菌种管理规程

菌种管理规程1.目的

本规程用于规范微生物实验室菌种的购买、保存、复活、鉴定、传代、使用、销毁等，确保实验结果的准确和检测人员的安全。规范微生物实验室对标准菌株的管理。

2.范围品质部微生物实验室使用的各种菌种。3.职责品质部负责本规程的起草；品质部主管负责审核此规程；品质部负责人负责批准此规程。4.依据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》《中国药典》现行版5.定义标准菌种：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。或使用国际认可的权威菌种储存机构菌种，管理按本实验室规程管理。商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株，包括非0代的定量或定性菌株。标准储备菌种：由标准菌株（第0代）经复活、传代得到的第二代菌种。工作菌种：由标准储备菌种转种传代得到的培养物。传代：从菌种保藏机构获得的标准菌株（冻干粉）为第0代，从标准菌株（冻干粉）复溶并转至液体培养基生长或将复活的菌种接种于培养基上即为传代。任何亚培养的形式均被认为是传代一次。6.程序6.1标准菌株的来源、分类与用途标准菌株来源：中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC）；常用标准菌株的分类：序号菌株名称菌株编号菌株来源需氧菌（Aerobicbacteria）1金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC（B）26003CMCC2大肠埃希氏菌EscherichiacoliCMCC（B）44102CMCC3铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaCMCC（B）10104CMCC4枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCMCC（B）63501CMCC厌氧菌（Anaerobicbacterium）5生孢梭菌ClostridiumsporogenesCMCC（B）64941CMCC真菌（Fungi）6白色念珠菌CandidaalbicansCMCC（F）98001CMCC7黑曲霉AspergillusnigerCMCC（F）98003CMCC标准菌株用途：标准菌株被用于微生物实验室的微生物限度检查法、设备和工艺相关的微生物挑战性验证、微生物检验方法学的验证、培养基适用性实验、日常样品检验的阳性对照试验等。6.2标准菌株申购、接收、使用及销毁：申购：为保证实验室检验工作的正常进行，由微生物实验室提出需求，QC人员根据使用需要申购相应种类的标准菌株，采购单中应详细列出需采购的标准菌株名称、数量、用途等详细信息，经品质部负责人批准后，由采购部按公司采购程序执行。接收：菌种购回时由微生物实验室负责验收，验收项目至少包括：菌种的原厂批号、数量、菌种名称、系列号（代号）、来源、说明书、包装的完整性等，如果有MSDS（化学品安全技术说明书）的，要求生产厂家或代理商提供，并于现场存放以供查阅。验收合格入库后才能领用，验收合格的菌种登记原厂批号，每支菌种都应贴

