以大体积脑组织（人）冰冻切片为例蔗糖梯度脱水如何减少空泡、碎裂、冰晶

以大体积脑组织（人）冰冻切片为例，蔗糖梯度脱水如何减少空泡、碎裂、冰晶？脑组织的体积从啮齿类的1cm3到人脑的1500cm3，冰冻切片会出现一系列问题：冷冻不均匀、组织开裂、出现空泡、产生冷冻伪影等等。常规的干冰、异戊烷、液氮等方法能实现啮齿类、小型灵长类动物脑组织的冷冻，但在大体积脑组织难形成标准化操作。组织体积越大，冰冻耗时越长，形成冰晶造成组织损伤的可能就越大。对整个脑组织进行冷冻和染色？！这篇文章的作者也真够敢想的。文章以羊脑为实验对象，并用优化的冷冻切片方案分析了一例人类脑组织标本。该人脑标本的尸检及脑组织取材操作严格遵循《赫尔辛基宣言》，并在取得患者直系亲属正式知情同意后开展，实验方案已通过相关伦理委员会审批。一、搭建整脑组织冰冻平台研究人员搭建专用的技术平台，主要包括与脑组织尺寸匹配的定型母模、铜质底座模具、冷冻体系及温度实时监测系统。这套平台可以实现大体积完整脑组织均匀冷冻，减少冰晶伪影。脑组织定型母模通过颅脑磁共振成像（MRI）及离体脑组织三维表面扫描获取建模数据，用金属3D打印加工成型。包埋介质能够复刻脑组织外形凹槽，将整个脑组织放入模具后实现切片的精准定位。研究人员定制了多种规格的铜制模具，用于脑组织和包埋剂的盛放。铜具有良好的导热系数且不会变形，可拆卸底板方便取出含有组织样品的冷冻包埋块。冷冻体系主体是不锈钢容器，用于盛放异戊烷。将其置于泡沫保温箱内，四周填充干冰，温度可降至-80℃。冰冻过程会实时监测冷源温度，测温传感器精度可达±0.25℃。大体积组织冰冻技术平台（源自文献：Atechnologyplatformforstandardizedcryoprotectionandfreezingoflarge-volumebraintissuesforhigh-resolutionhistology）二、脑组织固定与脱水处理对大体积组织标本进行冰冻切片前，建议进行固定。本次研究使用溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PB）的4%多聚甲醛（PFA）完成固定。山羊脑组织分离取出后，放入PFA固定液中浸泡两周。固定后采用蔗糖梯度溶液对脑组织进行脱水处理。蔗糖溶液的浓度依次为：含4%PFA的10%蔗糖溶液、溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液的20%与30%蔗糖溶液。每一梯度蔗糖脱水的终点判定标准是标本完全沉底，组织内外渗透压达到平衡。三、整脑组织冷冻操作流程研究人员先制备了冷冻模具。在装有干冰的泡沫保温箱中放入装有异戊烷的不锈钢容器，并将温度感应器固定好。向异戊烷中加入干冰使其温度降至-80℃。异戊烷在降至目标温度时会出现沸腾现象，溢出并流入模具。为降低风险，要测算容器内异戊烷的量。注：这一步是整个实验设计的败笔。干冰是不能加到异戊烷中的。正如文中所说，两者直接接触会瞬间气化产生飞溅，一不小心就会冻伤皮肤。并且异戊烷属于易燃有机溶剂，飞溅后遇静电、热源有可能引发火情。建议先在泡沫箱底部铺上干冰，然后将装有异戊烷的不锈钢烧杯置于其上。烧杯用镊子或铁架台固定。持续在烧杯周围填充碎干冰。静置降温5-10min，异戊烷会出现轻微粘稠、表层结薄霜的状态，这时温度能达到-80℃。将脑组织定型母模与铜质底座模具组装，沿定型母模四周加入OCT包埋剂。包埋剂高度至母模总高度的95%。操作过程要小心，不能产生气泡，也要避免包埋剂流入定型母模内部型腔。等异戊烷温度降至-80℃，将添加包埋剂的模具置于容器中央进行冷冻。待包埋剂完全冰冻后，将模具取出。使用热风枪轻微加热定型母模，使其与包埋剂分离，在包埋剂内部形成与脑部表面形态匹配的阴模型腔。将脑组织小心的从蔗糖溶液中取出，放至模具新成型的阴模型腔中。操作过程中脑组织不能触碰到模具内壁。先在脑组织表面涂一层包埋剂，避免其产生剧烈的温度差，然后注满包埋剂。将模具放入异戊烷容器中进行冷冻。完全冻结的包埋剂为不透明白色。取出模具后先拆下底板，再从冷冻块顶部轻推，将脑组织冷冻包埋块完整脱出模具。对包埋块进行标记后，将其移植-80℃冰箱至少保存24小时，使组织整体冻透。整体脑组织冷冻切片操作步骤（源自文献：Atechnologyplatformforstandardizedcryoprotectionandfreezingoflarge-volumebraintissuesforhigh-resolutionhistology）四、冰冻切片染色验证这一优化实验方案用于一例成年人大脑标本检测。样本整体为150×110×42mm，经过蔗糖梯度脱水法处理后进行异戊烷-干冰冷冻，获得796cm3的包埋块。研究人员使用大型冷冻切片机获得大尺寸（6英寸×8英寸）、厚度20μm的切片，进行Nissl和HE染色。Nissl染色即尼氏染色，用于标记神经元形态和尼氏小体，是神经组织形态学观察常用技术。本研究选择额叶皮层、背侧皮层、枕叶皮层等多处脑组织区域进行组织学检测，结果显示结构完整。高倍镜下神经元轮廓清晰、各类脑细胞形态完整，没有明显的组织损伤。源自文献：Atechnologyplatformforstandardizedcryoprotectionandfreezingoflarge-volumebraintissuesforhigh-resolutionhistology五、蔗糖梯度脱水的保护作用本文还以蔗糖梯度溶液和甘油联合二甲基亚砜（DMSO）混合液为冷冻保护液，对冰冻切片的防冻保护进行了研究。样品均采用平衡梯度法，蔗糖溶液依次为多聚甲醛配制的10%蔗糖溶液、0.01mol/L磷酸盐缓冲液配制的20%与30%蔗糖溶液。DMSO梯度液分别为含2%DMSO的10%、20%甘油溶液。每一梯度均需组织完全沉降值容器底部后，再转入更高浓度的溶液中。山羊整脑的蔗糖梯度脱水约需12天，DMSO约6天。Nissl染色结果显示，蔗糖处理的大脑皮层切片染色均匀，没有冷冻伪影。高倍镜下神经元染色清晰、形态保存完好，而甘油-DMSO处理的脑组织易破裂，高倍镜下细胞出现渗透压损伤，可见微小裂缝。上半部为蔗糖梯度处理，下半部为甘油-DMSO处理（源自文献）冰冻切片蔗糖梯度脱水小结结合上文内容，我们对蔗糖梯度脱水的应用进行一下总结。这里所说的“脱水”，不是石蜡切片中的酒精脱水。蔗糖脱水的目的是对组织进行抗冻保护。10%、20%、30%梯度处理，能够防止局部收缩、边缘皱缩或组织结构不均一。哪些组织样本需要进行蔗糖梯度处理呢？经过甲醛或福尔马林固定的组织需要蔗糖脱水处理。脑和脊髓的神经组织脂质含量多，建议先