具、试剂和培养基

６．１仪器设备和器具

高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、水浴锅、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、微量紫外分光光度计、高

速冷冻离心机、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光ＰＣＲ仪、微量移液器（０．１μＬ～２．５μＬ、

１μＬ～１０μＬ、１０μＬ～５０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ）、锥形瓶、培养皿、载玻片、盖玻片。

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６．２试剂

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

次氯酸钠、液氮、超纯水、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）提取液（２％ＣＴＡＢ，１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，

２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌｐＨ８．０）、Ｔｒｉｓ饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、７０％乙

醇、核糖核酸（ＲＮＡ）酶、ＰＣＲ反应试剂：２×犜犪狇ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ。

６．３培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）：将２００ｇ马铃薯去皮，切小块，沸水煮２０ｍｉｎ后过滤，弃去滤渣，

在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各２０ｇ，加蒸馏水定容至１Ｌ。配成溶液后１２１℃下灭菌２０ｍｉｎ。

７检疫鉴定

７．１样品的采集与处理

样品的采集、分离、纯化和培养按照ＳＮ／Ｔ２５８９植物病原真菌检疫鉴定方法进行。

７．２核酸的制备

采用基因组提取试剂盒制备ＤＮＡ，或采用改良的ＣＴＡＢ提取法，ＣＴＡＢ提取法应符合附录Ａ。

７．３犇犖犃纯度与浓度的测定

用微量紫外分光光度计测定ＤＮＡ的纯度与浓度，分别取得２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值，计算核

酸的纯度和浓度，计算公式如下：

ＤＮＡ纯度＝ＯＤ２６０／ＯＤ２８０

ＤＮＡ浓度＝５０×ＯＤ２６０μｇ／ｍＬ

用于实时荧光ＰＣＲ检测的ＤＮＡ溶液的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值应为１．７～１．９。

７．４实时荧光犘犆犚检测

实时荧光ＰＣＲ检测方法应符合附录Ｂ。

８结果判定

以疑似分离物或样品的实时荧光ＰＣＲ检测结果作为鉴定依据。

疑似分离物：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线判定为阳性；无典型扩增曲线判定为

阴性。

样品检测：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线，且Ｃｔ值≤３５，判定为阳性；３５≤Ｃｔ值≤４０，

增加ＤＮＡ用量２倍～１０倍再次测试，出现典型扩增曲线，且Ｃｔ值≤３５，判定为阳性；其余情况判定为

阴性。

９样品保存与复核

９．１样品保存与结果记录

保存植物样品应置于２℃～８℃冰箱妥善保存，对检出轮枝菌属病菌的样品应至少保存６个月，以

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备复检、谈判和仲裁。

分离到的轮枝菌属病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）中妥善保存。

样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员的签字。实时荧光ＰＣＲ

要有检测阳性结果照片。

９．２复核

由指定的单位或人员负责，主要考察试验原始数据记录及实时荧光ＰＣＲ检测结果等资料的完整性

和真实性，必要时进行复核试验。

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附录犃

（规范性）

犇犖犃提取方法

犃．１收集培养分离得到的菌丝或植物组织样品，放入浸在液氮里的１．５ｍＬ离心管，用无菌塑料杵迅速

碾碎。

犃．２加入６００μＬ６５℃预热的ＣＴＡＢ抽提液，颠倒混匀后于６５℃水浴锅０．５ｈ～１ｈ。

犃．３冷却至室温后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液至另一离心管中。

犃．４加入１／２体积（３００μＬ）的Ｔｒｉｓ饱和酚及１／２体积（３００μＬ）的三氯甲烷∶异戊醇（２４∶１），颠倒混

匀后静置至其开始分层。

犃．５１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液至另一离心管中。

犃．６可重复Ａ．４至Ａ．５步骤２次～３次，视两相界面处杂质的多少而定。

犃．７加入等体积三氯甲烷∶异戊醇（２４∶１），轻轻颠倒混匀。

犃．８１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液至另一离心管中。

犃．９向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于４℃或－２０℃冰箱沉淀１ｈ。

犃．１０１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清液，加５００μＬ７０％乙醇悬浮沉淀。

犃．１１１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，室温干燥。

犃．１２加５０μＬ无菌水或ＴＥ缓冲液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ，１ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡｐＨ８．０）溶解沉淀，

－２０℃冰箱贮存备用。

注：ＤＮＡ提取亦可采用商品化ＤＮＡ提取试剂盒。

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附录犅

（规范性）

实时荧光犘犆犚方法

犅．１引物及探针序列

正向引物ＶＦ：５′ＣＴＧＴＣＣＧＡＧＣＧＴＣＧＴＴＴＣＡ３′；

反向引物ＶＲ：５′ＣＣＡＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＧＧＧＣＣＴＡＣＡ３′；

探针ＶＰ：５′ＦＡＭＴＧＧＣＣＣＧＧＴＧＴＴＧＧＭＧＢ３′，探针５′端含有ＦＡＭ报告荧光染料，３′端含有

不发荧光的淬灭基团并具有ＭＧＢ分子。

犅．２扩增体系

ＰＣＲ扩增反应体系为：２×犜犪狇ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１２．５μＬ、引物ＶＦ／ＶＲ各０．４μｍｏｌ／Ｌ、

探针ＶＰ０．２μｍｏｌ／Ｌ。反应总体积为２５μＬ。将反应体系混合均匀后置于荧光ＰＣＲ仪中进行反应。

以轮枝菌属病菌ＤＮＡ作阳性对照、不含轮枝菌属病菌的ＤＮＡ作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白

对照，每个样品设置３个重复。

犅．３扩增反应条件

扩增反应条件为：９５℃１０ｍｉｎ；然后９４℃１５ｓ，６０℃６０ｓ，共４０个循环。

注：ＤＮＡ模板的取量根据ＤＮＡ的提取浓度纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。

５

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参考文献

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