《菌种标签》，存放入2℃-8℃药品保存箱中或厂家说明书上规定的存放条件，并填写《标准菌株接收、领用记录》，验收不合格的不予接收。使用：以0代冻干粉保藏的，需做菌种复活，并填写《标准菌株接收、领用记录》或《标准菌株复活记录》。在有资质的供应商购买的2代冻干粉，复活传代后可直接使用。冻干粉开瓶操作：安瓿管轻轻拍打安瓿管，使冻干粉菌种都落在管底部，再用75%酒精棉球擦拭安瓿管，将安瓿管封口一端在火焰上烧热，滴一滴无菌水至烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉安瓿管封口端的玻璃。或先用75%酒精棉球擦拭安瓿，用砂轮在安瓿颈部划痕，用干燥的无菌纱布包裹安瓿，将安瓿颈部掰断。或用其他无菌操作的方式打开安瓿管。西林瓶轻轻拍打西林瓶，使冻干粉菌种都落在西林瓶底部，再用75%乙醇消毒西林瓶表面。用干燥的无菌纱布（棉布）包裹瓶盖，掰开西林瓶盖子，或用其他无菌操作的方式打开西林瓶。其他包装方式的冻干粉参考产品要求说明操作，或采用适当的无菌方式打开包装。用无菌吸管吸取0.5-1ml的液体培养基（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、用胰酪大豆胨液体培养基。生孢梭菌用硫乙醇酸盐液体培养基。白色念珠菌用萨布罗葡萄糖液体培养基。）滴加到冻干粉容器中，轻轻旋转并吹打使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解成菌悬液。黑曲霉液体管按无菌操作要求，用无菌吸管轻轻吹吸管内液体使均匀形成菌悬液。再将容器内的菌悬液用无菌滴管吸出，转移至2支含4-5ml对应液体培养基或划线于固体培养基中。具体见下表：（或按照菌种说明书上的方法进行复活）菌种名称培养基培养的温度(℃)/时间(h)大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养基（TSB）胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）30-35℃/18-24h生孢梭菌液体硫乙醇酸盐培养基（FTM）哥伦比亚琼脂培养基（COA）30-35℃/18-24h白色念珠菌黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）20-25℃/5-7d逐天观察，如果液体培养基浑浊或固体培养基有菌落生长说明菌种复活（第1代）。若无浑浊或菌落生长，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细菌应至少培养72h以上，真菌和酵母菌至少应培养2周以上，并在丢弃之前应高温灭活处理；其他菌复活方式参照药典相关规定。将复活成功的菌悬液或平板菌落划线于适宜的培养基试管或平板上（传下一代），所用培养基及培养条件如下表：菌种名称培养基培养的温度(℃)/时间(h)大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌大豆酪蛋白消化琼脂30-35℃/18-24h生孢梭菌哥伦比亚琼脂液体硫乙醇酸盐30-35℃/5-7d（厌氧环境培养）白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂20-25℃/2-3d黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂20-25℃/5-7d或培养至获得丰富的孢子在规定时间内菌种生长不明显或生长状态不好的，可能是因为菌种从休眠期转移至培养基后活性不足，迟缓期变长，可适当的延长菌种的培养时间，再按后续操作要求进行传代。生孢梭菌厌氧培养时为了避免厌氧袋厌氧不足，菌种斜面与平板应分开包装培养。若所购买的菌株为商业派生定性菌株，则按照厂家说明书上的使用方法对其进行传代使用，菌株使用代数不得超过5代。菌种鉴定：采用第0代进行传代的，在第2代菌株培养时间到后，对培养的菌株进行初步鉴定，操作按《微生物鉴定标准操作规程》进行，应与对应的标准菌株符合。如果鉴别结果显示为其它菌种，则表明原来的菌种可能发生变异或受到污染，实验过程中出现污染或异常的菌种不再保存，按《纠正和预防措施控制程序》进行偏差调查以确定异常的原因，再进行灭活处理。制备甘油冷冻管：通过接种环将菌种（其中黑曲霉、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌用孢子保存，黑曲霉、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌需要用适宜的缓冲液冲洗斜面孢子）接种于含适量无菌水的冷冻管中，再加入等体积的无菌甘油（20%浓度）摇匀，作为标准储备菌种，于≤-30℃超低温冰箱保存。不同的菌种不得放在同一个容器上保存。菌种传代编号：菌种批号由“菌名英文名缩写xx－传代代数x－制备日期xxxxxx－序号xx”组成，如“BS-3-160613-02”表示枯草芽胞杆菌第三代第二支，传代日期为2016年06月13日。容器中每支菌种都应贴《菌种标签》。每次传代应填写《标准菌株传代、使用及销毁记录》，鉴别时按《微生物鉴定标准操作规程》规定操作。传代周期及保存：冻干粉：保存在2℃-8℃药品保存箱中，可在五年内使用，或者按照菌种说明书要求储藏和使用。标准储备菌种，采用甘油冷冻管法保存（≤-30℃），可在三年内使用，甘油冷冻管解冻后一次使用，不得复冻。从标准储备菌种或者由商业派生菌株传代得到的工作菌种（第3代菌、第4代菌种），传代后于2℃-8℃药品保存箱保存，有芽孢的杆菌和真菌为三个月，其它细菌为一个月（可根据效期考察而定）。铜绿假单胞菌的工作菌种在药品保存箱和超低温冰箱中易发生菌体自溶而死亡，可用琼脂培养基管室温保存。铜绿假单胞菌的标准储备菌种放≤-30℃保存，浓菌液及冻干粉于2℃-8℃药品保存箱存。菌悬液的制备：取出制备好的菌种试管或平板（第2代及以后且不超过4代），使用接种环取菌落划线于适宜的培养基中置相应的温度下培养一定的时间进行增菌，所用培养基和培养时间及温度如下：序号菌株名称培养基名称培养温度/时间1金黄色葡萄球菌大肠埃希氏菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨琼脂平板30-35℃/18-24h5生孢梭菌哥伦比亚琼脂培养基30-35℃/24-48h厌氧硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃/18-24h6黑曲霉沙氏葡萄糖糖琼脂平板20-25℃/5-7天7白色念珠菌沙氏葡萄糖糖琼脂平板20-25℃/2-3天取菌株培养物加入5mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液进行洗脱；其中黑曲霉用3-5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，液体培养物直接吸取，取适量洗脱液或培养物转移到麦氏比浊管中，加入稀释液稀释，每次稀释时用漩涡混合器震荡30秒混合均匀，将麦氏比浊管放入麦氏比浊仪中检测其浓度（也可用比浊法），然后加稀释液十倍稀释至适宜浓度。每次制备菌悬液需要对制备好的菌悬液进行计数，并填写菌悬液计数记录（如检验记录中设置有菌悬液计数结果项，则可将计数结果填写在检验记录中，不再重新填写《菌悬液计数记录》。菌悬液计数操作：把稀释到适宜浓度的菌悬液1ml加到直径90mm的平皿中，然后加入相应的15-20ml已融化的的温度不超过45℃的培养基，待凝固后倒置于一定条件下的生化培养箱中培养相应的时间，同时制备一个阴性对照。所采用的培养基类型和相对应的培养条件如下表：菌种培养基培养条件大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）30～35℃/小于3天生孢梭菌哥伦比亚琼脂培养基（COA）30～35℃/（厌氧）小于3天白色念珠菌黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）20～25℃/小于5天工作用菌悬液应现配现用，若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2-8℃，可在24小时内使用，黑曲霉的孢子菌悬液可保存在2-8℃，在一周内使用。销毁：过期的菌种和浓菌液以及使用过的菌种和使用过的菌种培养物均应该通过高压蒸汽灭菌